分子流行病学在疾病预防控制中的应用

结核杆菌DNA指纹图谱有助于基因分型
流行病学常用 结核杆菌基因 分型方法
IS6110-RFLP Spoligotyping MIRU-VNTR
• Bauer等对丹麦1549株结核菌进行IS6110为 基础的DNA指纹分析，成簇率49%。同样 方法检测格陵兰岛成簇率为79%。
J Clin Microbiol,1998
time-of-flight (MALDI) mass spectrometry Dynamic allele-specific hybridization (DASH) DNA-chip analysis DHPLC
illumina 高通量基因分型平台
7900 RealTime PCR SNPstream基因分型系统

低危险易感基因（低共显基因）
相关性研究（association！） 如代谢酶基因（I相、II相） DNA修复基因 细胞周期调节基因等
1a, 1b 2a, 2b, 2c, 3a
4 4 1a, 1b, 2b, 3a 5a 1b, 3a
2a
1b 1b, 6 3b 1b, 3a
Clinical Microbiology Reviews, 2000, 13(2) 223-235
SARS病毒来源及变异分析
如SARS 在广东流行可分三个阶段: 早期由病人分离到的SARS 病毒与果子 狸分离到的SARS 病毒高度同源,因此 怀疑SARS 是一种动物来源的疾病。 中期SARS 病毒分子结构稳定, 病毒传 播力强, 超级传播事件发生多。 后期SARS 病毒碱基缺失可达几百个， 病毒的传播力大大减少。
Accessible Genome and Genetic Variation database
分子流行病学在疾病预防和控制中的应用 （一）病因的探讨及病因致病机制的研究
1、传染病病因及流行规律的探讨 研究已知或新发传染病的病原体和流行特点 病原学诊断（基因诊断）、基因分型 研究分布特点，传染源追踪和传播途径确定 观察病原体在体内持续时间和消长规律
TaqMan OpenArray
TaqMan OpenArray Genotyping Plates
MassARRAY
Integrated Components
Automated Liquid Handler SpectroPREPTM
MALDI-TOF Mass Spectrometer SpectroREADERTM Miniaturized Biochip SpectroCHIPTM
分子流行病学进展及其在疾病 预防控制中的应用
分子流行病学的定义
（Molecular Epidemiology）
• 分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关生物标 志（或分子事件）在人群和生物群体中的分布及 其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略 与措施的科学。 • 应用先进的技术测量生物学标志的分布情况，结 合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐 明疾病的病因及其相关的致病过程。
酶学技术
包括定性和定量检测，要求一定的 条件。 多位点酶电泳（multilocus enzyme electrophoresis, MEE） 法。
免疫学技术：
酶联免疫吸附试验（ELISA）、 荧光免疫试验（FIA）、放射免疫 试验（RIA）、免疫细胞化学检测 （ICC）等；
蛋白质技术
蛋白质分离鉴定技术主要有：电 泳、凝胶电泳、蛋白质转印杂交 （Western blot）、色谱分析、 蛋白质测序等。
Beijing家族结核菌株在全球的分布
不明原因疾病爆发调查
• 江苏省北部地区(苏北) 在2003年1-7月爆发了较 大规模的无菌性脑膜炎, 涉及范围之广、发病人 数之多,在国内较少见。
疾病暴发原因分析
• 问卷调查收集基本资料 • 血清学检测 • 病原体分离培养
• Echo30 型肠 道病毒感染
Human Genome Project HapMap Project
分子流行病学的特点
• 与传统流行病学不同
– 研究的水平不同 – 所解决的问题不同
• 分支
– 肿瘤分子流行病学 – 传染病分子流行病学 – ……
• 与分子生物学的区别
– 研究对象不同（人群） – 研究内容和方向不同（强调与 宏观暴露的关系） – 研究方法不同（流行病学思维 和方法）
上海预防医学杂志2005
传染病传播途径分析
案例：1990年7月，美国佛罗里达州一名AIDS妇女， 怀疑在当地一牙科诊所手术时感染了HIV，因为该 诊所的牙科医生也是一名AIDS患者。随后当地卫 生部门对该牙医诊治过的一千余名患者进行HIV检 测，共发现7名HIV感染者有在该诊所的就诊史。
那么这7名HIV感染者是否与该牙医有关呢？
What is a SNP? 基因多态性 A mutation in the DNA sequence with a frequency of >1%
单核苷酸多态与个体疾病易感性差异
研究问题 1:
为何只有少于 20%的吸烟者发生肺癌（一生中）?
Genetic susceptibility? Exposure
（二）疾病易感性的测定
（传染病和非传染病） 例：恶性肿瘤的形成过程及其影响因素 活化 解毒 损伤 修复 增生 凋亡
前致 癌物
终致 癌物
DNA 损伤
基因 突变
癌前 病变
恶性 肿瘤
遗传易感性因素
测定疾病易感性，可以进行高风险人群筛选，采取 更有效的预防和控制措施

高危险易感基因（高外显性） 连锁研究(linkage!) 如BRCA1、BRCA2与乳腺癌（40-80％） 一般人群中频率<1％，RR和AR高，PAR较低！
Collins et al., Nature, 2003
分子流行病学常用技术及方法
核酸技术（DNA & RNA）
核酸体外扩增 （PCR） 核酸电泳图谱 核酸酶切电泳图谱 （RFLP） 扩增片断长度多态性（AFLP） 核酸分子杂交 有原位杂交、斑 点杂交、转印杂交（包括 Southern blot检测DNA和 Northern blot检测RNA）等。 核酸序列分析
一、暴露标志（exposure marker）
（一）外暴露标志 主要指环境因素暴露，包括生物性因素和非生物性因素 1、生物性病原因子的鉴定 2、病原生物进化变异规律（进化树） 3、环境化学污染物（非生物因素）暴露 （二）内暴露标志 1、传染性疾病： 感染状况、抗原抗体检测、病原体基因监测 2、慢性非传染性疾病 内暴露剂量、 生物效应剂量
病原体基因分型
丙型肝炎病毒基因分型
不同基因型HCV，
其临床表现以及对抗 病毒治疗的敏感程度 有显著差异。
1b型对干扰素治疗
的持续应答率为20%， 而非1b型对干扰素治 疗的持续应答率可达 60-70%。
Simmonds双等级基因命名系统
HCV 1b型是我国主要流行型
1a, 1b 2a, 2b, 3a

Response
NSCLC
SNPs & Chemosensitivity
从科学研究
临床实践
Human Genome Project
Biology SNPs Response Disease
Prevention
SNPS=Single Nucleotide Polymorphisms
人类基因组计划
Science 1992
针对这一问题可采取的分析方法： 1、传统流行病学分析方法：接触者调查，分析感
染者可能的危险行为如输血、静脉吸毒、不安全
性行为等。
2、分子流行病学方法：比较HIV病毒基因序列的
差异，分析不同病例感染株遗传关系的远近。
Science 1992
与牙医感染株的遗 传变异性比较
与对照感染株的遗 传变异性比较
环境暴露物质
诱变化学物
生物材料
白细胞 白细胞 上皮
HGPRT*
胸苷激酶 癌基因激活 原嘌呤比例升高 乙酰胆碱脂酶降低 化学致癌原[苯并（a）芘] 铅 有机磷杀虫剂
白细胞
白细胞 组织 红细胞 血浆
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三、易感性标志（环境-基因）
（一）遗传性疾病 HNPCC, BRCA1/2 （二）慢性病（易感性分子标志物） DNA修复通路（肺癌、肠癌） 代谢酶系统（膀胱癌） （三）传染病 免疫系统（HLA） 炎症通路
二、效应标志（effect marker）
传染病 酶学的改变，血液生化（免疫）指标的变化 病原体基因的整合
慢性非传染性疾病（危险性预测）
主要是基因毒性标志物，包括癌基因激活、 点突变和染色体异常
基因表达异常和代谢异常
基因突变或染色体畸变
生物学效应标志
生物学标志
染色体 畸变 姊妹染色体单体交换 微核（micronuci） 点突变 诱变化学物
• 均为Echo30型肠道病毒。进 化树分析显示分离株与国外 1999年和2000年分离株的亲 缘关系最近；但自成一簇， 与国外毒株存在地区差别。
• 病毒序列测定 和比对
2、非传染病的病因及病因致病机制的研究
例：HBV感染与肝癌（基因组整合）
EBV感染与鼻咽癌
HPV感染（致癌型）与宫颈癌
HP感染与胃癌
进化树分析
牙医及病人 A,B,C,E,G
当地对照 病人F
病人D
揭示传染病传播机制
• 以结核为例：与结核病人密切接触，感染和发病的 危险增加。这些接触者与源病例之间，是否产生了 结核分枝杆菌的传播？ • 开展结核病成“簇”性研究，可以从分子角度解答 这样的问题。
• 成簇的过程就是用聚类分析对分离株的基因进行分 型或分群的过程，可以分析结核病的传染源和传播 途径。
前瞻性研究 传统流行病学
暴露
？
回顾性研究
疾病
分子流行病学
暴露
疾病
传统流行病学与分子流行病学的关系（EDC模型） （Schulte,1993）
分子流行病学？
Gene discovery & Characterization SNPs Haplotypes Medical Practice
etiology diagnosis treatment prevention
色谱（质谱）技术：
高效液相色谱技术HPLC）、液相 蛋白色谱技术（FPLC）等。
单核苷酸多态性（SNP）检测技术
PCR-RFLP
PCR-SSCP, PCR-based resequencing Real-time PCR
Matrix-assisted laser desorption/ionization
CIR by 70 yrs M: 15.9%
Cancer
SNPs？
F: 9.5%
(Peto, BMJ, 2000)
Cancer-free
Screening, prevention
基因检测危险度评价
研究问题 2:
为何有的病人对化疗药物有效而另一些病人则无效 ?
SNPs？
Chemotherapy
No response
宿主易感性标志（非传染病）
生物学标志* α1抗胰蛋白酶 N-乙酰基转移酶 芳香烃羟化酶 暴露 吸烟 芳香胺 吸烟 疾病 肺气肿 膀胱癌 肺癌
传染病
• 慢性丙肝病人中，HLA-B44出现频率高达30%以上 • 对白喉毒素敏感的基因定位在5号染色体长臂 • 对脊髓灰质炎病毒敏感性基因定位在19号染色体长臂
宏观与微观相结合！
分子流行病学的发展趋势
• 研究手段越来越多,技术越来越成熟
• 研究内容(生物标志物)越来越丰富
• 应用范围越来越广（病因、危险度评估、 早期诊断、个体化治疗）
分子流行病学的主要研究内容：生物标志
生物标志（biological markers, biomarkers）是可以测量的、能代表生物结 构和功能的大分子物质，如DNA、RNA (miRNA)或抗原、抗体、蛋白质（酶）等。
Nanoliter Dispenser SpectroJETTM Automated Analysis SpectroTYPERTM
核酸分子杂交
蛋白质检测鉴定系统
SDS-PAGE
酶联免疫吸附试验（ELISA）
高效液相色谱(HPLC, LC/MS/MS)
Affordable Highthroughput Platform Service
体内剂量标志
生物学标志 可替咛（Cotinine） 铅 黄曲霉素 1-羟基芘 环境暴露物质 香烟中的尼古丁 环境中的铅 食物原料 多环芳烃(PAHs) 生物材料 体液 体液和组织（发、指甲、牙齿） 体液 尿液
生物有效剂量标志
生物学标志 DNA加合物 蛋白质加合物 （血红蛋白） 环境暴露物质 苯并（a）芘、 亚硝胺 环氧乙烯 生物材料 白细胞 红细胞