生化实验 设计试验PAGE

（⑶电位梯度的不连续性。电位梯度的高低与电泳速度
的快慢有关（）,迁移率低的离子在高电位梯度中可以与迁
移率高而处于低电位梯度的离子具有相应的速度（即高慢
生 低快）,电泳开始后,由于快离子迁移率最大,就会很快超过
物 化
蛋白质,因此在快离子后面形成一个离子浓度低的区域,即低 电导区,电场强度与电导成反比关系：η,式中为电场强度为 电流强度,η为电导率与电导率成反比，所以低电导区就有
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试剂
、盐酸
生 物、
化 、过硫酸铵
学Hale Waihona Puke Baidu
、盐酸
实、
验 、蔗糖
、电极缓冲液 克；甘氨酸 克；加水到用时稀释倍
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实验步骤
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生
一、样品的提取
物
化
学
二、电泳
实
验
三.结果分析
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（一）、样品的提取
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生 一、过氧化物同功酶的提取
物 .准确称取新鲜材料，加入 提取缓冲液（）和 化 少许石英砂，研磨成匀浆。 学 离心,上清液为可溶性蛋白和同工酶的粗提液。 实 .取上清液，分别加入蔗糖和溴酚蓝。
学 （）将带有凹槽的玻璃放在凝胶模高一点的孔中，另一平板
实
放于凝胶模有底槽的一边. （）将已插好玻板的凝胶模夹到贮槽中（使略低的玻板一侧
验 靠近负极），然后双手以对角线的方式旋紧螺丝帽.
（）倾斜电泳槽，用滴管吸取少量的 琼脂糖溶液，封好凝胶
模板底边和侧边
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.分离胶的配制：
将贮液（除过硫酸铵外）按比例混合成工作液，按比例迅速
物 清蛋白。进入同一孔径的小孔胶时, 蛋白分子量小且为球形
化 的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面；反之阻力大,移
学
动慢,走在后面,从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分 成各自的区带。
实
.电荷效应 进入的分离胶中,各种蛋白所带净电荷不同,而
验 有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快；反之则慢。因此各
对样品没有分子筛作用。
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.分子筛效应: 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通
过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移
率,这就是分子筛效应。蛋白质进入的同一孔径的分离胶后。
生
此时,高电压消失,在均一的电压梯度下,由于甘氨酸解离度增 加，加之其分子量小,其有效泳动率增加,赶上并超过各种血
生
生物化学实验
物 化
设计试验
学 实
主讲：刘连芬
验
聊城生命科学学院
：
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相关知识背景
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ , ）是以聚丙烯酰胺为支持介
生 质的电泳。聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（. ）和交联
物 剂, ’甲叉双丙烯酰胺（, ）在催化剂过硫酸铵（()简称）
化
或核黄素(即 )和加速剂, , ’, ’四甲基乙二胺(’’ , 简 称)的作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
浓缩成层，因而具有良好的清晰度和分辨率。按 器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。下 面就三种物理效应的原理分别加以说明：
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.样品浓缩效应 上述不连续系统中的三种不
生 物
连续使样品在浓缩胶中得到浓缩。 （）凝胶孔径不连续性。在上述三层凝胶
中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔
验
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二、聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直板
.装胶槽：
（）配的琼脂糖：用电子天平准确称取琼脂糖，加水,然后在
生 电炉上加热至微沸，并不断搅拌，溶液由浑浊变为透明即可。
物
（）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用铬酸洗净，再 用自来水冲洗次，最后用蒸馏水冲洗干净，放于相应的支架
化 上直立干燥。（洗净的玻板内面要避免手指触摸，以防沾污）
种蛋白质按电荷多少,分子量及形状(既荷质比),以一定顺序排
成一个个区带。
连续体系应用也很广,但无浓缩效应, 利用分子筛及电荷
效应进行样品分离,条件温和,对生物活性的保持有益。
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化
胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳
学 动遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶
实 时，受到的阻力加大，移动速度减慢，因而在
验 层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的
区带，并在此界面上依其电荷效多少依次排列
分开，通常可浓缩样品倍。
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（）缓冲体系离子成分及值的不连系性。在三层凝胶中均
有三羟甲基氨基甲烷（简称）及。的作用是维持溶液的电中
生
性及值，是缓冲配对离子。在任何溶液中均易解离出，在电 场中迁移率快，走在最前面成为快离子。电极缓冲液中的甘
物 氨酸（）,其在的电极缓冲液中,易解离出甘氨酸根（－），而
化 在的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度最小，仅有—，因而在
学
电场中迁移很慢，称为慢离子。大多数蛋质在左右在或时均 带负电荷向正极移动，其有效迁移率介于快离子和慢离子之
加入过硫酸铵混匀，不要剧烈搅拌以免带进空气。混合后用
生 注射器将工作液慢慢地、连续地沿管壁注入安放好的电泳板
物
中，分离胶的高度约距矮玻璃板，然后立即用注射器在分离 胶液面上缓缓加入毫米的蒸馏水层，可以看见凝胶与水之间
化 明显的界面。切勿使加入的水呈滴状坠入胶液，而使顶部凝
学 了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在
实
快离子后面加速移动。在快离子和慢离子的移动速度相等 的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个
验 稳定而又不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效迁移
恰好介于快、慢离子之间,因此也就聚集在这个移动的界面
附近,被浓缩形成一个狭小的中间层。由于浓缩胶为大孔胶,
学
实
验
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实验原理
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聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应分为连
生 续及不连续系统，在连续系统中凝胶总浓度、缓 物 冲液均相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电荷 化 及分子筛效应得以分离；在不连续系统中缓冲液 学 离子成分、、凝胶总浓度及电位梯度均不连续， 实 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应和分子筛 验 效应，还具有浓缩效应，可使稀的样品在电泳中
实 间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为
验 极窄的区带。当进入的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有
效迁移率超过蛋白质；因此氯离子及甘氨酸根沿着离子界面
继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后再
分成多个区带。（如图）。
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