生化实验 设计试验PAGE
生化检验技术实验报告
一、实验目的1. 掌握血糖测定的原理和方法。
2. 熟悉血糖测定仪器的操作流程。
3. 了解血糖在人体代谢中的重要性。
二、实验原理血糖测定是通过检测血液中的葡萄糖浓度来评估血糖水平。
常用的血糖测定方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖氧化酶-氧电极法等。
本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定。
葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖与氧气反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的催化下分解为水和氧气，氧气在电极上还原，产生电流，电流大小与葡萄糖浓度成正比。
三、实验设备与试剂1. 实验设备：血糖测定仪、微量移液器、移液管、一次性采血针、酒精棉球、消毒液等。
2. 实验试剂：葡萄糖氧化酶试剂盒、葡萄糖标准品、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）准备标准溶液：将葡萄糖标准品用蒸馏水稀释成不同浓度的标准溶液。
（2）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将标准溶液分别加入测定管中。
（3）开启血糖测定仪，依次测定各标准溶液的血糖浓度，记录数据。
（4）以葡萄糖浓度为横坐标，测定值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血糖测定（1）用酒精棉球消毒采血部位，用一次性采血针对准静脉，待血液流出后，用消毒液消毒采血针。
（2）用微量移液器吸取适量血液，加入测定管中。
（3）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将测定管放入测定仪中。
（4）开启血糖测定仪，待测定仪显示血糖浓度后，记录数据。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.0037x + 0.0035，R² = 0.9987。
2. 血糖测定本次实验测得血糖浓度为4.5 mmol/L。
六、实验讨论1. 本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定，操作简便、快速，准确性较高。
2. 在实验过程中，要注意控制操作误差，如准确配制标准溶液、正确设置测定仪等。
3. 血糖测定对于糖尿病等疾病的诊断和治疗具有重要意义，本实验有助于加深对血糖测定原理和方法的理解。
生化实验方案
生物化学实验教学内容（本部）实验内容与方法实验背景资料1：《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验背景资料过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。
人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。
小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。
溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。
本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。
2、3. 实验目的熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。
熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。
4. 实验原理匀浆原理：分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。
过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。
过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。
根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。
盐析原理：蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。
《生化实验技术》综合设计实验方案设计报告
《生化实验技术与应用》实验设计方案实验项目：水果基因组DNA 的提取与转基因成分分析 专业：生物技术 班级：101 日期：3月1日 一、实验目的：1、掌握提取植物组织基因组DNA 的基本方法。
2、掌握二苯胺法和紫外分光光度法测定DNA 含量的原理和方法。
3、学会转基因植物转基因成分的分析4、学习DNA 的水平式琼脂糖凝胶电泳并学会操作。
5、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备的使用。
二、实验原理：核酸是生物有机物体重的重要组成成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。
核酸分为DNA 和RNA 两大类，前者主要存在于细胞核内，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA 则溶于上层水相。
将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA 的少量溶解。
95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分，经Rnase 降解RNA ，可得较纯的DNA 。
DNA 含量与纯度测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm 有吸收峰，根据公式[DNA(μg /mL)=A260*50*稀释倍数]可计算出核酸DNA 的浓度。
由于蛋白质在280nm 有吸收峰，可根据比值判断DNA 纯度：A260／A280＜1.8时，表明蛋白质含量偏高；1.8＜A260／A280＜1.9时，表明样品较纯；A260／A280＞2.0时，表明RNA 或DNA 碎片较多。
二苯胺法定量测定DNA 的原理为：在强酸、加热条件下，可以使DNA 中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。
其中，2’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。
DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA 含量成正比。
在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。
最新生物化学设计性实验报告
最新生物化学设计性实验报告实验目的：本实验旨在通过设计性实验，探究特定生物化学过程的机制和特点，验证理论假设，并培养学生的科研能力和实验技能。
实验背景：生物化学是研究生物体化学组成、化学变化及这些变化与生物体功能之间关系的科学。
设计性实验是生物化学教学和研究中的重要组成部分，它能够帮助学生更好地理解生物化学的基本概念，并通过实践活动加深对知识的掌握。
实验材料：1. 酶类样品2. 底物溶液3. 缓冲液4. 酶活性测定试剂盒5. 分光光度计6. 离心机7. 微量移液器8. 试管和比色皿9. 冰浴和恒温水浴实验方法：1. 预实验：首先对酶样品进行纯化，并通过酶活性测定初步了解其活性范围。
2. 实验设计：根据预实验结果，设计一系列实验，包括不同pH值、温度、底物浓度对酶活性的影响。
3. 实验操作：a. 准备一系列不同pH值的缓冲液，并调整酶样品和底物溶液至相应pH值。
b. 在不同温度下（如25℃、37℃、50℃）测定酶活性，记录数据。
c. 改变底物浓度，观察米氏常数（Km）和最大速率（Vmax）的变化。
4. 数据分析：利用图表和统计学方法分析实验数据，得出酶活性与实验条件之间的关系。
实验结果：1. pH值对酶活性的影响图显示，酶活性在特定pH值下达到最大，而在过高或过低的pH值下活性显著降低。
2. 温度对酶活性的影响图表明，酶活性随温度升高而增加，但在接近50℃时急剧下降，表明酶可能发生变性。
3. 底物浓度实验结果显示，当底物浓度增加到一定程度后，酶活性趋于平稳，计算得到的Km值与文献值相近。
讨论与结论：通过本实验，我们验证了酶活性受pH值、温度和底物浓度的影响。
实验结果与理论预期相符，表明设计性实验是理解和掌握生物化学原理的有效手段。
同时，实验过程中可能出现的误差和问题也为我们提供了宝贵的学习和改进机会。
生化实验的设计实验报告
一、实验目的1. 掌握从生物组织中提取DNA的基本原理和方法。
2. 学习使用酚-氯仿法进行DNA的粗提取和纯化。
3. 熟悉DNA的鉴定方法。
二、实验原理DNA是生物体内的重要遗传物质，具有独特的碱基序列。
在提取过程中，利用DNA与蛋白质、RNA等物质的溶解性差异，通过适当的化学试剂和操作步骤，将DNA从细胞中分离出来。
三、实验材料与仪器1. 材料：鸡血、无菌生理盐水、无水乙醇、氯化钠、酚-氯仿、NaCl溶液、DNA标准样品等。
2. 仪器：离心机、玻璃棒、量筒、烧杯、滴管、吸管、移液器、酒精灯、显微镜等。
四、实验步骤1. 鸡血采集：取鸡血2ml，加入10ml无菌生理盐水，充分混匀。
2. 细胞裂解：取2ml鸡血混合液，加入等体积的酚-氯仿，充分混匀后静置5分钟。
3. DNA沉淀：取上述混合液，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后静置10分钟。
4. DNA纯化：将上述混合液转移到离心管中，离心5分钟（8000r/min），弃去上清液。
5. DNA溶解：将沉淀用50μl NaCl溶液溶解，混匀。
6. DNA鉴定：取少量溶解后的DNA溶液，加入2μl DNA标准样品，观察颜色变化。
五、实验结果1. 在实验过程中，观察到鸡血混合液与酚-氯仿混合后分层，上层为红色，下层为无色。
2. 在DNA沉淀过程中，观察到白色沉淀形成。
3. 在DNA溶解过程中，观察到溶液颜色由白色变为无色。
4. 在DNA鉴定过程中，观察到溶液颜色与DNA标准样品颜色相似。
六、实验结论1. 成功从鸡血中提取了DNA。
2. 酚-氯仿法是提取DNA的有效方法。
3. DNA在生物组织中的提取具有实际应用价值。
七、实验讨论1. 实验过程中，酚-氯仿的加入有助于细胞裂解和DNA的提取。
2. 无水乙醇的加入有助于DNA的沉淀。
3. NaCl溶液的加入有助于DNA的溶解。
4. 实验过程中，注意操作规范，避免污染。
5. DNA提取过程中，温度、pH值等条件对实验结果有影响。
生化试验设计PPT学习教案
透析袋中，将透析袋放入
盛有300ml的物质的量浓度
为20mmol/L的磷酸缓冲液
中，pH为7.0，透析12小时，
目的是除去样品中分子量
较小的杂质或用于更换样
品中的缓冲液。透析袋一
般用硝酸纤维素制成，又
称玻璃纸。
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纯化
a、凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米
的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔 →挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100 目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。（注意事项：底 塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面， 否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分 离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。）④ 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安 装其他附属结构。
凝胶色谱法原理 凝胶电泳法原理标准比色法原理
当不同蛋白质通过凝胶时相对分子质 量较小 的蛋白 质容易 进入凝 胶的内 部通道 ，而相 对分子 质量较 大的蛋 白质无 法进入 内部通 道只能 在凝胶 外部移 动，路 程较短 ，移动 速度较 快，相 对分子 质量不 同的蛋 白质因 此得以 分离。
。
不同蛋白质的带电性质、电量、形状 和大小 不一样 ，在电 场中受 到的作 用力大 小、方 向、阻 力不同 ，导致 不同蛋 白质在 电场中 的运动 方向和 运动速 度不一 样
第6页/共26页
在一定量的血液中， 血红蛋白经少量的盐 酸的作用，使亚铁血 红素变成高铁血红素 。呈现较稳定的棕色 ，用水稀释后与标准 色比较，即可得出每 100ml血液中的含量
实验试剂
1、0.9%的氯化钠溶液 2、蒸馏水 3、有机溶剂（甲苯） 4、磷酸缓冲液 5、柠檬酸钠 6、凝胶色谱柱实验所需用品 7、SDS-PAGE实验所需用品 8、血红蛋白计、0.1mol/L盐酸溶液、载玻片、刺血针
生化实验报告模板
实验一 生物化学实验基本操作
姓 名：
胡嘉元
学号：
0901354
班级：
09中医五
同组：
严海艺
实验室：
室温：
日期：
2011·3·4
成 绩：
教 师：
一、实验目的
二、实验原理
三、实验器材
四、实验试剂
五、实验内容及操作
（一）玻璃仪器的洗涤
（二）移液管的使用
（三）溶液的混匀
（四）溶液的过滤
六、实验结果(附图)（其他同此）
硫酸铜溶液标准曲线的绘制与未知浓度硫酸铜溶液的分析
硫酸铜浓度/%
0
0.8
1.6
2.4
3.2
4.0
未知
吸光度
0
标准曲线
七、分析讨论
722s722s722s型分光光度计的使用型分光光度计的使用型分光光度计的使用操作硫酸铜溶液标准曲线的绘制与未知浓度硫酸铜溶液的分析操作硫酸铜溶液标准曲线的绘制与未知浓度硫酸铜溶液的分析操作硫酸铜溶液标准曲线的绘制与未知浓度硫酸铜溶液的分析试剂试剂试剂mlmlml4cuso4cuso4cuso44未知浓度硫酸铜溶液未知浓度硫酸铜溶液未知浓度硫酸铜溶液690nm690nm690nm比色比色比色六实验结果六实验结果六实验结果附图附图附图其他同此其他同此其他同此硫酸铜溶液标准曲线的绘制与未知浓度硫酸铜溶液的分析硫酸铜溶液标准曲线的绘制与未知浓度硫酸铜溶液的分析硫酸铜溶液标准曲线的绘制与未知浓度硫酸铜溶液的分析硫酸铜浓度硫酸铜浓度硫酸铜浓度080808161616242424323232404040未知未知未知吸光度吸光度吸光度标准曲线标准曲线标准曲线七分析讨论七分析讨论七分析讨论
生化实验 设计试验--PAGE
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设计试验
实验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应分为连 续及不连续系统，在连续系统中凝胶总浓度、缓 冲液PH均相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电 荷及分子筛效应得以分离；在不连续系统中缓冲 液离子成分、PH、凝胶总浓度及电位梯度均不连 续，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应和分 子筛效应，还具有浓缩效应，可使稀的样品在电 泳中浓缩成层，因而具有良好的清晰度和分辨率。 按器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。 下面就三种物理效应的原理分别加以说明：
Exit Exit
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二、聚丙烯酰胺凝胶电泳----垂直板 1.装胶槽： （1）配1%的琼脂糖：用电子天平准确称取5g琼脂糖，加水 500ml,然后在电炉上加热至微沸，并不断搅拌，溶液由浑浊 变为透明即可。 （2）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用铬酸洗净， 再用自来水冲洗2-3次，最后用蒸馏水冲洗干净，放于相应的 支架上直立干燥。（洗净的玻板内面要避免手指触摸，以防 沾污） （3）将带有凹槽的玻璃放在凝胶模高一点的孔中，另一平 板放于凝胶模有底槽的一边. （4）将已插好玻板的凝胶模夹到贮槽中（使略低的玻板一 侧靠近负极），然后双手以对角线的方式旋紧螺丝帽. （5）倾斜电泳槽，用滴管吸取少量的1% 琼脂糖溶液，封好 凝胶模板底边和侧边 Exit
3、过硫酸铵 5、Acr 10.0g 6、蔗糖 40.0g
4、1mol/L盐酸48 mL Tris 5.98g TEMED 0.48 mL
7、电极缓冲液Tris 6.0克；甘氨酸 28.8克；加水到1L 用时稀释10倍
Exit
生命科学学院
设计试验
实验步骤
生 物 化 学 实 验
一、样品的提取 二、PAGE电泳 三.结果分析
生化实验技术实验设计
生化实验技术实验设计实验设计题目：高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留课程：生物学实验技术概述专业：生物化学与分子生物学学号：2015116105姓名：杨洁舒高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留一、方案必要性与可行性分析我国是水稻种植大国，大米是我国人民的主食，占口粮消费的63％以上。
大米除被制成米饭直接食用外，还被加工成米粉、甜点及酒精饮料等。
我国大米人均年消费量在140kg以上。
水稻生产中为了保证水稻的高产，往往不可避免地需要使用各种农药。
据报道，在农药的使用过程中，真正起作用的仅占喷施量的0.1%，其余99.9%的农药都分散于环境中，中国每年受农药污染的农田面积达到6.67×106hm2。
因此，在大米的进出口中，世界各主要农业大国都对大米的农药残留制定了严格的限量标准。
研究大米中农药残留的检测方法，既是保障人类健康的需要，又是促进进出口贸易的需要。
为了保证水稻的产量，种植者施用大量的化学农药，不仅造成环境污染，而且直接影响大米的食用安全，威胁人们的健康。
鉴于上述原因，世界各国严格规定了包括大米在内的食品中农药最大残留限（MRLs）和每日最大摄入量。
目前大部分实验室监测食品中农药残留的方法是采用经典的气相色谱法，选择性检测器包括电子捕获检测器（ECD）、氮磷检测器（NPD）和火焰光度检测器（FPD），然而这些检测器限制了农药残留的检测范围。
其原因是萃取共存物的干扰存在假阳性和不准确性，用单一方法检测呈阳性后，还必须做确证试验。
此外，经典的预处理方法操作复杂，耗时且溶剂消耗量大，因此，有必要研究新的样品预处理及检测方法。
随着联用技术的日趋完善,高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）逐渐成为最热门的分析手段之一。
特别是在分子水平上可以进行蛋白质、多肤、核酸的分子量确认,氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等,这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。
HPLC一MS 作为已经比较成熟的技术,目前国内外己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。
生化设计实验
蛋白质与核酸的定性与定量一. 实验目的1. 学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原理和方法。
2. 掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定。
3. 学会利用定糖法对核酸的定性与定量测定二. 实验原理1. 区分蛋白质和核酸：蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+紫红色反应。
这是蛋白质分子中肽键的反应，肽键越多反应颜色越深。
核酸由单核苷酸所组成，无此反应。
另外，核酸组成成分嘌呤及嘧啶碱基具有强烈的紫外吸收，所以核酸也具有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260mn ，利用这一性质亦可鉴别核酸样品和蛋白质样品。
2. 蛋白质的纯化方法：（1）粗分离：中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著的影响。
一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。
盐析沉淀的蛋白质一般保持着天然构象而不变性。
（2）蛋白质类别及分子量的确定：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定样液中含有几种蛋白质，每种蛋白质的分子量大小。
由于SDS 是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。
改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS 复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化（3）蛋白质的精制：根据上一步骤得到的蛋白质的分子量，采用葡聚糖凝胶层析的方法。
聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
3. 蛋白质的含量测定以及等电点、比旋度等性质（1）蛋白质的含量测定：采用Folin- 酚试剂法。
《生化实验设计》课件
02 生化实验设计的基本步骤
实验目的和目标的确定
总结词
明确实验目的和目标
详细描述ห้องสมุดไป่ตู้
在进行生化实验设计之前，必须明确 实验的目的和目标，以便有针对性地 选择实验方法、材料和仪器，确保实 验结果的准确性和可靠性。
实验变量的选择和实验条件的确定
总结词
合理选择实验变量和条件
详细描述
实验变量的选择和实验条件的确定是实验设计的关键环节，直接影响实验结果 的可靠性和可重复性。应充分考虑各种因素，合理设置实验组和对照组，控制 无关变量，确保实验结果的准确性和可靠性。
交叉设计是一种实验设计方法，它将受试对象在不同时间 点分别接受不同的处理，以探究时间因素对实验结果的影 响。交叉设计可以有效地控制个体差异和实验中的其他非 处理因素的影响，提高实验的准确性和可靠性。
析因设计
总结词
同时探究多个因素对实验结果的影响，以确定各因素 之间的交互作用。
详细描述
析因设计是一种复杂的实验设计方法，它通过同时探 究多个因素对实验结果的影响，以确定各因素之间的 交互作用。析因设计可以通过全面考虑各种因素及其 交互作用，提供更准确的因果关系结论，为科学研究 和实际应用提供更有价值的数据支持。
详细描述
配对设计是对随机化分组设计的进一步优化 ，它将具有相似特征和背景的受试对象进行 配对，再将配对后的对象随机分配到不同处 理组中，以更好地平衡各种非处理因素的影
响，提高实验的准确性和可靠性。
交叉设计
要点一
总结词
在不同时间点将受试对象分别接受不同处理，以探究时间 因素对实验结果的影响。
要点二
详细描述
实验设计的样本量和分组
总结词
科学确定样本量和分组
生化设计性实验
步骤：
1 制胶板框的加工 2 板框的装配 3 薄层凝胶的制备
实验原理
. 聚丙烯凝胶电泳之所以能将不同大分子 化合物分开，是由于分子所带的电荷和 分子大小不同之故。如果将电荷差异这 个因素出去或减少到可以忽略的程度， 分子在凝胶上泳动率大小就完全取决于 分子量。
• SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是阴离子表 面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质氢键， 巯水键打开，并结合到蛋白质上。这时蛋白质 带大量的SDS，所以带大量的负电荷，远远大 于蛋白质分子原有的电荷，这就降低活消除了 不同蛋白质分子之间的电荷差异。电泳迁移速 率就仅取决于分子大小这一因素，电泳的迁移 速率与分子量的对数呈线型关系：
生化设计性实验
成员：高攀 刘波 谢钧
蛋白质分子量的大小影响很多实验的结 果。 蛋白质分子结构十分复杂，分子量很大， 但是怎么来测定仪一个蛋白质分子的分 子量？
蛋白质分子量的测定
一：SDS—PAGE法测定蛋白质分子量 二：梯度凝胶电泳法测定蛋白质分子量 三：凝胶过滤法测定蛋白质分子量
实验题目： SDS—PAGE法测定蛋白质分子量
生物化学设计性实验报告
G－250试剂5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
每管中的蛋
白质量（g）
光吸收值
（A595）
六、实验的结果：
七、分析讨论：
可见光分光光度计旋涡混合器分析天平
量筒研钵烧杯量瓶移液管试管漏斗剪刀铁架台
四、可行性分析：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）加完试剂2~5分nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
三、使用仪器、材料
1.试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2.器材：
学院
生物工程
年级、专业、班
生工1班
姓名
杜俊峰王琪
成绩
课程名称
生物化学
实验项目名称
蛋白质含量的测定
指导老师
老师评语
教师签名：
年月日
一、设计目的：
尽量快速准确地测定物质中蛋白质的含量
二、设计的依据：
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比，故可这样测定蛋白质的含量。
生化设计实验
紫外分光光度法测定花生奶蛋白质含量一、实验目的建立非蛋白质类含氮物质对测定结果无干扰的乳与乳制品中蛋白质的快速测定方法。
二、实验原理由于乳与乳制品的蛋白质中有游离的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故,在280 nm 波长处有特征的最大吸收,其吸收强度与样中蛋白质含量呈正比。
利用这个特异性吸收,在280 nm 波长处,用1 cm比色杯测得吸光度值。
据此,计算出蛋白质的含量。
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。
含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。
蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。
其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定。
双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。
三、仪器与试剂1、仪器①紫外分光光度计②石英比色皿③微波振荡器。
2、试剂①9 g/L 氯化钠溶液②蒸馏水③双缩脲试剂:溶解0.15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和0.6g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）于50ml 蒸馏水中，在搅拌下加入30ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到100ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。
此试剂可长期保存。
④标准蛋白溶液（10μg/ml）准确称取牛血清蛋白用0.0001mol/L氢氧化钠溶液配制，冰相存放备用.四、操作步骤1、标准应用曲线的绘制:取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以0管为空白，在280nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标线。
2、样品测定:吸取花生饮料1.00 ml 置于100 ml容量瓶中,加入9 g/L 氯化钠溶液至刻度,混匀。
再从中吸取10.00 ml样品溶液于100 ml容量瓶中,加入9 g/L 氯化钠溶液至刻度,微波振荡5 min,混匀。
用定性滤纸过滤,弃去初滤液30 ml,收集滤液备用。
生化实验 设计试验--PAGE
生 物 化 学 实 验
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3、过硫酸铵 5、Acr 10.0g 6、蔗糖 40.0g
4、1mol/L盐酸48 mL Tris 5.98g TEMED 0.48 mL
7、电极缓冲液Tris 6.0克；甘氨酸 28.8克；加水到1L 用时稀释10倍
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实验步骤
生 物 化 学 实 验
一、样品的提取 二、PAGE电泳 三.结果分析
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试剂
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1、1mol/L盐酸48.0 mL Tris 36.6g TEMED 0.24 mL 2、Acr 28.0g Bis 0.753g 0.14- 0.3g Bis 2.5g
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（⑶电位梯度的不连续性。电位梯度的高低与电泳速 度的快慢有关（ V=mE） , 迁移率低的离子在高电位梯度中 可以与迁移率高而处于低电位梯度的离子具有相应的速度 （即E高m慢=E低m快）,电泳开始后 ,由于快离子迁移率最 大,就会很快超过蛋白质,因此在快离子后面形成一个离子浓 度低的区域,即低电导区,电场强度与电导成反比关系：I=Eη, 式中 E为电场强度 ,I为电流强度 ,η为电导率 ,E与电导率成反 比，所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯 度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和 慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子 和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。 由于蛋白质的有效迁移恰好介于快、慢离子之间,因此也就 聚集在这个移动的界面附近 ,被浓缩形成一个狭小的中间层。 由于浓缩胶为大孔胶, 对样品没有分子筛作用。
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实 间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为
验 极窄的区带。当进入的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有
效迁移率超过蛋白质；因此氯离子及甘氨酸根沿着离子界面
继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后再
分成多个区带。（如图）。
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种蛋白质按电荷多少,分子量及形状(既荷质比),以一定顺序排
成一个个区带。
连续体系应用也很广,但无浓缩效应, 利用分子筛及电荷
效应进行样品分离,条件温和,对生物活性的保持有益。
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学 了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在
实
快离子后面加速移动。在快离子和慢离子的移动速度相等 的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个
验 稳定而又不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效迁移
恰好介于快、慢离子之间,因此也就聚集在这个移动的界面
附近,被浓缩形成一个狭小的中间层。由于浓缩胶为大孔胶,
验
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二、聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直板
.装胶槽：
（）配的琼脂糖：用电子天平准确称取琼脂糖，加水,然后在
生 电炉上加热至微沸，并不断搅拌，溶液由浑浊变为透明即可。
物
（）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用铬酸洗净，再 用自来水冲洗次，最后用蒸馏水冲洗干净，放于相应的支架
化 上直立干燥。（洗净的玻板内面要避免手指触摸，以防沾污）
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试剂
、盐酸
生 物、
化 、过硫酸铵
学
、盐酸
实、
验 、蔗糖
、电极缓冲液 克；甘氨酸 克；加水到用时稀释倍
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实验步骤
设计试验
生
一、样品的提取
物
化
学
二、电泳
实
验
三.结果分析
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（一）、样品的提取
设计试验
生 一、过氧化物同功酶的提取
物 .准确称取新鲜材料，加入 提取缓冲液（）和 化 少许石英砂，研磨成匀浆。 学 离心,上清液为可溶性蛋白和同工酶的粗提液。 实 .取上清液，分别加入蔗糖和溴酚蓝。
有三羟甲基氨基甲烷（简称）及。的作用是维持溶液的电中
生
性及值，是缓冲配对离子。在任何溶液中均易解离出，在电 场中迁移率快，走在最前面,易解离出甘氨酸根（－），而
化 在的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度最小，仅有—，因而在
学
电场中迁移很慢，称为慢离子。大多数蛋质在左右在或时均 带负电荷向正极移动，其有效迁移率介于快离子和慢离子之
加入过硫酸铵混匀，不要剧烈搅拌以免带进空气。混合后用
生 注射器将工作液慢慢地、连续地沿管壁注入安放好的电泳板
物
中，分离胶的高度约距矮玻璃板，然后立即用注射器在分离 胶液面上缓缓加入毫米的蒸馏水层，可以看见凝胶与水之间
化 明显的界面。切勿使加入的水呈滴状坠入胶液，而使顶部凝
物 清蛋白。进入同一孔径的小孔胶时, 蛋白分子量小且为球形
化 的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面；反之阻力大,移
学
动慢,走在后面,从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分 成各自的区带。
实
.电荷效应 进入的分离胶中,各种蛋白所带净电荷不同,而
验 有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快；反之则慢。因此各
对样品没有分子筛作用。
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.分子筛效应: 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通
过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移
率,这就是分子筛效应。蛋白质进入的同一孔径的分离胶后。
生
此时,高电压消失,在均一的电压梯度下,由于甘氨酸解离度增 加，加之其分子量小,其有效泳动率增加,赶上并超过各种血
学
实
验
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实验原理
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聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应分为连
生 续及不连续系统，在连续系统中凝胶总浓度、缓 物 冲液均相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电荷 化 及分子筛效应得以分离；在不连续系统中缓冲液 学 离子成分、、凝胶总浓度及电位梯度均不连续， 实 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应和分子筛 验 效应，还具有浓缩效应，可使稀的样品在电泳中
化
胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳
学 动遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶
实 时，受到的阻力加大，移动速度减慢，因而在
验 层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的
区带，并在此界面上依其电荷效多少依次排列
分开，通常可浓缩样品倍。
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（）缓冲体系离子成分及值的不连系性。在三层凝胶中均
浓缩成层，因而具有良好的清晰度和分辨率。按 器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。下 面就三种物理效应的原理分别加以说明：
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.样品浓缩效应 上述不连续系统中的三种不
生 物
连续使样品在浓缩胶中得到浓缩。 （）凝胶孔径不连续性。在上述三层凝胶
中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔
学 （）将带有凹槽的玻璃放在凝胶模高一点的孔中，另一平板
实
放于凝胶模有底槽的一边. （）将已插好玻板的凝胶模夹到贮槽中（使略低的玻板一侧
验 靠近负极），然后双手以对角线的方式旋紧螺丝帽.
（）倾斜电泳槽，用滴管吸取少量的 琼脂糖溶液，封好凝胶
模板底边和侧边
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.分离胶的配制：
将贮液（除过硫酸铵外）按比例混合成工作液，按比例迅速
（⑶电位梯度的不连续性。电位梯度的高低与电泳速度
的快慢有关（）,迁移率低的离子在高电位梯度中可以与迁
移率高而处于低电位梯度的离子具有相应的速度（即高慢
生 低快）,电泳开始后,由于快离子迁移率最大,就会很快超过
物 化
蛋白质,因此在快离子后面形成一个离子浓度低的区域,即低 电导区,电场强度与电导成反比关系：η,式中为电场强度为 电流强度,η为电导率与电导率成反比，所以低电导区就有
生
生物化学实验
物 化
设计试验
学 实
主讲：刘连芬
验
聊城生命科学学院
：
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设计试验
相关知识背景
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ , ）是以聚丙烯酰胺为支持介
生 质的电泳。聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（. ）和交联
物 剂, ’甲叉双丙烯酰胺（, ）在催化剂过硫酸铵（()简称）
化
或核黄素(即 )和加速剂, , ’, ’四甲基乙二胺(’’ , 简 称)的作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。