634901 SMART cDNA 文库构建实验流程(clontech)

操作一览

(PT3000-2)

本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。

A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成

1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：

1–3 μl RNA 样本

(对照反应，使用1 μl 的对照RNA)

1 μl SMART™ IV Oligonucleotide

1 μl CDS III/3' PCR Primer

如果总体积<5 μl时，用水补齐至5 μl。

2. 混匀试剂并瞬时离心。

3. 72°C孵育2 min。冰上冷却2 min。

4. 瞬时短暂离心。

5. 向每管反应中加入以下试剂：

2.0 μl 5X First-Strand Buffer

1.0 μl DTT (20 mM)

1.0 μl dNTP Mix (10 mM)

1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase

10.0 μl 总体积

6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

7. 42°C孵育1 hr。之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。

8.引物延伸合成ds cDNA

分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。

B. LD PCR扩增合成cDNA

1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：

2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7)

80 μl Deionized H2O

10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer

2 μl 50X dNTP Mix

2 μl5' PCR Primer

2 μl CDS III/3' PCR Primer

2 μl 50X Advantage2 Polymerase Mix

100 μl总体积

2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

3. 如果需要可以向管中加2滴矿物油，盖上管盖，置于预热(95°C)的PCR仪器

中。

4. 以下程序选择一种进行扩增：

GeneAmp 480 GeneAmp 2400/9600

•95℃ 1 min •95℃20 sec

•x cycles*: •x cycles*:

95℃15 sec 95℃ 5 sec

68℃ 6 min 68℃ 6 min

*参考Table I 中最优循环数的使用。

5. 取5μl产物在1.1% 琼脂糖/EtBr 胶上进行检测，若检测结果与预期不符时，请参考疑难解答指南(说明书的Section VIII)。

6. 然后进入步骤D。

C. 引物延伸扩增ds cDNA

1. 混匀以下试剂：

11 μl First-Strand cDNA (from Step A.8)

71 μl Deionized H2O

10 μl10X Advantage 2 PCR Buffer

2 μl dNTP Mix

2 μl5' PCR Primer

2 μl CDS III/3' PCR Primer

2 μl 50X Advantage 2 Polymerase Mix

100 μl 总体积

2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

3. 如果需要可以加2滴矿物油，盖上管盖后置于预热(95°C)的PCR仪器中。

4. 以下程序选择一种进行扩增：

GeneAmp 480 GeneAmp 2400/9600

• 72°C 10 min • 72°C 10 min

• 95°C 1 min • 95°C 20 sec

• 3 cycles:• 3 cycles:

95°C 15 sec 95°C 5 sec

68°C 8 min 68°C 8 min

5. 取5μl产物在1.1% 琼脂糖/EtBr 胶上进行检测，如果结果与预期不符，请参考疑难解答指南(说明书的Section VII)。

D. 蛋白酶K 消化

1. 向0.5-ml 无菌管加入50 μl 扩增后的ds cDNA(2–3 μg) 和2 μl 蛋白酶K (20 μg/μl)。将剩余ds cDNA置于–20°C保存。

2. 混匀试剂并瞬时离心。

3. 45°C孵育20 min，瞬时离心。

4. 加入50 μl Deionized H2O。

5. 再加入100 μl 酚:氯仿:异戊醇，轻柔地连续颠倒1–2 min。

6. 14,000 rpm 离心5 min。

7. 将最上层液体(上清液) 转移到0.5-ml干净的管。

8. 加入100 μl 酚:氯仿:异戊醇，轻柔地连续颠倒1–2 min。

9. 14,000 rpm 离心5 min。

10. 将最上层液体(上清液) 转移到0.5-ml干净的管。

11.加入10 μl 3 M醋酸钠, 1.3 μl 糖原(20 μg/μl)和260 μl室温95% 乙醇，立即进行14,000 rpm 室温离心20 min。

12. 小心去除上清液。

13. 100 μl 80%乙醇清洗。

14. 空气干燥(~10 min)来挥发残留的乙醇。

15. 加入79 μl Deionized H2O 重悬DNA颗粒。

E. SfiI 酶切

1. 在0.5-ml离心管中混匀以下试剂:

79 μl cDNA (Step D.15)

10 μl 10X Sfi Buffer

10 μl SfiI Enzyme

1 μl 100X BSA

100 μl总体积

2.混匀并在50°C 孵育2 hr。

3. 加入2 μl 1%二甲苯腈蓝，混匀。

F. CHROMA SPIN TM-400 cDNA分选

1. 标记16个1.5-ml离心管，按顺序摆放在管架中。

2. 准备CHROMA SPIN-400纯化柱：

a. 室温放置CHROMA SPIN 纯化柱1 hr。然后颠倒数次混匀胶质。

b. 赶走纯化柱中的气泡，使用1000-μl 移液器轻柔地重悬胶质。去除底盖让液体滴落。

c. 将纯化柱放置在环形支架上。

d. 借助重力将柱中存储液排干(胶质的顶端应该处于柱外表面1.0-ml标记处。)

e. 流速~1滴/40–60 sec，每滴体积~40 μl。

3. 当存储液排干后，加入700 μl 柱纯化缓冲液并将其排干。

4. 向胶质中央加入~100 μl SfiI消化后的cDNA和二甲苯腈蓝混合液(Step E.3 above)。

5. 当样本被胶质完全吸收后再进行下一步骤。

6. 向胶质中央加入100 μl缓冲液清洗纯化柱。

7. 排干缓冲液，胶质表面不能有液体残留。当无液体滴落时，再进行下一步骤。

8. 将步骤1中离心管放置在纯化柱下方，使标记1的管对准纯化柱下方液体出口处。