载体构建流程

菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶切分析以及测序检测。

酶切检测阳性克隆

将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期条带的即为阳性克隆。要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入，缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行测序。选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克隆。
挑取阳性克隆去测序

测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测序正确的阳性克隆才算成功构建载体。 ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表达、结构、功能。不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修补。
转化
基本步骤：（1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。（2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。（3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。（4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。（5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。（6）将平板置于室温直至液体被吸收。（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
回收前
回收后
酶切载体带酶切目的条带
连接

载体构建流程

载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。

过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。

Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。

载体构建流程课件

经典载体构建流程
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目旳基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化连接
纯化酶切产物
酶切目旳基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确旳摇菌提质粒
导入体现宿主测试体现情况
提取mRNA
假如可能，试验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定时进行消毒。.操作过程中应自始至终佩戴口罩和手套，并经常更换，以防止将手、臂上旳细菌和真菌以及人体本身分泌旳RNA酶带入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品采用连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
注意将甘油旳终浓度控制在10%下列，以防止出现星号活性，可经过增长反应体系旳总体积旳措施实现这一要求。
酶切常见问题
纯化酶切产物
一般此步是必要旳，能够对比未经纯化旳酶切产物进行连接后取得旳阳性克隆大大低于胶回收酶切产物连接所得阳性克隆。
此步旳目旳是清除多出旳片段，得到单一纯化旳目旳基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干扰。
谢谢！
复苏。（5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性旳LB琼脂平板表面。注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞旳效率进行调整。（6）将平板置于室温直至液体被吸收。（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应当代分子生物学试验室批量工作旳高效性，一般只需挑半个菌落直接作为模板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
切胶回收PCR产物时，防止DNA在紫外线下暴露时间过长从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。

载体构建技术基本流程

载体构建技术基本流程
载体构建的基本流程：
1.载体质粒的选择；
2.引物设计；
3.PCR扩增；
4.载体和⽬标⽚段的限制性酶切；
5.连接转化；
6.挑取克隆提质粒验证。

重要的是，我们要为⼤家提供了⼀个载体构建流程模板，构建载体时希望⼤家可以创建⼀个word⽂档，按照我们提供的模板，将载体构建过程记录下来，便于后续优化。

后续⽂章中我们将举例告诉⼤家如何使⽤这个模板。

P.S. 构建表达载体时可以先连接T载体，可把步骤（12）酶切⽚段换成连接T载体后再对T载体进⾏酶切。

连接T载体会多花⼀天时间，但是可以使载体构建流程更顺利。

连接T载体与连接⽬的载体⽅法⼗分类似，本次举例不再涉及。

如果想要通过连接T载体过渡，可以⽹上搜索T载体相关产品说明书，了解T载体和连接T载体的⽅法。

引物设计的内容我们将放在接下来的⼀篇推送⾥，正在构建载体的⼤家，先尝试使⽤我们的载体构建流程模板吧。

酶切法构建载体的流程

酶切法构建载体的流程酶切法构建载体的那些事儿。

一、准备工作。

这就好比做饭之前得先把食材和厨具都准备好一样。

构建载体前，得把载体和目的基因这两个关键的东西准备妥当。

载体就像是一辆小货车，它能把我们的目的基因运输到我们想要的地方去。

这个载体要选择合适的，就像选车得根据货物的大小、运输的路况来选一样。

目的基因呢，那可是我们的宝贝货物，要通过各种手段把它提取出来，确保它的纯度和完整性。

另外，还得准备好各种酶，就像厨师做菜需要各种调料一样。

像限制性内切酶，这可是关键的酶，它就像一把小剪刀，能在特定的位置把载体和目的基因剪开。

还有连接酶，它的作用就是把剪开又处理好的载体和目的基因连接起来，就像胶水把东西粘在一起似的。

而且，反应缓冲液也不能少，这就像是酶发挥作用的小环境，没有合适的缓冲液，酶可能就不好好干活啦。

二、酶切过程。

这一步可重要啦。

把载体和目的基因分别放到不同的小管子里，加入适量的限制性内切酶和反应缓冲液。

然后就把这些小管子放到一个小仪器里，让它们在合适的温度下反应。

这个温度就像是酶的舒适区，不同的酶有不同的舒适温度。

在这个过程中，限制性内切酶就开始发挥它的小剪刀功能啦，在载体和目的基因上特定的位置咔嚓咔嚓地剪开。

这就像是给载体和目的基因做了一个小手术，让它们有合适的接口可以连接。

三、处理酶切产物。

酶切完了可不能就直接用。

得把酶切产物处理一下。

因为酶切之后可能会有一些小的片段或者残留的酶，这些东西可能会影响后续的连接反应。

这时候就像是给刚裁剪好的布料再整理整理，把那些多余的线头剪掉。

一般可以通过一些方法把残留的酶去掉，让酶切产物变得干干净净、利利索索的。

四、连接反应。

处理好的载体和目的基因就可以开始连接啦。

把它们放到一个管子里，加入连接酶和反应缓冲液。

然后又把这个小管子放到合适的温度下。

连接酶就开始工作啦，它把载体和目的基因的切口连接起来。

这就像是把裁剪好的布料缝成一件漂亮的衣服。

经过这个过程，一个新的带有目的基因的载体就构建好啦。

载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

载体构建流程pp课件

• 切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端残基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
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回收前
回收后
酶切载体带酶切目的条带
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连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶切分析以及测序检测。
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酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入，缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克隆。
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温度或做个梯度，摸一下条件。
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PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性，残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆失败。
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挑取阳性克隆去测序
• 测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测序正确的阳性克隆才算成功构建载体。

载体构建质粒构建步骤有哪些？

载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。

9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。

⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。

2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。

限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。

限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。

其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。

Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。

构建表达载体的一般流程

构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。

常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。

2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。

可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。

3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。

这些序列将调控基因的表达方式和水平。

4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。

5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。

常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。

6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。

7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。

8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。

需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。

在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。

《载体构建流程》课件

度。
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决载体构建过程中的错误和异常，确保载体的稳定性和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操作体验和游戏机制等方面。
详细描述

vigs载体构建的基本流程

vigs载体构建的基本流程1.首先准备vigs载体构建所需的质粒。

Firstly, prepare the plasmid required for vigs vector construction.2.将目标基因插入到质粒的多克隆位点中。

Insert the target gene into the multicloning sites of the plasmid.3.通过PCR扩增目标基因。

Amplify the target gene by PCR.4.将PCR产物纯化和酶切。

Purify and digest the PCR product.5.选择合适的酶切位点和vigs载体进行连接。

Chooseappropriate restriction enzyme cutting sites and connect them with the vigs vector.6.进行连接反应。

Perform ligation reaction.7.转化大肠杆菌，分离获得重组质粒。

Transform E. coli and isolate the recombinant plasmid.8.进行PCR验证所得质粒。

Perform PCR verification of the obtained plasmid.9.测序确认目标基因已正确插入。

Sequencing to confirm the correct insertion of the target gene.10.提取质粒，获得高质量的vigs载体。

Extract the plasmid to obtain high-quality vigs vector.11.通过限制性内切酶消化鉴定重组质粒。

Identify the recombinant plasmid by restriction endonuclease digestion.12.进行质粒的DNA测序。

载体构建的基本流程

载体构建的基本流程载体构建的基本流程主要包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。

首先，设计方案确定是载体构建的第一步，也是最为关键的一步。

在这个阶段，我们需要明确载体的功能要求、外形尺寸、结构布局等设计参数，然后进行方案设计和优化，最终确定最佳的设计方案。

设计方案的确定需要充分考虑载体的使用环境、工作条件、使用寿命等因素，确保设计方案的科学合理性和可行性。

接下来是材料准备环节，这一步是实现设计方案的关键环节。

根据设计方案确定的材料要求，我们需要选择合适的材料，并进行采购和准备工作。

在材料选择方面，需要考虑材料的力学性能、耐磨性、耐腐蚀性、导热性、导电性等多个方面的要求，确保选择的材料符合设计要求。

在材料准备工作中，还需要对材料进行切割、成型、加工等工艺处理，以满足设计方案的要求。

随后是工艺加工环节，这一步是将设计方案和准备好的材料转化为具体载体的关键环节。

在这个阶段，我们需要进行组装、焊接、切割、打磨、涂装等一系列工艺加工工序，将材料加工成符合设计要求的零部件，并进行组装装配，最终形成完整的载体。

工艺加工环节需要严格按照设计要求和工艺规程进行操作，确保加工质量和工艺精度。

最后是性能测试环节，这一步是验证载体构建结果的关键环节。

在这个阶段，我们需要对构建好的载体进行功能测试、性能测试、可靠性测试等一系列测试工作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。

在测试过程中，需要对载体的各项性能指标进行全面检测和评估，发现问题及时进行调整和改进，最终确保构建的载体达到预期的使用效果。

总的来说，载体构建的基本流程包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。

在实际的载体构建过程中，需要严格按照这个基本流程进行操作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。

同时，也需要不断改进和优化载体构建的技术方法和工艺流程，提高构建质量和效率，推动载体构建技术的发展和应用。

载体构建

载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因2.目标片段的PCR扩增3.载体和目标片段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。

载体的选择实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。

根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。

举例如下：实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。

应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。

引物设计引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。

在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。

载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。

常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。

Flag标签：D Y K D D D D KGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG6XHis标签：H H H H H HCAC CAC CAC CAC CAC CACHA标签：Y P Y D V P D Y ATAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCTMyc标签：E Q K L I S E E D L这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。

因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。

翻译是从mRNA的5‘端开始，而蛋白质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子TAA之前。

构建表达载体的实验流程及其注意事项

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质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA）优点：省时省力
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质粒的电泳
Marker是酶切片段；质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
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质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
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汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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基因工程所用的酶
限制性内切酶从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
验证每步产物，设置对照以检查每一反应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》第二版，1996，科学出版社
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汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会：质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸迅速颠倒3次混匀后，置于冰上

酵母单杂交实验dna载体构建流程

酵母单杂交实验DNA载体构建流程1.引言酵母单杂交实验是一种常用的研究基因互作或蛋白相互作用的方法。

在酵母单杂交实验中，需要构建适合该实验的DN A载体。

本文将详细介绍酵母单杂交实验DN A载体的构建流程。

2.实验原理在酵母单杂交实验中，需要构建包含目标基因的D NA载体。

DN A载体的构建通常由以下几个步骤组成：2.1D N A提取首先，从参与实验的酵母菌株中提取D NA。

可以使用商业D NA提取试剂盒或自制D NA提取方法。

确保提取的D NA质量和纯度满足实验要求。

2.2扩增目标基因利用聚合酶链反应（P C R）方法，从酵母菌株的基因组DN A中扩增目标基因。

设计合适的引物，使扩增出的目标基因片段与DN A载体连接所需的限制性内切酶切位点相匹配。

2.3D N A片段连接将扩增出的目标基因片段与适当的DN A载体进行连接。

使用限制性内切酶切割目标基因片段和DN A载体，使它们产生互补的粘性末端，在适当的缓冲液中对其进行连接。

使用DN A连接酶催化连接反应，形成目标基因片段与D NA载体的连接产物。

2.4转化酵母菌将连接产物转化到酵母菌中。

通过电击法或化学法将连接产物导入酵母菌细胞中。

待酵母菌细胞经过恢复和选择后，转化出的菌落中将含有目标基因的DN A载体。

2.5验证构建成功进行酵母单杂交实验前，需要对构建的DN A载体进行验证。

可以通过限制性内切酶切、PC R扩增、测序等方法验证目标基因的正确连接和插入。

3.实验步骤根据上述原理，下面给出酵母单杂交实验D NA载体构建的详细步骤：3.1D N A提取-从酵母菌培养物中收集菌落。

-使用D NA提取试剂盒或自制方法提取DN A。

-检测D NA的质量和纯度，确保满足实验要求。

3.2目标基因扩增-根据目标基因序列设计引物。

-进行P CR反应，扩增目标基因片段。

3.3D N A片段连接-利用限制性内切酶切割扩增出的目标基因片段和DN A载体。

-在相关缓冲液中进行D NA片段连接反应。

构建载体的实验流程

构建载体的实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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载体构建操作流程

载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。

超螺旋结构应至少占到90%。

测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。

2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。

以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。

根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。

3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。

1)称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。

2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。

此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。

3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。

滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。

5)重复操作步骤。

6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。

7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。