载体构建流程
载体构建流程
载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。
PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。
在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。
过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。
二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。
现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。
Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
载体构建基本步骤
载体构建基本步骤
载体构建基本步骤
1.选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增
2.对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%）,若检测结果正确，测
序结果之后进行胶回收目的片段
3.通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体（PMD-18T）
4.转化DH5α，根据载体抗性涂板37度过夜培养
5.挑取阳性克隆进行PCR验证，PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并
提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序
6.测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段
7.对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段
8.将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化DH5
α，涂板37度过夜
9.挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕。
载体构建技术基本流程
载体构建技术基本流程
载体构建的基本流程：
1.载体质粒的选择；
2.引物设计；
3.PCR扩增；
4.载体和⽬标⽚段的限制性酶切；
5.连接转化；
6.挑取克隆提质粒验证。
重要的是，我们要为⼤家提供了⼀个载体构建流程模板，构建载体时希望⼤家可以创建⼀个word⽂档，按照我们提供的模板，将载体构建过程记录下来，便于后续优化。
后续⽂章中我们将举例告诉⼤家如何使⽤这个模板。
P.S. 构建表达载体时可以先连接T载体，可把步骤（12）酶切⽚段换成连接T载体后再对T载体进⾏酶切。
连接T载体会多花⼀天时间，但是可以使载体构建流程更顺利。
连接T载体与连接⽬的载体⽅法⼗分类似，本次举例不再涉及。
如果想要通过连接T载体过渡，可以⽹上搜索T载体相关产品说明书，了解T载体和连接T载体的⽅法。
引物设计的内容我们将放在接下来的⼀篇推送⾥，正在构建载体的⼤家，先尝试使⽤我们的载体构建流程模板吧。
载体构建流程课件
酶切常见问题
纯化酶切产物
• 通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产 物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
• 此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的 目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。 • 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
I 载体构建流程
提取mRNA
RT PCR
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR
转化
连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒 导入表达宿主
测试表达情况
提取mRNA
• 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
菌落PCR
• 此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。 • 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。 • 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。 • 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。
7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
基因表达载体的构建操作流程
基因表达载体的构建操作流程一、了解基因表达载体。
基因表达载体就像是一个小货车，它要把我们感兴趣的基因（就好比是货物）运到细胞这个大工厂里，然后让基因在里面表达出我们想要的东西。
这个载体得有一些特定的部件。
比如说启动子，这就像是货车的发动机，启动整个表达过程。
还有终止子呢，就像是刹车，告诉基因什么时候停止表达。
另外，标记基因也很重要，它就像是货车上的独特标志，方便我们在细胞里找到这个载体是不是成功进去工作了。
二、获取目的基因。
那我们怎么得到想要的目的基因呢？这里有好多办法。
有一种是从基因文库里面找，基因文库就像是一个超级大的基因超市，里面各种各样的基因都有。
我们可以像在超市里找东西一样，用一些特殊的方法把我们要的基因挑出来。
还有一种方法是通过反转录法，如果我们知道这个基因表达出来的RNA长啥样，就能通过反转录把它变成DNA，也就是我们要的目的基因啦。
另外，化学合成法也能用，不过这个比较适合那些比较小的基因片段哦。
三、构建基因表达载体。
当我们有了目的基因，就要开始构建载体啦。
这就像是给我们的货物装到货车上的过程。
我们要把目的基因和载体用同一种限制性核酸内切酶来处理，这种酶就像是一把特殊的剪刀，它能在特定的位置把基因和载体都剪开，而且剪出来的口子是可以互相配对的。
然后呢，再用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来，这个酶就像是胶水，把它们粘得牢牢的。
这样，我们的基因表达载体就初步构建好啦。
四、导入受体细胞。
构建好的载体得送到受体细胞里去才能发挥作用。
根据受体细胞的不同，导入的方法也不一样呢。
如果是细菌这样的细胞，我们可以用转化的方法，就像是偷偷地把东西送进去一样。
要是植物细胞的话，农杆菌转化法就比较常用啦，农杆菌就像是一个小邮差，把我们的载体送到植物细胞里面。
动物细胞的话，显微注射法是一种选择，就像是用一个超级小的注射器把载体注射到细胞里。
五、检测与鉴定。
载体送进去了，我们得看看它有没有成功呀。
首先就是检测目的基因是不是真的到了受体细胞里面。
载体构建的基本步骤
载体构建
一、原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤
5、载体与目的基因连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，
12-16h。
7、单克隆检测
（1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种。
载体构建流程
载体构建流程载体构建SOP流程:GenBank查询⽬的基因序列→根据ORF序列利⽤引物设计软件设计引物→表达⽬的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取⽬的基因→酶切⽬的基因和载体→分别纯化酶切的⽬的基因和载体并建⽴连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取⽬的基因/序列⽚段⼀.获取序列信息通过GENBANK数据和⽣物信息的⽅法设计⽬的基因或⽬的⽚段引物（shRNA、miRNA）。
PCR引物的设计原则：①引物应⽤核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成⼆级结构。
③引物长度⼀般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物⾃⾝不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使⽤碱基A。
在实际设计引物中由于ORF两末端序列本⾝的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。
过长的引物不容易打开其⼆级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物⼆聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
过短的引物特异性差，扩出其它不相关⽚段，最终很难得到⽬的⽚段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
要将⽬的基因定向克隆⾄相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能⼒⼤⼤降低，需依据NEB⽬录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。
⼆.制备模板1.分离⾼质量RNA：成功的cDNA合成来⾃⾼质量的RNA。
⾼质量的RNA⾄少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最⼤值。
现在实验室通常使⽤Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取⾼质量的⾮降解RNA。
Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。
常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。
2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。
可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。
3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。
这些序列将调控基因的表达方式和水平。
4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。
5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。
6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。
7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。
8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。
需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。
在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。
《载体构建流程》课件
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
vigs载体构建的基本流程
vigs载体构建的基本流程1.首先准备vigs载体构建所需的质粒。
Firstly, prepare the plasmid required for vigs vector construction.2.将目标基因插入到质粒的多克隆位点中。
Insert the target gene into the multicloning sites of the plasmid.3.通过PCR扩增目标基因。
Amplify the target gene by PCR.4.将PCR产物纯化和酶切。
Purify and digest the PCR product.5.选择合适的酶切位点和vigs载体进行连接。
Chooseappropriate restriction enzyme cutting sites and connect them with the vigs vector.6.进行连接反应。
Perform ligation reaction.7.转化大肠杆菌，分离获得重组质粒。
Transform E. coli and isolate the recombinant plasmid.8.进行PCR验证所得质粒。
Perform PCR verification of the obtained plasmid.9.测序确认目标基因已正确插入。
Sequencing to confirm the correct insertion of the target gene.10.提取质粒，获得高质量的vigs载体。
Extract the plasmid to obtain high-quality vigs vector.11.通过限制性内切酶消化鉴定重组质粒。
Identify the recombinant plasmid by restriction endonuclease digestion.12.进行质粒的DNA测序。
载体构建的基本流程
载体构建的基本流程载体构建的基本流程主要包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。
首先，设计方案确定是载体构建的第一步，也是最为关键的一步。
在这个阶段，我们需要明确载体的功能要求、外形尺寸、结构布局等设计参数，然后进行方案设计和优化，最终确定最佳的设计方案。
设计方案的确定需要充分考虑载体的使用环境、工作条件、使用寿命等因素，确保设计方案的科学合理性和可行性。
接下来是材料准备环节，这一步是实现设计方案的关键环节。
根据设计方案确定的材料要求，我们需要选择合适的材料，并进行采购和准备工作。
在材料选择方面，需要考虑材料的力学性能、耐磨性、耐腐蚀性、导热性、导电性等多个方面的要求，确保选择的材料符合设计要求。
在材料准备工作中，还需要对材料进行切割、成型、加工等工艺处理，以满足设计方案的要求。
随后是工艺加工环节，这一步是将设计方案和准备好的材料转化为具体载体的关键环节。
在这个阶段，我们需要进行组装、焊接、切割、打磨、涂装等一系列工艺加工工序，将材料加工成符合设计要求的零部件，并进行组装装配，最终形成完整的载体。
工艺加工环节需要严格按照设计要求和工艺规程进行操作，确保加工质量和工艺精度。
最后是性能测试环节，这一步是验证载体构建结果的关键环节。
在这个阶段，我们需要对构建好的载体进行功能测试、性能测试、可靠性测试等一系列测试工作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。
在测试过程中，需要对载体的各项性能指标进行全面检测和评估，发现问题及时进行调整和改进，最终确保构建的载体达到预期的使用效果。
总的来说，载体构建的基本流程包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。
在实际的载体构建过程中，需要严格按照这个基本流程进行操作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。
同时，也需要不断改进和优化载体构建的技术方法和工艺流程，提高构建质量和效率，推动载体构建技术的发展和应用。
载体构建
载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因2.目标片段的PCR扩增3.载体和目标片段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。
载体的选择实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。
根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。
举例如下：实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。
应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。
引物设计引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。
在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。
载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。
常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。
Flag标签：D Y K D D D D KGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG6XHis标签：H H H H H HCAC CAC CAC CAC CAC CACHA标签：Y P Y D V P D Y ATAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCTMyc标签：E Q K L I S E E D L这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。
因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。
翻译是从mRNA的5‘端开始，而蛋白质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子TAA之前。
酵母单杂交实验dna载体构建流程
酵母单杂交实验DNA载体构建流程1.引言酵母单杂交实验是一种常用的研究基因互作或蛋白相互作用的方法。
在酵母单杂交实验中，需要构建适合该实验的DN A载体。
本文将详细介绍酵母单杂交实验DN A载体的构建流程。
2.实验原理在酵母单杂交实验中，需要构建包含目标基因的D NA载体。
DN A载体的构建通常由以下几个步骤组成：2.1D N A提取首先，从参与实验的酵母菌株中提取D NA。
可以使用商业D NA提取试剂盒或自制D NA提取方法。
确保提取的D NA质量和纯度满足实验要求。
2.2扩增目标基因利用聚合酶链反应（P C R）方法，从酵母菌株的基因组DN A中扩增目标基因。
设计合适的引物，使扩增出的目标基因片段与DN A载体连接所需的限制性内切酶切位点相匹配。
2.3D N A片段连接将扩增出的目标基因片段与适当的DN A载体进行连接。
使用限制性内切酶切割目标基因片段和DN A载体，使它们产生互补的粘性末端，在适当的缓冲液中对其进行连接。
使用DN A连接酶催化连接反应，形成目标基因片段与D NA载体的连接产物。
2.4转化酵母菌将连接产物转化到酵母菌中。
通过电击法或化学法将连接产物导入酵母菌细胞中。
待酵母菌细胞经过恢复和选择后，转化出的菌落中将含有目标基因的DN A载体。
2.5验证构建成功进行酵母单杂交实验前，需要对构建的DN A载体进行验证。
可以通过限制性内切酶切、PC R扩增、测序等方法验证目标基因的正确连接和插入。
3.实验步骤根据上述原理，下面给出酵母单杂交实验D NA载体构建的详细步骤：3.1D N A提取-从酵母菌培养物中收集菌落。
-使用D NA提取试剂盒或自制方法提取DN A。
-检测D NA的质量和纯度，确保满足实验要求。
3.2目标基因扩增-根据目标基因序列设计引物。
-进行P CR反应，扩增目标基因片段。
3.3D N A片段连接-利用限制性内切酶切割扩增出的目标基因片段和DN A载体。
-在相关缓冲液中进行D NA片段连接反应。
载体构建操作流程
载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。
超螺旋结构应至少占到90%。
测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。
2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。
以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。
根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。
3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。
1)称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。
2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。
此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。
3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
5)重复操作步骤。
6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。
7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
酶切法构建载体的基本流程
酶切法构建载体的基本流程
设计引物：设计两个引物，分别匹配目标基因和载体的末端序列，引物中通常包含限制酶切割位点。
PCR扩增目标基因：使用设计好的引物对目标基因进行PCR扩增，得到足够的目标基因DNA。
限制酶切割：使用选择的限制酶对PCR扩增得到的目标基因和载体进行切割。
这一步骤是实验中的关键，确保酶切割的效果明确。
连接酶切末端：选择适当的连接酶，它可以将目标基因与载体的切割末端精确连接在一起。
进行连接酶反应，将目标基因与载体的切割末端连接。
此步骤是实现载体构建的关键环节。
转化：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程。
筛选：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。
载体构建流程
一．RNA反转录cDNA试剂盒：Takara PrimeScript® RT reagent Ki t操作步骤：提前调水浴锅至42℃；按下列组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行) 。
5×PrimeScript® Buffer(for Real Time) 2 μlPrimeScript® RT Enzyme Mix I 0.5 μlOligo dT Primer(50 μM) 0.5 μlRandom 6 mers(100 μM) 0.5 μlTotal RNA 360ngRNase Free dHO up to 10 μl2total 10μl轻柔吹打均匀；室温放置10min；42℃水浴锅中放置1h；冰中冷却2min；上述反应可根据条件在PCR仪中进行。
当需要使用的基因编码的RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将 RNA 溶液于65°C加热 5 分钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。
二．目的基因扩增引物设计原则：a)特异性：在cDNA中能且只能扩增出目的序列，不会扩增出其他序列；（通过blast检验）b)在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基；c)酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点，尽量避免使用平末端位点；所选位点在扩增目的片段中不能出现，可以使用primer premier对序列中的酶切位点进行分析。
三．PCR反应：4k以下的片段使用KOD Plus DNA 聚合酶，4k以上选择KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作；四．PCR产物回收：配制1%琼脂糖凝胶：称取一克琼脂糖，加入100ml TAE溶液中，煮沸至凝胶完全溶解。
待温度降至60°C左右时(刚好不烫手)加入8μl Goodview，摇匀，将凝胶溶液倒入槽内，冷凝后备用。
将反转录样品与Loading Buffer混匀，加入凝胶孔内，最右端加Marker，固定电压120V，跑半小时左右。
载体构建操作流程
载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。
超螺旋结构应至少占到90%。
测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。
2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。
以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。
根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。
3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。
1)称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。
2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。
此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。
3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
5)重复操作步骤。
6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。
7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
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载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。
PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。
在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。
过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。
二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。
现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。
Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。
RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。
蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
制备好的RNA应立即RT合成cDNA，若不马上使用应立即存于-80℃冰箱。
也可以在细胞或组织加入Trizol 试剂后立即冻入-80℃冰箱，待用时再制备。
我们通常都是从组织或细胞中提取RNA。
从细胞提取RNA是要掌握细胞的量，注意Trizol加量，从组织中提取RNA研磨过程液氮一定不能干，尽量研碎，速度要快，提完后立即进行下步反应。
对扩增片段较长、丰度较低、复杂度较高的片段，对RNA质量要求很高，可采取oligo dT纤维柱制备较纯的mRNA,有利于制备高质量的cDNA。
防止RNA酶污染的措施：所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间；塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）；我们实验室采取连续高压两次，效果也不错；有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干；配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌；操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换；设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
2.RT制备cDNA:（1）反转录酶的选择a．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
b．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
c．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
d．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
（2）合成cDNA引物的选择a．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
b．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
c．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR 扩增。
三.扩增目的片段高保真酶扩增目的片段，优化PCR条件获取特异的高保真的条带,由于此步为获取正确的目的基因，所以尽量避免PCR的突变格外重要。
其中所采取的措施有：使用高保真酶、循环次数控制在25cycle左右、引物设计合理等。
PCR常出现三种情况：1. 假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
2. 出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
3. 什么条带都没有。
出现状况的原因和解决方法：1. 假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染。
2. 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
3. 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温度太高，模板的质量问题等。
解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温度或做个梯度，摸一下条件。
可以相应地提高Mg2+的浓度。
如果再扩不出来可以考虑二次PCR。
II. 获取阳性克隆一.酶切1. 将双酶切的目的基因定向克隆入载体并转化E.coli。
使用高质量无核酸酶污染的限制性内切酶（如NEB，fermentas）,20μl体系（2μgDNA）加0.3μl 10U/μl的酶消化1.5小时，可根据DNA浓度、酶的活力、酶的量、反应时间可适当改变条件，PCR产物酶切时间可增至2-3小时。
酶切反应时避免星活性，导致星号活性的因素：较高甘油浓度（不超过10%）、低盐浓度（<25 <mM))、高pH值〉8.0)、内切酶用量过大>100u/ug DNA、有机溶剂、其它二价离子。
2. 双酶切两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切；温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的；只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性；先用难切的酶切，电泳鉴定确定切开，再用第二个酶切，以防单酶切，也可以去磷酸化。
3. 单酶切一定要去磷酸化。
4. 酶切跑电泳时，要酶切前和酶切后一起跑，有必要时跑个Marker。
5. 酶切完，纯化时为了提高纯化回收率，可以适当地外加一点NaAc，注意NaAc的pH 值要在5.2。
常见的问题及原因二.连接对于有效的连接体系来说合适的载体和目的基因分子数比值控制在一定范围内是有必要的，这个比值为1：3-1：10，较大的片段可适当提高比值。
连接时，PCR产物浓度可以尽可能的大。
连接通常是16℃或4℃过夜连接。
PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。
切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
三.转化复苏对于氨卞和氯霉素抗性不是必须的，但对卡那霉素则是必须的，42℃热激对转化率的影响较大，DH5A/TOP10转化率较高可适当少加些产物。
对于慢病毒载体在DH5A/TOP10中易发生重组导致克隆失败，可选择Stbl系列的感受态细胞转化，以确保克隆的正确性，但要注意其转化率较低的问题，可以采用电转化或优化感受态的方式。
基本步骤：（1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。
（2）取5μl连接产物或0.5～2μl质粒加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。
在冰上放置30分钟。
（3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。
快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。
（4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。
（5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。
注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。
（6）将平板置于室温直至液体被吸收。
（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
转化常出现的结果及解决方法：（1）板上什么都没有长出来：首先要考虑感受态细胞有没有问题，可以将感受态细胞涂于无抗性的LB培养板上，看是否长；再者要看一下抗性有没有搞错；最后再确定一下是不是去磷酸化去过头了。
（2）长的满板都是菌落：首先要考虑感受态细胞有没有被污染，验证方法是将感受态细胞涂于有抗性的板上，看是否会长菌；再考虑是否是载体酶切不完全，单酶切。