cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA和基因组文库DNA的构建
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
名词解释cdna文库
CDNA 文库
CDNA 文库是一种 cDNA(互补 DNA) 文库，它包含了生物体中所有基因的 mRNA 转录本的互补 DNA 序列。
在 CDNA 文库中，mRNA 被逆转录成 cDNA，然后被克隆到载体中，最终形成一个包含所有基因信息的文库。
CDNA 文库的构建过程通常包括以下步骤:
1. 从生物组织中提取 mRNA，并去除 rRNA 和 tRNA 等非编码RNA。
2. 将 mRNA 逆转录成 cDNA，使用逆转录酶将 mRNA 转录成cDNA，并在此过程中添加适配体，以产生特定长度的 cDNA 片段。
3. 将 cDNA 片段连接到载体上，通常使用质粒载体。
4. 将连接好的载体转化到大肠杆菌中，并筛选出阳性克隆。
5. 对阳性克隆进行测序和分析，以确定其序列信息。
CDNA 文库在基因组学研究中具有广泛的应用，例如:
1. 基因克隆：通过 CDNA 文库，可以克隆出感兴趣的基因，并对其进行进一步的研究。
2. 基因表达分析：通过比较不同组织或条件下的 CDNA 文库，可以分析基因的表达情况，了解基因在生物体内的功能和调控机制。
3. 基因组测序：通过 CDNA 文库，可以对生物体的基因组进行测序，以确定其基因组序列信息。
cdna文库的构建步骤
cdna文库的构建步骤CDNA文库是基因组学和转录组学研究中非常常见的技术，它可以用来快速鉴定不同组织或不同生长条件下基因表达的变化情况。
下面将介绍CDNA文库的构建步骤。
一、RNA提取RNA提取是构建CDNA文库的第一步，它是从不同组织或生长条件下采集的样品中提取出RNA。
RNA提取需要注意以下几点：1. 样品必须在冰上保存，并尽可能快地进行处理。
2. RNA提取要使用无菌工具和试剂，并严格遵守操作规程。
3. RNA提取要避免DNA污染，可使用DNase对RNA进行处理。
4. RNA质量要进行检测，以保证后续实验的可靠性。
二、反转录反转录是将RNA转化为cDNA的过程。
反转录需要注意以下几点：1. 反转录试剂必须新鲜，并且使用前应该预先热处理。
2. 反转录反应时间和温度要根据实验需求进行调整。
3. 可以选择使用随机引物或寡聚dT引物作为反转录引物。
三、二代测序前的PCR扩增PCR扩增是将cDNA扩增为足够的量以进行二代测序的过程。
PCR扩增需要注意以下几点：1. PCR反应体系要严格控制，避免引物和模板过量。
2. PCR反应时间和温度要根据实验需求进行调整。
3. 可以选择使用高保真PCR酶，以保证扩增产物的准确性。
四、文库构建文库构建是将PCR扩增产物连接到载体上，形成完整的CDNA文库的过程。
文库构建需要注意以下几点：1. 选择合适的载体，如pBluescript II SK+、pUC19等。
2. 连接PCR扩增产物时要控制连接比例，避免连接过多或过少。
3. 连接后可以进行转化、筛选和纯化等步骤，得到CDNA文库。
五、二代测序二代测序是对CDNA文库进行高通量测序的过程。
二代测序需要注意以下几点：1. 选择合适的平台和测序模式，如Illumina HiSeq、NovaSeq等平台。
2. 测序深度要根据实验需求进行调整，以保证数据质量和覆盖度。
3. 测序后得到原始数据后，需要进行质控、去除低质量数据、拼接等步骤，得到高质量的测序数据。
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
cDNA 文库的构建
第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。
cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。
cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总RNA 中所占比例很小，因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。
通过降低rRNA和tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。
目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与mRNA 的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA ，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。
1．mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA 的大小，总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。
2．mRNA 的丰度高丰度mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90% 。
低丰度mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。
3．mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA ，可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。
cDNA文库制备非常详细
cDNA⽂库制备⾮常详细cDNA⽂库组标准流程⼀. Total RNA的提取 (2)⼆. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)⼋．pBlueScript cDNA库扩增 (18)⼀.Total RNA的提取1.试剂配制准备⼯作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均⽤锡纸包裹⼝部，置于烤箱内,180℃，烤6⼩时。
2、50ml/1.5ml离⼼管、枪头等塑料制品⽤0.1‰DEPC⽔浸泡过夜后，121℃20mins ⾼压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳⼦⽤3%双氧⽔处理。
4、常⽤试剂及其配⽅：▲DEPC⽔：在1000ml去离⼦⽔中加⼊100ul DEPC, 静置过夜后⾼压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三⽔合柠檬酸纳22.94g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。
▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。
▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC⽔定容⾄250ml，室温放置备⽤临⽤前加β-巯基⼄醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC⽔定容⾄100ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g⽤NaOH调PH值⾄8.0，定容到100ml，⾼压灭菌，室温放置备⽤▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml⽤NaOH调PH值 6.5 , DEPC⽔定容到1L，室温避光放置备⽤。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
cDNA文库的构建
3. mRNA 的纯化
对高丰度的 mRNA 来讲，其所对应的 cDNA 克隆很NA 之前不需要进一步纯化和富集。分离低丰度 mRNA 通常有如下两种方法：①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。
4. mRNA 完整性的确定
确定 mRNA 完整性的方法有三种：
① 直接检测 mRNA 分子的大小；
② 测定 mRNA 的转译能力；
③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。
二、 cDNA 的合成和克隆
1. cDNA 第一链的合成
用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。
3. 将 cDNA 重组到载体上
简述cdna文库的构建过程
从RNA转录到cDNA：构建cdna文库的全过程cDNA文库是研究生命科学的一个重要工具。
在研究基因表达、肿瘤学、医学遗传学等方面，cDNA文库都有着重要的应用价值。
cDNA文库的构建过程是一个复杂而细致的工作，需要精确的实验操作和仔细的分析。
本文将从RNA提取、反转录、PCR扩增等方面全面介绍cDNA 文库构建的全过程。
第一步：RNA提取与质量检测cDNA文库的构建前提是需要RNA，因此首先需要从细胞或组织中提取RNA。
RNA提取是一个关键的步骤，需要注意的是，样本中的RNA 应该要完整、高纯度、无分解。
提取的RNA要经过质量检测，主要检测指标为RNA完整性和质量。
第二步：RNA反转录RNA反转录是将RNA转录成cDNA的过程。
该步骤中需要用到反转录酶、dNTPs以及随机引物等试剂。
将RNA与反转录试剂混合，进行酶促反应，即可将RNA转录成cDNA。
此外，为了避免DNA组合不完整，要进行加热反应。
反转录后的cDNA还需进行纯化和浓缩。
第三步：PCR扩增得到纯化后的cDNA样品，需要进行PCR扩增。
根据实验设计的需要，设计引物，进行PCR扩增。
PCR扩增主要有两步，第一步是降温，使引物与cDNA结合；第二步是升温，进行DNA链的扩增。
扩增完毕后，进行等电泳检测，筛选出符合条件的基因，即可进行下一步操作。
第四步：构建文库接下来是将PCR扩增的产物进行纯化和接头处理，使其成为适合测序的文库。
一般都是采用pUC 18或pGEM T系列质粒作为载体，将PCR产物与载体进行连接，构建cDNA文库。
文库构建完成后，还需进行质控、存储和测序等后续处理。
总之，cDNA文库的构建需要有系统性的实验设计、操作及仔细的数据记录，每一个步骤都需要严格掌控。
只有将每一个步骤都做好，才能得到合格的cDNA文库，为后续的实验提供有力支撑。
634901SMARTcDNA文库构建实验流程（clontech）
634901SMARTcDNA⽂库构建实验流程（clontech）操作⼀览(PT3000-2)本操作⼀览仅为实验流程，对于初⽤者，请在使⽤操作⼀览前仔细阅读SMART TM cDNA ⽂库构建试剂盒(Cat. No. 634901)的说明书。
A. 第⼀链cDNA(fs cDNA)合成1. 在0.5-ml 离⼼管中混匀以下试剂：1–3 µl RNA 样本(对照反应，使⽤1 µl 的对照RNA)1 µl SMART? IV Oligonucleotide1 µl CDS III/3' PCR Primer如果总体积<5 µl时，⽤⽔补齐⾄5 µl。
2. 混匀试剂并瞬时离⼼。
3. 72°C孵育2 min。
冰上冷却2 min。
4. 瞬时短暂离⼼。
5. 向每管反应中加⼊以下试剂：2.0 µl 5X First-Strand Buffer1.0 µl DTT (20 mM)1.0 µl dNTP Mix (10 mM)1.0 µl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase10.0 µl 总体积6. 使⽤枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离⼼。
7. 42°C孵育1 hr。
之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进⾏。
8.引物延伸合成ds cDNA分别向反应管中加⼊1 µl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进⾏步骤C。
B. LD PCR扩增合成cDNA1. 在⼀个新的0.5-ml 离⼼管中混匀以下试剂：2 µl First-Strand cDNA (from Step A.7)80 µl Deionized H2O10 µl 10X Advantage2 PCR Buffer2 µl 50X dNTP Mix2 µl5' PCR Primer2 µl CDS III/3' PCR Primer2 µl 50X Advantage2 Polymerase Mix100 µl总体积2. 使⽤枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离⼼。
cdna文库的构建过程
cdna文库的构建过程
cdna文库的构建过程包括以下步骤：
1. RNA提取：从目标细胞或组织中提取总RNA。
2. mRNA纯化：通过亲和层析或磁珠法将mRNA从总RNA中分离出来。
3. 反转录：利用反转录酶将mRNA转录成cDNA。
4. 修饰：为cDNA末端加上适当的连接器，如poly(A)尾部，便于后续PCR扩增。
5. PCR扩增：将cDNA扩增，并通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR）共有两种方法：one-step PCR 和two-step PCR。
6. 克隆：使用克隆技术将cDNA插入载体中。
7. 测序：对文库中的克隆进行测序，得到cDNA序列。
8.数据分析：通过基因注释、比对等方法分析得到的cDNA序列，进一步研究其功能和相关生物学过程。
以上是一般情况下的cdna文库构建过程，不同实验室根据具体需求会有部分不同的处理步骤和程序，如加入不同的连接器或使用不同的测序技术等。
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
cdna文库的构建步骤
CDNA文库的构建步骤一、引言在分子生物学和基因组学研究中，建立cDNA文库是一项重要的实验技术。
cDNA文库是从mRNA中合成的互补DNA（cDNA）的集合，它能够反映细胞中mRNA的表达情况。
本文将详细探讨cDNA文库构建的步骤和流程。
二、cDNA文库构建步骤2.1 RNA提取与纯化在构建cDNA文库之前，首先需要提取和纯化所需基因表达的RNA，这是启动构建cDNA文库的关键步骤。
1.准备细胞样本或组织样本。
2.使用适当的方法（例如TriZol法、RNA纯化试剂盒）提取总RNA。
3.通过离心等手段去除DNA和蛋白质等杂质。
4.使用酶切RNA的方法去除rRNA等非编码RNA。
2.2 逆转录合成cDNA逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，这是构建cDNA文库的关键步骤之一。
1.准备RNA模板和引物，引物可以是随机引物或特定引物。
2.将RNA样本与引物混合，在特定条件下进行反应。
3.添加逆转录酶（如Reverse Transcriptase），逆转录酶能合成cDNA的互补序列。
4.根据反应体系的要求进行反应，通常涉及温度和时间的控制。
5.利用热敏聚合酶（如Taq DNA Polymerase）可加热光敏不稳定的逆转录酶，从而停止逆转录反应，并保持产物的合成。
2.3 cDNA文库构建cDNA文库的构建涉及PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，下面详细介绍。
2.3.1 PCR扩增1.准备扩增反应液：包括cDNA模板、引物（正向引物和反向引物）、dNTPs和聚合酶等。
2.设置PCR扩增条件，包括温度、循环数和时长等。
3.进行PCR扩增反应，其中cDNA模板将作为DNA合成的起始物，引物将提供扩增的特异性。
2.3.2 酶切1.使用限制性内切酶对扩增产物和载体进行酶切。
2.确定酶切产物的大小和酶切位点。
2.3.3 连接1.准备连接试剂盒和连接系统。
2.混合酶切产物和合适的载体，进行连接反应。
3.控制反应条件，如温度和时间。
cdna文库的构建
cdna文库的构建
首先需要提取出RNA分子的互补DNA（cDNA），然后将其克隆到载体上，形成一个cDNA文库。
具体的步骤如下：
1. RNA提取：从组织或细胞中提取RNA。
2. 逆转录：利用逆转录酶将RNA转变成cDNA。
逆转录酶可以用几种不同的方法，包括反转录PCR方法和反转录特异性引物的方法。
3. 双链cDNA合成：将一端的oligo dT引物与头部的mRNA 低复杂度区域杂合，随后，通过使用逆转录酶(polymerase)来合成第一条链，然后再合成第二条链，以得到双链cDNA。
4. 手工或机器克隆：将cDNA克隆到载体中。
手工克隆使用限制性内切酶和连接酶来插入cDNA，而机器化克隆则使用高通量自动克隆技术。
5. 图书馆筛选：初步筛选文库，以分离包含所需基因的克隆。
6. 验证和测序：最后，通过验证所得克隆的插入片段的尺寸和序列，并使用测序技术对其进行测序。
总的来说，构建cdna文库需要耗费较多的时间和精力，但它
是研究基因表达的重要手段。
对于生物学、医学、农业等领域的研究都具有非常重要的意义。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。
自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。
通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
它是发现新基因和研究基因功能的工具。
1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。
真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。
而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。
为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。
所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。
2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN 的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。
对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。
简述cDNA文库构建的方法
简述cDNA文库构建的方法1．1 mRNA纯化构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。
mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。
从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。
正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。
方法有三种：·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。
非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。
用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。
·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。
退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。
·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。
移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。
在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。
1.2cDNA的合成与克隆1.2.1 cDNA第一条链的合成所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。
目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。
两种酶都无3’－5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。
全长cDNA文库的构建方法
全长cDNA文库的构建方法全长cDNA文库的构建是基因组学研究中的重要步骤，它能够捕获一个生物体所有的转录本，为基因表达、功能研究和基因组注释提供有用的信息。
下面将介绍一种常用的全长cDNA文库构建方法。
样本准备需要准备含有目标转录本的细胞或组织样本。
这些样本可以是新鲜或冷冻的，只要它们的质量和数量能够满足后续步骤的需求。
对于一些需要特殊处理的样本，如动物组织，需要按照相关法规进行采集和处理。
RNA提取从样本中提取高质量的RNA是构建全长cDNA文库的关键步骤。
常用的RNA提取方法是Trizol法或RNAiso Plus法。
这些方法能够有效地分离出RNA，并且可以去除大部分的蛋白质和基因组DNA。
在提取RNA后，需要对其质量和浓度进行检测，以确保其适用于后续步骤。
反转录将RNA进行反转录，生成cDNA，是构建全长cDNA文库的另一个关键步骤。
常用的反转录方法是 oligo(dT)引物法和随机引物法。
oligo(dT)引物法利用了mRNA特有的poly(A)尾，能够捕获mRNA进行反转录。
随机引物法则利用了引物结合在RNA的任意位置，也能捕获全长的cRNA。
在反转录完成后，需要检测cDNA的浓度和特异性，以确保其适用于后续步骤。
文库构建在得到全长cDNA后，需要将其克隆到载体中，构建成文库。
常用的载体有质粒、噬菌体和BAC等。
这些载体都能够在细菌中进行复制和扩增，使得文库的规模得以扩大。
在构建文库时，需要确保cDNA的插入率和多样性，以避免后续步骤中的误差。
文库质量检测在构建完全长cDNA文库后，需要对其质量进行检测。
随着生物技术的不断发展，基因组学和蛋白质组学研究取得了突破性进展。
在此基础上，研究者们开始mRNA转录本的全长序列，即cDNA。
cDNA文库的构建对于基因表达、功能研究和比较基因组学等领域具有重要意义。
本文将探讨全长cDNA文库的构建方法及其应用研究。
全长cDNA文库构建的关键问题包括如何获取全长的、完整的mRNA转录本，以及如何将这些转录本有效克隆到表达载体中。
简述cDNA文库构建的方法
简述cDNA文库构建的方法1．1 mRNA纯化构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。
mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。
从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷,这个序列被称为poly(A）尾巴,是mRNA分子特有的而其他主要RNA没有,poly(A）尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo （dT））杂交.正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来.方法有三种：·寡脱氧胸苷酸亲和层析:即分离mRNA的标准方法,将一个寡脱氧胸苷酸(12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火.非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。
用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来.·溶液杂交:本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱,而是将基质直接加到总RNA溶液中。
退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。
·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。
移去磁分离器,加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。
在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。
1.2cDNA的合成与克隆1.2。
1 cDNA第一条链的合成所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。
目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶（reverse transcriptase），另一种是鼠源反转录酶.两种酶都无3’－5'外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性，鼠源的具有相对较弱的RNAaseH酶活性。
cdna文库构建过程
cdna文库构建过程
cdna文库构建过程
cdna文库构建是一种从逆转录提取mRNA，并将其转化成可用于克隆的DNA片段的方法，并将其用于测序等分子生物学研究。
下面の流程介绍了cdna文库构建的步骤：
1. 样本准备：收集合适的活菌样本，细胞经过lysis处理，可以获得核酸提取液，用于cdna文库构建。
2. 微小RNA提取：将液体样本经过cDNA合成，利用内源Oligo dT链条的帮助，在rRNA与mRNA之间断开，就可以获得微小RNA。
3. cdna合成：将液体样本经过反转录，也就是mRNA转化为cDNA，就可以获得cdna文库。
4. 再次纯化：将cdna文库经过再次纯化，去除反转录产物及其他污染源，经过QC后，就可以开始克隆。
5. cDNA克隆：将cdna文库再次纯化的片段植入到克隆载体上，就可以获得cDNA克隆文库。
6. 测序：最后将克隆文库经过测序，就可以获得cdna序列，进行进一步的分子生物学研究。
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cDNA文库构建原理以及技术路线
CDNA文库1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA，重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。
CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势，从而使它在个体发育，细胞分化，细胞周期调控2. CDNA文库得质量（1）文库的代表性CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息（即mrna种类），它是体现文库质量地最重要标本。
文库地库容量，它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。
具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。
具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数N=ln(1-p)/ln(1-n/t)，P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率，通常设为99％，N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数，n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数，t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数，以人类细胞为列，人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种，具体到某一特定类型地细胞中，表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15％。
因此对于巨大部分地人类细胞，每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种，全体mrna序列地总拷贝约为500000个，而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。
因此，用人类细胞来构建CDNA文库时候，要以99％概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息，构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5)一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10（6）以上的库容量3．MRNA是由5‘端非编码区，中间地编码序列和3’端非翻译区。
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cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega)：（1）20 ul 10×DNA Polymerase I buffer（2）6 ul 10 mM dNTP(自己配制)（3）xul dd H2O（4）1 ul RNase H(2 U/ul)（5）10 ul DNA Polymerase I(10 U/ul)总体系为200 ul。
2. 混匀后，16℃反应2.5小时。
3. 70℃灭活10分钟。
4. 反应完成后，得到200 ul cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上。
5. 取2 ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。
同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
三、双链cDNA末端补平1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega)：（1）6 ul 10 mM dNTP（2）2 ul T4 DNA Polymerase(8.7 U/ul)（3）2 ul BSA(10 mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物，37℃反应至少30分钟，然后75℃灭活10分钟。
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后，常温下13 000 g离心5分钟。
4. 离心后，吸取上清于另一1.5 ml eppendof管中，加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后，常温下13 000 g离心5分钟。
5. 吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V 3M NaAc(PH5.2)和2.5 V预冷的无水乙醇,混匀，-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA。
6. 第二日，将昨日沉淀物在4℃，13 000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA。
7. 离心完毕，弃上清,加入1 ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13 000 g离心5分钟。
8. 离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味。
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
四、PCR纯化试剂盒操作流程1. 溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2. 向200 ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3. 加入spin column中，13 000 rpm离心1 min。
4. 加入0.75 ml buffer PE，13 000 rpm离心1 min。
5. 13 000 rpm，再离心1 min。
6. 将spin column放入一新的离心管中，加入50 ul buffer EB，静置10 min。
7. 13 000 rpm离心2 min。
8. 加入30 ul buffer EB，静置10 min。
9. 13 000 rpm离心2 min。
10. 加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
五、EcoR I adaptor 加接1. 往双链cDNA沉淀中加入9 ul EcoR I adaptor(400 ng/ul)，4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀。
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂：（1）1.2 ul 10×Ligase Buffer（2）1 ul 10 mM rATP（3）1 ul T4 DNA Ligase(4 U/ul)3. 混匀后，4℃连接3days或者8℃过夜连接。
六、双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase。
2. 稍微离心使反应物集中至管底，室温下放置5分钟,然后加入下列试剂：（1）1 ul 10×Ligase Buffer（2）1 ul 10 mM rATP（3）6 ul dd H2O（4）1 ul T4 PNK(10 U/ul)3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟。
4. 稍微离心使反应物集中至管底。
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂：（1）4 ul Xho 10×Buffer（2）2 ul BSA（3）5ul ddH2O（4）8ul Xho I (10 U/ul)6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟。
7. 反应完成，双链cDNA合成完毕。
置于4℃准备回收。
七、胶回收cDNA1. 配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2 ul EB/300 ml 胶。
2. 取4℃保存样品上样，40 ul/孔。
3. 电泳50 V，1 h。
4. 紫外灯下分别切下500~1 kb、1.0-2.0 kb及2.0-4.0 kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5 ml离心管中。
5. 称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100 mg胶中加入300 ul buffer QXI）。
6. 50℃水浴数分钟，至胶完全融化。
用手指弹QIAEX II 使重悬，每管中加入5 ul QIAEXII。
7. 50℃水浴10 min，每隔2 min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮。
8. 4℃，13 000 rpm，30 s （弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）。
9. 加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬。
10. 离心并去上清（同操作8）。
11. 加入500 ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30 s，去上清。
12. 再加入500 ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30 s，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清。
13. 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10 ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5 min，13 000 rpm，30 s。
吸上清，冰上放置。
14. 取1 ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1 kb ladder）及DNA含量标准（10 ng，20 ng）作对照。
15. 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项1. RNA 的提取（例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定）。
2. 要构建一个高质量的cDNA 文库，获得高质量的mRNA 是至关重要的，所以处理mRNA 样品时必须仔细小心。
3. 由于RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA 很重要。
4. 文库构建要选择合适的载体，常规用的是λ-噬菌体，这是因为λ-噬菌体DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。
5. 胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
6. 胶回收时电压要稳定。
其他一、cDNA构建成功关键因素1. 保证获得数量足够的高质量的起始RNA构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。
老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。
虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。
至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。
如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。
2. 反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。
反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。
反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。
少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。
Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。