3第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法习题及答案
第三章细胞生物学研究方法习题一、选择题1 正常细胞培养的培养基中长需加入血清，主要是因为血清中含有（C ）A. 氨基酸B. 核酸C.生长因子D.维生素2 冷冻蚀刻技术主要用于（A ）。
A.电子显微镜B. 光学显微镜C.原子力显微镜D.激光共聚焦显微镜3 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪种技术构建的？（A ）A. 细胞融合B. 核移植C. 病毒转化D. 基因转移4 关于光镜的使用，下列哪项有误？（C ）A. 观察标本时，应双眼同时睁开、双手并用B. 按照从低倍镜到高倍镜到油镜的顺序进行操作C. 使用油镜时，需要在标本上滴上香柏油，将聚光器降至最低，光圈全部开放。
5 为了实现细胞内某种蛋白质的亚细胞精细定位，可对该蛋白进行标记，下面哪种标记可行（C）A. GFP标记B. 免疫荧光标记C. 免疫电镜技术D. 荧光染料直接染色6 为了提高雌性乳牛出生的比例，可在体外将携带X染色体和Y染色体的镜子分离开，进行人工授精。
最好的分离方法使（A ）A. 流式细胞分选术B. 离心技术C. 细胞电泳D. 层析7 为了观察病毒，可通过何种方法进行观察（B ）A. 相差显微镜观察B. 负染色后用电镜观察C. 激光共聚焦显微镜观察D.以上都错8 以下哪些技术一般不用于分离活细胞？（CD ）（可多选）A. 流式细胞技术B. 细胞电泳C. 超速离心D.差速离心9 某研究生为了研究一特定膜蛋白的胞质结构域的功能，需要制备和分离外翻的细胞膜泡，为了获得无污染的外翻膜泡，下列选项中，哪些是他在实验中有可能使用到的?（BD ）（可多选）A. SDSB. 凝集素C.流式细胞仪D. 柱层析10 绿色荧光蛋白GFP（Green Fluorescent Protein）基因与目的基因融合后，转入细胞后可以（ABD ）（可多选）A. 检测融合蛋白在细胞中的准确定位B. 检测目的基因所编码的蛋白在细胞中的含量C. 检测目的基因所编码的蛋白在细胞中的分子结构D. 检测目的蛋白质在细胞中的表达量E. 以上答案都不对二、填空题1 流式细胞仪可以定量测定细胞中的DNA，RNA或某种特异蛋白的含量及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量。
细胞生物学研究方法
yy
6
公司名称
举例：过氧化物酶 peroxidase ,(POX) 1.原理
血细胞中的POX能分解H2O2而释放出新生态氧，后者 可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。 2.正常阳性细胞: ①. 中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。 ②. 嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。 ③. 单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。
› 转染（transfection）：将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。
› 在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现 上调细胞中的目的基因表达。
yy
29
公司名称
（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要 方式
yy
30
› 应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋 白之间的相互作用。
› 原理：当荧光工体与荧光受体分子彼此接近而供体的发射 光谱与受体的激发光谱重叠时就会通过偶极子相互作用， 实现了能量向邻近的受体分子转移，一种非辐射能量跃迁， 通过荧光显微镜可以观察到这种改变。
› 特点：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光 光谱与受体的激发光谱要重叠。
› 缺点：只能说明两个蛋白之间有相互作用的结构基础，并不标示这两 个蛋白在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞中确实存在，需 要用免疫共沉淀进行验证。
yy
34
公司名称
yy
35
公司名称
› （三）吞噬体展示可筛选存在相互作用的蛋白质 › 被筛选蛋白cDNA与噬菌体的衣壳蛋白DNA构建成融合基因，使被筛
›
光或改变本身荧光的发射波长与强度，从
而
›
通过荧光检测可以显示该离子的量。
细胞生物学第三章细胞生物学研究方法知识讲解
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
步骤
– 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 – 常规制片 – 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) – 暗盒暴光或自显影 – 显影、定影、观察
与显微自显影区别
敷胶要单层晶体 暴光时间长
定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收， 测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞 内的含量 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 BACK
0.2 m
电子显微镜技术(Electro microscopy)
0.2nm
扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)
3nm, 0.7nm
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope)
（侧0.1-0.2，纵0.001nm）
BACK
光学显微镜技术
自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基 绿、吖啶橙)
优点：
– 多种成分定位 – 只有激发荧光可成像，敏感度高 – 染色简便 – 标本呈彩色图像 – 固定细胞和活细胞
数字成像显微技术
图像后期处理，提高信/噪比、放大信号 摄像机和计算机 原理：摄取同一区域多幅图像，信号经
计算机放大、假信号减弱或消除
BACK
扫描遂道显微镜原理
量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电 极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠)
当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电 流(隧道电流)，且Iexp(-2Kd)，d为针尖与样品 间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定
扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产 生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从 而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
第3章 细胞生物学的研究方法1(显微镜技术)
显微镜技术
显微镜的成像原理
无论是何种显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素：照 明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统。
光源 聚光镜 样品 物镜
光源 透镜
射线扫描器
聚 光 镜
样品
目镜
电视屏观 察图像
直接成像
荧光屏观察 图像
光学显微技术
在细胞生物学的领域中，光学显微镜作为研究细胞显微
结构的重要工具和手段是应用最早也是最广的一种。光学显 微镜是利用可见光作光源，通过一组玻璃透镜包括目镜、物 镜、聚光镜放大被观察物体，提高分辨率的仪器。分辨率指： 人眼在25厘米的明视距离处分辨物体结构最小间距的能力。
载物台的上方：
光源
长焦距聚光器 载物台的下方： 物镜 应用：直接对培养的 细胞进行观察
荧光显微镜
原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线， 并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光 可见光 红外光
λ short
long
基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
透射电镜生物标本制备过程 (自学）
(1)取材
(2)固定:防止产生结构改变。 戊二醛：在蛋白质分子之间形成共价键, 将它们交联在一起。 四氧化锇：除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。 (3)脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本 不能含水。梯度乙醇。 (4)包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、 电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 (5)切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细 胞的1/200厚度。 (6)染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力 弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染 色。重金属浸染。
第三章细胞生物学研究方法演示文稿
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染色(staining)
大多数细胞总重量的70%是水，对可见光几乎是透明的 ，只有很少的内含物不透光。染色的目的就是给细胞的 不同组分带上可区别的颜色特征。
19世纪初，发现某些有机染料可染生物组织，并对细胞 特殊部位的着色具有选择性。如苏木精对负电荷分子 有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料 如伊红可使细胞质染色；苏丹染料在脂肪中的溶解度比 在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪 着色。但对许多染料的特异性染色机理尚不清楚。
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
第三页，共89页。
一、光学显微镜技术（light microscopy)
最早的光学显微镜是1590年Janssen和他的侄子共同研 制的。其后，Robert Hooke和Leeuwenhoek对光学显微
镜的分辨本领进行了极大的改进，由此发现了细胞。
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相差显微镜的光学 部件及光线通路
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相差显微镜观察的活细胞
倒置显微镜
倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样，所不同的 只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。
前者置于载物台之下，而后者在载物台的上方。集光 器与载物台之间的工作距离提高。
负染原理：又称阴性反差染色，借助染色剂的衬 托，增加背景对电子的散射，使样品相对地透过 较多的电子，最后在荧光屏上形成暗背景下的“ 亮像”。
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●冰冻断裂复型和冰
第三章细胞生物学技术
构造上，相差显微镜不同于光镜之处：
1、环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器 的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
2、相位板（annular phaseplate）在 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将 直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased.
暗视野显微镜光学显微镜受照射光波长的限制在可见光下其分辨极限只有02m即使在紫外光下最大分辨率也只有01要观察更精细的结构只有借助分辨率更高的电子显微镜
第三章 细胞生物学研究方法
Chapter 3 Techniques in Cell Biology
第一节 显微技术
细胞生物学的建立和发展得益于光学显 微镜的发明； 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能 的研究达到了新的水平。
Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrulastage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.
《细胞生物学》考研习题解析(第三章 细胞生物学研究方法和技术)
第三章细胞生物学研究方法和技术一、名词解释荧光漂白恢复技术：即fluorescence photobleaching recovery，FPR或fluorescence recovery after photobleaching，FRAP。
首先利用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，然后利用高能量的激光束照射被被标记的特定区域，使该区域标记分子的荧光发生不可逆淬灭而被漂白。
因非照射区域荧光标记分子的移动，使得漂白区域逐渐恢复荧光。
该技术可用于研究蛋白质的运动。
酵母双杂交技术：该技术用于研究蛋白质之间的相互作用。
放射自显影技术：利用放射性同位素（如3H、14C等）的电离辐射对乳胶（含AgBr 活AgCl）的感光作用，研究样本中放射性化合物在机体、组织和器官、细胞中的分布、定位、运动等生物学活动。
二、选择题1. 正常细胞培养的培养基中常需要加入血清，主要是因为血清中含有（）。
A 氨基酸；B 核酸；C 生长因子；D 维生素。
【答案及解析】C。
加入血清主要是为培养基增加生长因子。
2. 冰冻蚀刻技术主要用于（）。
A 电子显微镜；B 光学显微镜；C 原子力显微镜；D 激光共聚焦显微镜。
【答案及解析】A。
冰冻蚀刻技术属于电镜制样技术之一，另外还有超薄切片技术、负染色技术、电镜三维重构与低温电镜技术、扫描电镜技术等。
3. 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪种技术构建的？（）A 细胞融合；B 核移植；C 病毒转化；D 基因转移。
【答案及解析】A。
4. 关于光镜的使用下列哪项有误？（）A 观察标本时，应双眼同时睁开，双手并用；B 按照从低倍镜到高倍镜到油镜的顺序进行操作；C 使用油镜时，需要在标本上滴香柏油，将聚光器降至最低，光圈关至最小；D 使用油镜时，不可一边在目镜中观察，一边下降镜筒或上升载物台。
【答案及解析】C。
三、填空题1. 体外培养的细胞，不论原代还是传代细胞一般不保持体内原有的细胞形态。
03第三章细胞生物学研究方法2013
免疫荧光技术
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免疫电镜技术
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放射自显影技术研究生物大分子的 合成动态
原理及应用： 利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含卤化银）的感光作 用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； 特征是可以实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。
操作： 见书P68和图3-22
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细胞拆合与显微操作技术
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显微操作
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第三章 细胞生物学研究方法
第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物
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不同物种享有共同分子机制
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• 电子束的波长只有0.01-0.9nm，分辨率可 达0.2nm，是光镜的1000倍。
• 电镜和光镜在基本原理上完全不同，但光 路图十分相近。
• 染色方法不同，光镜用染料，而电镜用重 金属盐，所以电镜不能观察活的细胞结构。
• 缺点：不能观察活的生物样品
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电镜与光镜比较
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第三章 细胞生物学研究方法
第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物
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植物细胞和动物细胞的培养
动物细胞培养
类型：原代培养细胞（primary culture cell）
显微镜 分辨本 领
LM 200nm
光源
第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一．名词解释1.福尔根反应：特异显示DNA分布的反应。
酸水解可除去RNA，仅保留DNA，冰出去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键上的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。
所暴露的自由醛基与西夫试剂反应呈紫红色。
2.负染色：用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。
染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的，反衬出样品中的生物大分子及其复合物的形态。
3.原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特意核苷酸序列在染色体上火细胞中的位置的方法。
4.原代培养：直接从动物体内获取细胞进行首次培养，称原代培养。
5.传代培养：原代培养的细胞在一个容器中增殖到一定的密度后，将细胞分散到多个容器中继续培养的方式称传代培养。
6.细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，一般可顺利地传40-50代次，它保持染色体二倍体的数量及接触抑制行为。
7．细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，使其获得“不死性”特征，从而无限增殖，从正常组织或胚胎组织也可以建立细胞系，这是一个含有多个细胞谱系的混杂细胞群体。
8.探针：带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段，用于核酸分子杂交技术以检出标本中待测核酸分子。
9.超薄切片：是一种主要的透射电子显微镜制样技术，利用超薄切片机将样品切成40-50nm 左右，穿透很弱的电子束才能透过。
其主要步骤为：固定、脱水、包埋、切片、染色。
二．填空1、细胞生物学常用的光镜有相差显微镜、微分干涉显微镜、和荧光显微镜。
2、利用超速离心机对细胞组分进行分级分离的常用方法有差速离心和密度梯度离心。
3、单克隆抗体技术是将B淋巴细胞与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
4、对电镜观察的生物样品有_要求样品很薄和保持样品的精细结构5、贴壁生长的细胞具有三个特点：单侧生长、形态多变、接触抑制。
第三章细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一、是非判断1．提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。
2．光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结构。
3．亚显微结构就是超微结构。
4．电子显微镜的镜筒中是真空的，其目镜与光学显微镜的目镜也有很大区别。
5．在电子显微镜下观察细胞核时用碱性品红染色，染色质被染成红色。
6．为了使光学显微镜或电子显微镜标本的反差增大，可用化学染料对标本进行染色。
7．生物样品的电子显微镜分辨率通常是超薄切片厚度的十分之一，因而切得越薄，照片中的反差越强，分辨率也越高。
8．透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。
9．CsCl密度梯度离心法分离纯化样品时，样品要和CsCl混匀后分装，离心时，样品中不同组分的重力不同，停留在不同区带中。
10．用免疫荧光技术可显示与酶解过程有关的酶是否结合在微管上。
11．用带有标记的特定核酸分子作探针，测定与之互补的染色体DNA区段的位置，称为原位杂交。
12．Western blotting是体外分析RNA的技术。
13．进行流式细胞术时，所用的细胞需染色，而且还需对组织块中的细胞进行分散处理。
二、选择1．要观察肝组织中的细胞类型及排列，应先制备该组织的( )。
A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片2．小鼠骨髓细胞染色体标本一般制备成细胞的( )。
A．滴片B．切片 C．涂片 D．印片3．观察血细胞的种类和形态一般制备成血液( )。
A．滴片D．切片 C．涂片 D．印片4．提高一般光学显微镜的分辨能力，常用的方法有( )。
A．利用高折射率的介质(如甘油) B．调节聚光镜，加红色滤光片C．用荧光抗体示踪D．将标本染色5．下列( )与显微镜能达到的分辨率无关。
A．光波波长B．物镜的放大倍数C．标本和透镜之间的物质的折射率D．透镜的数值孔径6．适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是( )。
A．扫描电镜B．荧光显微镜C．相差显微镜D．倒置显微镜7．用于观察活细胞的显微镜是( )。
细胞生物学-第3章-细胞生物学研究方法(翟中和第四版)
基础上，添加 “环状光阑”和
“相差板”，将光程差或相位差， 转换成振幅差。 • 这是在构造上，相差显微镜不同于 普通光学显微镜两个特殊之处。
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
甲醛
石蜡
5μm
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜
发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微 镜，并获得诺贝尔奖。
原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变 成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间 的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。
（Байду номын сангаас）荧光显微镜——基本原理
特点： 1. 利用汞灯或氙灯作为荧光激 发光源，波长较短，分辨 率高于普通显微镜； 2 . 核心部件是滤光片系统及专 用物镜镜头； 3. 滤光片系统由激发滤光片和 阻断滤光片组成。 应用： 对细胞内生物大分子进行 定性、定位研究。
520~560nm的 绿色荧光透过
阻断滤光片
用超速离心技术分离细胞组分
组织匀浆
差速离心
密度梯度离心
分离出各组分
用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、细胞成分的细胞化学显示方法
• 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 • 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、 核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量
福尔根反应 Feulgen stain
第三章 细胞生物学研究方法
越强。 15. 用 Triton 等去垢剂可以抽提细胞中的微管、微丝等蛋白质结构。 16. 相差显微镜可以用来观察活细胞和未染色的标本。
18. 当前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位最有力的工具是： A. 暗视野显微镜 B．荧光显微镜 C．倒置相差显微镜 D．普通光学显微镜
19. 关于相差显微镜下列说法错误的是： A. 基本原理是以样品密度差别为基础，将光程差转换成振幅差，形成明暗区别 B．样品不需要染色 C．可以观察活细胞 D．可以对细胞的生物大分子进行定位和定性分析
25. 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪项技术构建的： A. 细胞融合 B．核移植 C．病毒转化 D．基因转移
三、判断题
1. 对显微镜来说，最重要的性能参数是放大倍数。 2. 普通光镜的应用原理是：不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，形成足够的反差或
产生不同波长的光谱以区分细胞组分。 3. 亚显微结构即超微结构。 4. 经冷冻蚀刻技术处理后的样品，在电子显微镜下所观察到的图像是样品本身所形成的。 5. 经过流式细胞仪分离出来的细胞不能继续培养。 6. 体外培养的细胞一般均保持体内原有的细胞形态。 7. 透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。 8. 扫描隧道显微镜是具有原子显像力的显微镜。 9. 提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。 10. 在光学显微镜下观察到的细胞结构称为亚显微结构，在电子显微镜下观察到的结构称为
细胞生物学的研究方法
第三章细胞生物学的研究方法一、填空题1．透射电子显微镜由、、、三部分所组成。
2.在酵母人工染色体制备过程中，要用酶脱去酵母的细胞壁，使之成为、并且用进行观察和计数。
4.观察贴壁生长的培养动物细胞可用，而观察脱去细胞壁的植物细胞，则要用。
5. 物质在紫外光照射下发出的荧光可分为和两种，其中需要将被照射的物质进行染色。
6．用紫外光为光源照射物体比用可见光的分辨率要高，这是因为。
7．通过或形成的细胞叫细胞株。
9.灭活的仙台病毒之所以能够诱导细胞融合，是因为。
10. 相差显微镜与普通显微镜的不同是用替代可变光阑，用代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
11．倒置显微镜与普通显微镜的不同在于其。
12．若用紫外光为光源，光学显微镜的最大分辨率为，透射电子显微镜的最大分辨率为，扫描电镜的分辨率为。
13. 显微镜的分辨本领是指能够能力，用来表示。
14．高压电镜的电压在120kV以上，优点是：、。
16. 细胞培养的突出特点是：可在。
18.贴壁生长的细胞有三个特点：①；②；③。
19. 用细胞培养法来研究生命活动规律的局限性是。
20．超薄切片染色常采用、染色。
21．免疫细胞化学技术是用来定位细胞中的物质。
22．电子显微镜使用的是透镜，而光学显微镜使用的是透镜。
23.电子染色是用来增强电子的散射能力。
24．在光学显微镜下见到的结构称为，在电子显微镜下见到的结构称为。
25．细菌质膜的多功能性主要表现在：具有的呼吸作用，具有的分泌作用，具有的信号传导作用。
27.在同位素追踪技术中，用于研究DNA的同位素标记的前体物是。
28．单克隆抗体技术是将与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
29. 可用技术来研究质膜结构的不对称性。
31.动物细胞培养所用的合成培养基中除含多种、和外，一般还需加入。
32．用荧光显微镜观察细胞时，经吖啶橙染色的细胞中的DNA发荧光，而RNA发荧光。
33．适于观察活细胞的光学显微有、和等。
34．分辨率是指人的肉眼或显微镜在25cm处能够分辨到的相邻两个物体间最近距离的能力。
第三章 细胞生物学研究方法综述
特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察
第三章 细胞生物学研究方法
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术（light microscopy）
电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope） 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
细胞的培养 细胞工程
一、光学显微镜技术（light microscopy)
普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
电镜与光镜的比较
【免费下载】第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法肉眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.2μm电子显微镜分辨率：0.2nm一、光学显微镜技术（一）普通复式光学显微镜光学显微镜的组成：①光学放大系统（目镜和物镜）；②照明系统（光源、折光镜、聚光镜）；③机械和支架系统（保证光学系统的准确配置和灵活调控）缺图分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。
分辨率的高低取决于光源的波长λ，物镜镜口角α和介质折射率N。
公式缺图在油镜下可提高介质折射率，从而最大分辨率达到0.2μm。
光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物体或体外培养细胞。
如果要观察生物组织样品，则需要对材料进行固定，包埋，切片，染色。
苏木精可以特性使DNA着色，伊红可以染蛋白质，从而能显示出细胞核细胞质的位置。
（二）相差和微分干涉显微镜光线通过样品的每一个点到达成像系统时所出现的图像是一个个模糊的圆盘，因此两个相邻的像点所显示的图像可能会发生重叠，重叠到一定程度时，就无法分辨两个点了，造成了光学显微镜的分辨极限。
1、相差显微镜缺图原理：相差显微镜可以将光通过不同密度物质时产生的光程差转换成振幅差，而且相差显微镜在物镜后有一块相差板，相差板上的吸光物质增大了两组光线间的相位差，最后经透镜汇聚时便会产生相互叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼可见的明暗区别。
研究对象：由于反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故相差显微镜不需染色，可观察或细胞，甚至研究细胞器的动态。
2、微分干涉显微镜原理：以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜汇合，从而样品中厚度上微笑的区别就会转化为明暗区别，增加反差，且具有很强的立体感。
研究对象：适合于研究或细胞中较大的细胞器，还可接上录像装置观察动态。
（三）荧光显微镜原理：主要用于检测细胞上的特异荧光染料，为此增加了两套滤光片，第一套为激发光滤片，装载光源和样品之间，只有那些能激发荧光染料发光的特定波长的光才能通过；第二套为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让染料所发出的荧光通过。
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TEM
0.1nm
玻璃透镜 可见光 （400-700） 紫外光 玻璃透镜 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） 电磁透镜
要求真空 1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子的散射 和透射形成明暗反差
电 镜 与 光 镜 光 路 图 比 较
电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术
第三章 细胞生物学研究方法
(the research method in the cell biology) 细胞形态结构的观察方法 （study method for cell morphology and structure） 细胞组分的分析方法 (analysis method for cell composition)
DIC 显微镜 下的硅藻 （伪彩色）
A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM.
a)under bright-field;
b)phase-contrast;
原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如
量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示 系统。 特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm）；
第三章 细胞生物学研究方法
(the research method in the cell biology)
进行初步观察 形成可验证的假说 设计对照试验 查阅已 有知识 收集资料 解释结果
生物学研究模式生物 不同物种享有共同分子机制
作出合理结论
如何学习细胞生物学？
抽象思维与动态观点 结构与功能统一的观点 同一性(unity)和多样性(diversity)的问题 细胞生物学的主要内容： 结构与功能（动态特征）； 细胞的生命活动 ； 实验科学与实验技术——细胞真知源于实验室 ——What we know//How we know.
二、 电子显微镜技术
电子显微镜的基本知识
电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术
负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术
扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）
三、 扫描遂道显微镜
扫描探针显微镜（ Scanning Probe Microscope,SPM） (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等
一、 离心分离技术
用途：用于分离细胞器与生物大分子及其复合物
差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法
原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些
特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 Feulgen Staining
普通复式光学显微镜技术
相差显微镜和微分干涉显微镜（phase-contrast microscope and differential interference contrast microscope, DIC） 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） FRET & FRAP 暗视野显微镜（dark field microscope） 倒置显微镜 (inverted microscope)
细胞生命活动
突变体分析 突变体分析 基因表达
蛋白修饰分析
生物信息学
多肽定性分析
序列测定 双向电泳分析 DNA分离与克隆 机器人技术 (robotics) 功能基因组学 蛋白质组学 蛋白质分离与制备
落射式照明原理
荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
LCSM 照片，蓝色为细胞核，绿色为微管
Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养
莱卡倒置显微镜
人类染色体端粒DNA 的荧光原位杂交照片
群体培养（左）和克隆培养（右）
植物细胞培养
图3-33细胞松弛素B诱导的排核过程
原理 应用：
排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)， 可重构样品的三维结构。
相差显微镜（phase-contrast microscope）
将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞
微分干涉显微镜（differential-interference microscope,DIC）
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 负染色技术（Negative staining）与金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。
快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）
细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失
植物细胞培养 类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系（cell-free system）
二、细胞工程
细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 单克隆抗体（monoclone antibody）技术 图
c)DIC
Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) 磷钨酸钾or shadow casting with chromium(b).
ห้องสมุดไป่ตู้
第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
细胞的培养
细胞工程
一、光学显微镜技术（light microscopy)
流式细胞仪（Flow Cytometry）
主要应用：
用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；
测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。
一、细胞的培养
动物细胞培养(群体培养和克隆培养)
类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制
速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀
A 等速度沉降，B 等密度沉降
Drosophila melanogaster
Caenorhabditis elegans
Arabidopsis thaliana
早在20世纪最初的20年中，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发 育的现象难题可以得到部分解答。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也 较好观察。由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性，所以 利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育共通规律是可能的。尤其是当在 有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化特征时，发育的普遍原理也就得以建立。 因为对这些生物的研究具有帮助我们理解生命世界一般规律的意义，所以它们被称为“模 式生物”。
电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）
——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。
扫描电镜
原理与应用： 电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子， 探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题
定位等
四、细胞内特异核酸的定位与定性
光镜水平的原位杂交技术
（同位素标记或荧光素标记的探针）
电镜水平的原位杂交技术
（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）
五、放射自显影技术
原理及应用：
利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行
定性、定位与半定量研究；
实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。
偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器
录像增差显微镜技术（video-enhance
细胞中的颗粒及细胞器的运动
microscopy）
计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活
电镜与光镜的比较
显微镜 分辨本领 200nm LM 100nm 光源 透镜 真空 不要求真空 不要求真空 成像原理 利用样品对光的吸收形 成明暗反差和颜色变化
步骤：
前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）
———放射自显影
细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）