1.2基因工程的基本操作程序

1、什么是转化？ 2、目的基因导入植物细胞常用的方法是 什么？具体过程是怎样的？ 3、目的基因导入动物细胞常用的方法是 什么？基本操作程序是怎样的？ 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样 的？钙离子有什么作用？
三、目的基因导入受体细胞
转化
目的基因进入受体细胞内，并且 在受体细胞内维持稳定和表达的 过程。
三、将目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1、将目的基因导入植物细胞 机理: （1）农杆菌 转化法
能感染双子叶植物和祼子植物,对 大多数单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上
5、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA 分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可 用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是( D) ①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热 稳定DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温 A．①③④⑦⑧⑨ B．①②④⑥⑦⑧ C．①②⑤⑥⑦⑨ D．①③⑤⑥⑦⑧ 6、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧 核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460个）放入DNA扩 增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧 核苷酸的个数是（ B ) A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个
检测
1.目的基因的检测与鉴定 ①导入检测： 目的基因是否导入受体细胞 方法：DNA-DNA分子杂交 转录检测：DNA —mRNA 分子杂交 抗原-抗体杂交 翻译检测： 抗虫鉴定
②表达检测
分 子 检 测 法
鉴定
抗病鉴定 个体水平的鉴定
活性鉴定
2.基因探针
• 基因探针（probe）又称“寡核苷酸探针”，简 称“探针”，就是一段与目的基因或DNA互补的 特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以 仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以 是由之转录而来的RNA。 • 注：1.探针可以用放射性同位素或者荧光等标记。 • 2.探针与目的基因或是mRNA杂交后通过特定的 装置会显B、线粒体DNA（ A ） C、总mR（ ，导入基本操作程序
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
• 1、什么是目的基因？ • 2、获取目的基因的方法有哪些？ 其操作过程分别是怎样的？
一、目的基因的获取
1.目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也 可以是一些具有调控作用的因子目的基因 （3）化学方法直接人工合成
3、将目的基因导入微生物细胞
微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
常用菌：大肠杆菌 常用法：Ca2+处理 增加细胞壁的透性， 过程：
与细胞膜无关
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细 胞吸收 DNA
四、目的基因的检测与鉴定
1、导入目的基因后需要检测哪些方面？ 各采取什么方法？ 2、什么是基因探针？检测时的基因探针 通过什么原理来检测目的基因和相应 的mRNA？ 3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什 么？
思考与探究
1、β—珠蛋白是动物血红蛋白的 重要组成成分，当它的成分异常时， 动物可能患某种疾病，如镰刀型细 胞贫血症，假如让你用基因工程的 方法使大肠杆菌生产出鼠的β—珠 蛋白，想一想，应该如何设计？
二、基因表达载体的构建—核心
二、基因表达载体的构建—核心
目的基因
(二)基因表达载体的构建——核心 1.过程:
（1）用一定的_________ 限制酶 切 割质粒，使其出现一个切口， 黏性末端 露出____________ 。
同一种限制酶 切断目 （2）用___________ 的基因，使其产生相同 _____ 的黏性末端 。 ____________
3.基因探针检测目的基因和相应的mRNA • • • • • • 分子杂交技术 原则：碱基互补配对 ( 1 ) DNA—DNA分子杂交配对原则 A-T;C-G. ( 2 )DNA—mRNA分子杂交配对原则 A-U;T-A;G-C.
目的基因检测：DNA-DNA分子杂交技术
练习
1．下列关于基因结构的认识中，正确的是( D ) A．大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列 B．乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子 C．大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的 下游 D．水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列 2．（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点 是 （ ACD ） A．编码区都有能编码蛋白质的序列 B．编码区都是连续的 C．非编码区都能调控遗传信息的表达 D．非编码区都有RNA聚合酶结合的位点
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 过程：利用PCR技源自扩增目的基因PCR的过程：
变性(90-95℃)
退火(55-60℃)
延伸(70-75℃)
过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：目的基因DNA受热 单链DNA 变性后，氢键 _____断裂，解旋为___________ b、退火（55℃-60℃）：温度降低，引物与DNA 双链 。 模板相应互补序列结合，形成局部________ c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下进行 DNA链 。 延伸，合成与模板互补的________
转化过程:
表 植 新 农 Ti质粒 构建 达 转入 插入 植物细胞 表达 导入 物 性 杆 染色 DNA 载 状 细 菌 目的基因 体 胞
（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生 的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入 受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉管通道法
原核细胞的基因结构
原核 细胞 的 基因 结构
编码区：: 编码蛋白质 ,连续不间断 ①不编码蛋白质。 非编码区 ②调控遗传信息表达,上的有关信息。
如：根据 基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。
2.作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代
b、同时使目的基因能表达和发挥作用 思考：作为基因工程表达载体，只需含有 目的基因就可以完成任务吗？
3.基因表达载体的组成：
复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
它们有什么作用？
资 料:
科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的 过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体 质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基 因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗 虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株 还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫 基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入 棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗构 建
限制酶
供体细胞的 全部DNA
大量DNA 片段 拼接到载体上导入受体细胞扩增cDNA的构建mRNA逆转录
单链DNA的基因结构
RNA 聚合酶
外显子：能编码蛋白质的序列 真核 细胞 编码区 内含子：不能编码蛋白质的序列 的 有调控作用 , 上游有 RNA 聚合酶 基因 非编码区 结合位点(启动子) 结构 非编码序列：包括非编码区和内含子
9、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ( ABCD ) A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因 10、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是( A ) A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位， 是起始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段， 对mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的 基因从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式 不同而有所差别
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基 因借助花粉管通道进入受体细胞。
2、将目的基因导入动物细胞
方法: 显微注射技术 操作程序:
提纯含目的基 因表达载体 取受精卵 显微注射 受精卵发育 早期胚胎 移植到子宫 新性状动物
7、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最 方便方法应
8、下列获取的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利 用化学方法人工合成( D ) A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③
二、基因表达载体的构建—核心
1.启动子的作用：
是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它 才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
2.终止子作用：
使转录在所需要的地方停止。
3.标记基因作用：
是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如 青霉素基因。
三、目的基因导入受体细胞
（二）利用PCR技术扩增目的基因
（二）利用PCR技术扩增目的基因
• PCR——聚合酶链式反应 • 是一项生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术。通过 此技术，可在短时间内获取大量的 目的基因。
(二)利用PCR技术扩增目的基因
DNA复制 原理：__________ 一段已知目的基因的核苷酸序列 条件： _______________________ 前提条件 四种脱氧核苷酸 、________ 一对引物 、 _____ 模板 、 _______________ 热稳定 DNA聚合酶（Taq酶） ___________________________. n 2 方式：以_____ 指数方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） 结果：
PCR扩增仪