第五章植物的胚胎培养及离体

Embryo Culture of Japanese Holly（冬青）
Embryo Culture of Citrus
第二节 植物胚乳的培养
胚乳培养(endosperm culture)是指将胚乳组织从母体上 分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的过程。 √裸子植物中胚乳是由雌配子体发育而成的，是单倍体。 √被子植物中胚乳一般是双受精的产物，是由两个极核和一 个雄配子融合而成的三倍体。 √而待宵草型胚囊只有一个极核与精细胞融合，胚乳为2n。 √贝母型胚囊的两个极核,一个为n，另一个为3n，与精细胞 融合后的胚乳核为5n。 √椒草型配囊有8个极核，与精细胞融合后胚乳核为9n。
第一节
一、胚培养类型
植物胚培养
两类:成熟胚培养与幼胚培养

成熟胚一般在比较简单的培养基上就能萌发生长，成熟 胚生长依赖胚乳、子叶的贮藏营养，对培养基的要求简 单。只要提供合适的生长条件以及打破休眠，即可萌发成 幼苗。 成熟胚培养技术要求不严格，将受精后的果实或种子（带
种皮），表面消毒后，剥取种胚,接种于培养基上，即可发
胚胎发育时，不加生长素、细胞分裂素
GA3、KT促进早熟萌发； ABA抑制早熟萌发
4．其它成分泛使用。 维生素类：有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。维生素对发 育初期的幼胚的培养来说是必须的。 外源激素：成熟胚生长一般不需要即可萌发，而加入一定量的 激素可显著增加培养物的生长、并利于休眠种胚的萌发。
育成为一个完整的植物体。

幼胚指尚未成熟（发育早期）的胚。在离体培养时比成 熟胚培养困难，要求的技术和条件较高。
幼胚离体培养中的生长方式（三种）：

胚性发育：继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长，形 成成熟胚（类似种子）再按种子萌发途径出苗形成完整植 株（一个胚只形成一个植株）。 早熟萌发（Precocious germination）:是在培养后迅速 萌发为幼苗，不继续进行胚性生长，越过正常胚发育阶段， 在未达到生理和形成成熟胚的情况下，萌发长成幼苗。 （早熟萌发形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至引起死亡。）


胚培养研究最多的是荠菜和大麦这两种被子植物，此外在曼 陀罗属、柑桔属和菜豆属中，也进行了大量工作。
胚胎发育过程分为两个时期（根据胚对营养的需要）：
① 异养期（heterotrophy period），即在胚发育
早期，幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。
② 自养期(autotrophy period) ，胚在代谢上已经
大麦（Hordeum vulgare）×黑麦(Secale cereale)属间杂交，采用 这种方法有30%～40%的杂种未成熟胚可以发育成苗，而用传统的胚培 养法只有1%能成功。
De lautour等（1980）改良胚乳看护培养（图4-2）。他们把杂种离体幼 胚嵌入到由双亲之一胚乳中，然后把二者一起放在人工培养基上培养。


形成愈伤组织：多数情况下，幼胚在离体培养中首先细胞 分裂形成愈伤组织，再分化形成植株。（为胚性愈伤组织， 易形成植株）
拟南芥
二 、培养方法

远缘杂交中离体胚的培养主要是培养幼胚，幼胚培养技术在 育种中更为重要。

幼胚离体培养中，维持培养的胚胎进行正常的胚性生长，是 胚培养的关键问题。
幼胚（未成熟胚）一般不能像成熟胚一样在简单培养基上生 长，它们比成熟胚对营养的需要更为复杂，为了使不能产生 杂种的远缘杂交中获得杂种，主要是改良培养基，使离体幼 胚能沿着胚珠内胚胎发生的途径发育（维持胚性生长）。

外源生长物质和植物内源激素之间某种平衡，是维持幼胚胚性 生长的关键。如果激素浓度低，则不能促进其生长；如果激素 浓度过高，将会使幼胚发生脱分化而影响其正常发育。

天然提取物：如椰乳、大麦胚乳、麦芽、马铃薯块、大豆等提 取物，对胚生长有促进作用。
Van Overbeek等使用椰子汁培养曼陀罗的心形胚获得成功。 王伏雄（1963）发现蜂王浆对银杏幼胚正常分化有促进作用、 胚的死亡率减少、抑制胚形成愈伤组织。
（二）、环境条件 1．温度 对大多数植物胚的培养来说，温度保持在25～30℃较 为合适。 如：在20℃下马铃薯胚培养较好。在25～30℃范围内柑橘、苹 果、梨合适。 32℃时棉花胚生长最好。桃则需要变温条件 下进行。 2．光照 光对胚胎发育有抑制作用，一般黑暗或弱光下利于幼 胚的培养。 （三）、 胚柄对幼胚培养的影响 研究表明，胚柄参与幼胚的发育过程。当胚发育到球形 期时，胚柄也发育到最大。胚柄中的激素(GA)对幼胚发育有 作用。 例：红花菜豆中，较老的胚，不管有无胚柄的存在，均能在 培养基中生长；但幼胚培养，不带胚柄会显著降低形成小植 株的频率。
指培养未受精的胚珠并在试管内撒播花粉， 使其受精形成具有活力的种子。
Hanning (1904) 最早在无菌条件下进行十字花科辣根菜、萝 卜成熟胚培养获得成功。
Laibach (1925，1929)用宿根亚麻×奥地利亚麻（Linum perenne × L.austriacum）胚培养，得到了杂种植物。因 为在远缘杂交的组合中，植物所结的种子发育不良，不能萌 发。可将胚置于人工培养基上培养成功。
一、 培养方法
（一）胚乳外植体的制备 将整个果实（槲寄生植物）或种子进行表面消毒，在 无菌条件下切开幼果及种子，小心分离胚乳，接种在培养 基上培养。 （二）胚乳愈伤组织再生植株 1．愈伤组织的诱导 少数植物可以直接从胚乳分化出器官外，大多数被子 植物的胚乳，无论是未成熟或成熟的，都首先形成愈伤组 织，然后分化植株。 2．器官发生途径 器官发生型和胚胎发生型均有。 大戟科巴豆——分化根 麻风树-不定根、芽； 罗氏核实木——芽 柑橘——胚胎发生。
在高等植物种间或属间远缘杂交时的问题:
①受精前障碍:由于不亲和性，常常还会发生花粉不能在异种 植物柱头上萌发或花粉管生长受到抑制不能进入子房。—— 离体授粉受精 ②受精后障碍:即使受精，由于胚和胚乳之间的不亲和性，造 成胚乳发育不良，或杂种不能发育成熟，使胚在早期败 育。——胚培养，有可能获得杂种植株。
未成熟胚加入蔗糖的最重要的作用是保持培养基适当的渗透压。 如果蔗糖浓度过低易引起胚胎过早萌发。

例：Paris等（1953）在培养小于0.3mm的曼陀罗(D stramonium)胚 时，发现其适宜的蔗糖浓度为5%，而较低的蔗糖浓度对较大的成 熟胚生长适合。 3. 激素： 诱导愈伤组织时，加生长素、细胞分裂素
三、胚胎培养的应用
1．克服远缘杂交不亲和性 在远缘杂交中，由于双亲遗传和生理的不亲和性，产生 受精障碍或胚乳不能正常发育，导致杂种胚发育不良或早 期夭折。利用胚胎培养或分离早期幼胚培养，在试管中培 养成再生植株，可防止远缘杂交中优良种质的丢失。 2．打破种子休眠 一些种子发育不完全或有抑制物存在而影响种胚发芽。 例无胚乳种子(兰科,与微生物共生发芽);蔷薇科植物有抑 制物存在。 利用含有糖和无机盐的培养基进行胚培养，可使这些植物 的幼胚达到生理和形态上的成熟而萌发成植株。
图4-3 四种培养基中桃（EarliGrande）胚培养的幼苗（WP, BH, Monet, and Gilmore）
2．碳水化合物 糖在胚培养中具有三个方面的作用：①调节培养基的 渗透压；②作为碳源和能源；③防止幼胚的早熟萌发。

成熟胚在低浓度（含2%）蔗糖的培养基中生长很好。但幼胚要求 较高水平的碳水化合物。
能在基本的无机盐和蔗糖的合成培养基上生长， 在营养上已相当独立。
幼胚培养不同时期对培养基要求不一样，异养期 培养基成分复杂，自养期则相对简单。
1、固体培养（双组分培养基培养）
Monnier(1976,1978)介绍了一种培养方法
2、胚乳看护培养
Ziebur等 (1951)报道，在进行大麦未成熟胚离体培养 时，培养基上存在来自同一物种另一种子的离体胚乳，对胚 的生长有明显的促进作用。 谷类胚胎嫁接的研究发现，当大麦胚移植到小麦的胚乳上 时，比在大麦胚乳上生长更好。 Kruse(1974)在某些属间杂交中，若把未成熟的杂种胚放 在事先培养的大麦胚乳上培养，能显著提高获得杂种植株的 频率。
2）胚乳培养
指处于细胞期胚乳的离体培养,使之分化发育为完 整植株。
3）胚珠培养:是将授粉的子房在无菌的条件下解剖后， 取出胚珠置于培养基上培养形成幼苗的技术 √未受精的胚珠培养，目的是为试管受精提供雌配子 体。 √受精后的胚珠培养，胚珠内胚的发育处于早期阶段， 从两个细胞的原胚开始到球形胚阶段。
4）子房培养是指将子房从母体上分离下来， 放在人工配制的培养基上，使其进一步生长 发育成为幼苗的过程。 胚珠和子房培养又分为受精前和受精后的 培养。 5）试管受精
四、影响胚培养的因素
培养基（无机盐、碳水化合物、其它成分），环境条件，胚柄三个方面。
（一）、培养基：
1．无机盐 成熟胚的培养基较简单。主要有Turkey、Randolph、 white等. 以大量元素和微量元素的无机盐为基本成分。 幼胚培养的培养基为常用的MS、B5、Nitsch以及Rijven、 Rangaswang、Norstog等培养基。 Monnier研究无机盐对荠菜胚培养的影响，发现： Knop、Miller培养基中——存活较高、生长较差； MS培养基中——生长好、存活率低。 调整无机盐成分：（K、Ca浓度增加，NH4+降低）——存活、 生长都较好。
（三） 三倍体后代的特征
1．形态特征：
粗壮，叶片大而肥厚，叶色浓，花型大或重瓣，果实大但 结实率低。
2．胚乳再生植株的倍性
在胚乳培养中常常发生染色体倍性的混乱现象。即多数胚乳 培养具有多种数目的染色体细胞组成。 黄贞光等（1982）报道，来源于猕猴桃同一植株的胚乳，激 素影响倍性，在ZT3.0mg/L+NAA0.5mg/L培养基上多数是二倍体； 而ZT3.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L则为三倍体植株 。 影响胚乳细胞在培养中染色体稳定性的因素主要有： 胚乳的类型、胚乳愈伤组织发生的部位（合点端还是珠孔 端）以及培养基中外源激素的种类和水平。