第六章胚胎培养

第六章胚胎培养

一、胚胎培养的意义

1.概念

胚胎培养指胚及其胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下，使胚发育成幼苗的技术2.分类

广义: 离体胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养、试管受精、胚轴、胚芽等

狭义：离体胚培养（成熟胚培养、幼胚培养）

3.意义

可克服一些早熟品种胚早期败育现象，从而缩短育种周期，增加种子发芽度

可克服远缘杂种的不育性

利用胚乳培养可获得无籽的三倍体果实

可用于研究与胚发育有关的内外因素以及有关的代谢和生理生化变化

4.发展简史

1904年，Hanning培养萝卜、辣根的胚，提前萌发成苗，成为世界上胚胎培养最早成功的一例

30年代，Tudey培养多种果树胚胎获得成功

1942年，Dietrich对十字花科、豆科、菊科、葫芦科和禾本科的多种植物离体胚培养进行研究

二、离体胚培养

（一）成熟胚培养

指子叶期后至发育完全的胚的离体培养

易成功，在含有大量无机无素和蔗糖的培养基上培养即可萌发

培养目的

研究发育过程的形态建成、激素的作用、营养要求等生理问题

培养方法

消毒（种子70%酒精5-30`表面消毒---饱和漂液或0.1%升汞10-30 min----无菌水冲冼3-4次）——取胚（无菌解剖,直接取胚）——培养（置于培养基上培养----萌发成苗）

（二）幼胚培养

1.概念

指子叶期以前的具有胚结构的幼小胚培养

2.培养方法

包括消毒(子房)、取胚、接种。需在高倍解剖镜下取胚，操作要细心

3.胚发育方式

a.胚胎发育：即按胚胎的正常发育途径生长发育最后成苗，是最理想的发育方式

b.胚性发育：培养的幼胚可增大，但不能萌发成苗，只呈现胚性生长

克服方法

1.提高渗透压

2.改变激素的种类或浓度

3.加入天然复合物

4.改善培养条件(pH、温度、光）

c.早熟萌发：指离体培养的幼胚越过正常胚胎发育阶段,在未达到生理和形态成熟的情况下,萌发长成幼苗。形成畸形、弱苗或死亡.

克服途径:提高培养基渗透压(蔗糖、无机盐、甘露醇) 胚龄越小要求的渗透压（糖浓度）越高。

产生愈伤组织或胚状体

生长调节剂浓度高时易形成愈伤组织

4.影响胚培养成功的因素

○1胚的发育程度：胚越小, 离体培养难度越大

○2培养基

a.基本培养基：MS、B5、white

b.碳源：蔗糖最佳，2-4%。重要作用是调节渗透压

不同发育时期的胚要求不同浓度的蔗糖浓度，胚年龄越小，蔗糖浓度越高

结论：

渗透压与幼胚生长关系密切，胚越小，Vp要求越高

在胚培养中，要定期将胚转移到逐渐降低Vp的培养基中

推论：

高渗透压调节胚的生长，减少由于低渗而造成对从高渗环境中分离出的胚的影响

高渗可抑制早熟萌发，并把细胞的伸长状态转到分裂状态

c.生长调节物质：IAA、KT、GA等合理浓度配比

不同植物的胚培养要求的生长物质不同（种类、浓度等）

在培养一种新的植物幼胚之前，对生长物质合理的种类、浓度进行筛选

d.胚乳营养物质

研究表明，培养基中添加胚乳抽提物可促进幼胚生长

小胚接种于破碎的胚乳上培养成功率提高

e.天然复合物：椰子汁、椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白

○3胚胎培养的环境条件

a. 温度

通常25-30℃。有些种类、品种需低温打破休眠

b. 光照

黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜

促进胚芽生长，抑制胚根生长

根据植物种类决定光照条件

c. pH 值

通常5.6-5.8之间。有同植物种类,最适pH不同

三、胚珠培养

（一）胚珠培养的目的

克服幼胚培养难度大,不易成功

有些种类成熟胚很小,取胚珠培养较易成功

利用未受精的胚珠培养可诱发大孢子发育成单倍体

（二）胚珠培养的发展

1932年,white,胚珠培养,使胚珠只进行了很有限的生长

1942-1943年,withner,兰花胚珠培养,获得成熟种子

1958年,Maheshwari,培养授粉5天的罂粟胚珠成功,在试管内萌发成苗

胚珠培养还处于试验摸索阶段,育种方面的应用也刚开始,园艺植物如洋葱、四季桔、矮牵牛、凤仙花等胚珠培养获得成功

（三）培养方法

授粉或未授粉子房——表面消毒——无菌解剖——取出胚珠——培养

培养基：

基本培养基：Nitsch、white常用；MS、B5、N6

添加物：生长调节特质+其它（糖、V、椰乳等）

（四）胚珠离体培养的原理

胚是一个完整的细胞体系,位于胚珠之中,它与包围着它的胚珠其他部分构成一个整体.当进行离体培养时,胚珠与培养接触,胚也会受到来自培养基中的各种因素的刺激,发生反应

离体培养的胚,发育受到外源物质和胚珠中本身存在的内在因素的共同作用

提供胚生长的适合内在和外在的因素,是取得胚珠培养成功的关键

（五）影响离体胚珠培养成功的因素

1.胚的发育时期

发育时期越早,越难培养成功。球形期以后的胚珠培养较易成功

2.胎座和子房的影响

带有部分胎座和子房组织的胚珠培养较易成功

影响机制不祥

3.培养基附加物质的影响

添加复合物对许多植物的胚珠培养有效

不同植物、不同发育时期添加物种类、数量不同

四、子房培养

（一）概念：子房培养指受粉或未受粉的子房的离体培养

受粉的子房----成熟胚

未受粉子房----单倍体植株

（二）培养方法

1.材料消毒

未受粉子房----花被包裹，只需对花蕾灭菌即可

受粉的子房----需表面灭菌

2.材料的选择

未受粉子房----选取卵细胞适宜的发育时期.通常接近成熟时的子房培养较易成功

3.培养基

基本培养基：MS、White、Nitsch、Heller等；N6、B5用于禾本科植物

适当添加生长素类物质有效

碳源多用蔗糖，浓度3-10%

4.环境条件

T：22-27℃，冬作物可低些

光照：500-1500lux

5.附属花器

附属花器对胚发育生长有利

机制不祥

6.子房植株的倍性

子房存在两种细胞（性细胞和体细胞），子房植株出现混倍现象

获得单倍体要促进大孢子细胞分裂，抑制体细胞分裂

五、离体受精（试管受精）

（一）概念：试管受精指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，花粉萌发产生