第六章胚胎培养
胚胎培养
胚胎培养一、胚胎培养的概念1.胚胎：植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚。
2.胚胎培养：胚胎培养是植物组织培养的一个主要领域。
植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如子房，胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。
二、胚胎培养的种类以及方法1.胚培养⑴幼胚培养①定义：将子叶期以前的具胚结构的幼小胚从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下使其进一步生长发育形成幼苗的技术。
②特点：幼胚培养完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。
附：以下几种发育方式：a、胚性发育，此种方式不能萌发成苗b、早熟萌发，长成的苗十分瘦弱c、产生愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚或不定芽⑵成熟胚培养①特点：成熟胚培养是自养的，培养基需要简单。
②主要目的：a、研究胚发育过程的形态建成b、生长调节物质的作用c、胚与胚乳相互关系和营养要求③培养方法：将受精后成熟或未成熟种子或果实，用70%-75%酒精表面消毒几分钟；用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水反复冲洗；无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥取胚接种在培养基上。
2、胚乳培养⑴定义：指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。
⑵胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。
由它可获得无子结实的3倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。
不同胚乳发育类型及发育时期直接影响外植体取材时期以及胚乳细胞产生愈伤组织频率。
胚乳培养的后代，常发生细胞染色体数目变化，形成多倍体、非整倍体等。
⑶培养的方法：取授粉4-8d后的幼果，常规消毒；无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳；接种在培养基上（MS、White等培养基，附加2，4-D或NAA 0.5～2.0，BA0.1～1.0。
），在25-270C和黑暗条件或散光下培养想成愈伤组织；转到分化培养基（MS培养基附加0.5～3.0 mg/l的BA及少量的NAA。
第六章 胚胎培养和离体受粉
三、胚珠和子房培养
1、作用 促进原胚继续生长，使幼胚发育 成熟；
成功：四季桔、柑、凤仙花、洋葱
未授粉胚珠和子房，诱导孤雌 生殖，产生雌性单倍体
成功的植物：西葫芦、莴苣、百合等
2、外植体消毒和接种
3、培养基及培养条件 4、离体培养胚胎的发育
胚珠或授粉子房培养，合子胚可以更好地发 育成植株。但如果条件不适，也容易从幼胚 或珠心组织产生愈伤组织。 芸香科易产生珠心胚。培养胚珠，获得大量 珠心胚，用以品种复壮、快速繁殖和获得无 病毒苗。同时，通过珠心组织培养，产生胚 性愈伤组织，建立胚性组织培养实验体系。
第六章
胚胎培养和离体授粉
•胚培养 •胚乳培养 •胚珠和子房培养 •离体授粉
一、胚培养
1、意义（5）
促使发育不良或中途败育的胚发育成熟 打破休眠期促进胚萌发 克服多胚品种珠心胚的干扰 快速繁殖良种砧木 诱导胚性愈伤组织
2、离体胚培养的发育途径
按正常胚胎发育途径形成植株
脱分化形成愈伤组织 胚“早熟萌发”
Short day plants:Plumbago indica
思考题
• 胚和胚乳培养的意义及方法 • 胚和胚培养注意事项
全书 内容
柑桔、苹果、枇杷、枣、梨、桃、猕猴桃、马铃薯
2、胚乳培养
胚乳 愈伤组织 形态发生
胚状体发育成苗
柑桔和枣
不定芽苗
苹果和枇杷
• For culture of mature endosperm, fruits are surface sterilized and endosperm plus embryo are dissected out under aseptic conditions. • For culture of immature endosperm, entire seeds are sterilized and the endosperm tissue is carefully excised under aseptic conditions using a stereoscopic microscope. It is desirable to dissecting out endosperm explants free of embryo tissue. Failure in this regard could lead to contamination of the endosperm callus with the tissue of embryo origin (diploid tissue).
植物胚胎培养
（二） 子房培养 1、子房培养的意义 、
★有效地挽救杂种胚的败育 ★单倍体植株的培育 ★离体授粉的需要 ★离体条件形成果实 ★花被功能研究
2、子房培养的方法 、
授粉前或授 粉后的子房
表面消毒
接种培养
受精后的子房仍需进行表面消毒后再 接种。而未受精子房可将花被表面消毒后， 接种。而未受精子房可将花被表面消毒后， 在无菌条件下直接剥取子房接种。 在无菌条件下直接剥取子房接种。 子房培养只需较简单的培养基即可形 成果实，并含成熟种子。 成果实，并含成熟种子。
（一） 胚珠培养
1、胚珠培养的意义 、
有利于合子和早期原胚的培养 胚分化不全的种子的胚培养 获得杂交后代和优良品种 离体授粉的需要 获得无病毒苗
2、胚珠培养的方法 、
长度小于3mm的胚珠， 的胚珠， 长度小于 的胚珠 难与直接解剖， 难与直接解剖，可先接 种于液体培养基中， 种于液体培养基中，根 据培养情况采取相应培 养条件。 养条件。
培养方法： （三） 培养方法： A、取授粉 、取授粉4-8d后的幼果，常规消毒 后的幼果， 后的幼果 B、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳 、无菌条件下切开果实，取出种子， C、接种在培养基上，在25-27℃和黑暗条件或散射 、接种在培养基上， ℃ 光下培养形成愈伤组织 D、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下 、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后， 不定芽 E、插入生根培养基中，光下培养 、插入生根培养基中，光下培养10-15d，切口处长 ， 出白色的不定根
二、胚胎培养的应用
1、克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 、克服远缘杂交的不育性， 2、打破种子休眠，提早结实，缩短育种年限 、打破种子休眠，提早结实， 3、使生活力低下或无生活力的种子萌发 、 4、使柑橘类植物合子胚正常发育 、 5、测定种子生活力 、 6、获三倍体或单倍体植株 、 7、快速繁殖特殊植物 、 8、用于理论研究 、
第六章 植物的胚胎培养和离体授粉
三、离体授粉
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• 在无菌条件下，培养离体的未受精雌蕊或 胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉管进 入胚珠，完成受精过程而获得有生活力种 子的技术。
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（一）离体授粉的基本技术过程
• 1、亲本的选择：
– 父本（收集花粉）：
• 套袋（时期） 表面消毒（时期） 花粉收集（时期）
– 母本（选取雌蕊或胚珠）：
• 克服植物远源杂交不亲和性 • 克服自交不亲和性
• 诱导孤雌生殖
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四、 植物胚乳培养
胚乳培养（Endosperm culture）： 是指将胚乳组织从母体上分离出
来，通过离体培养，使其发育成完整
植株的技术。
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（二）概述 胚乳培养的最早研究始于1933年，Lampe和 Mills首例进行了玉米胚乳培养。胚乳培养的 研究主要集中在以下一些问题的探讨： 胚乳细胞的全能性。在离体培养条件下， 胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具 有全能性而再生植株。
（二） 子房培养
• 1、子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。
• 2、未授粉子房培养应注意的问题：
1、材料的选择：开花前1~5天的花蕾，发育时期（ 接近成熟胚囊易于成功）；可部分保留花被。 2、培养基：基本培养基（MS、N6、B5等）、植物 激素（配合使用）、蔗糖浓度（3-10%） 3、培养方式：直插优于平放。
大多数被子植物的胚乳是三倍体，能否通过 胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实； 通过胚乳培养技术，探索改良农、林及园 艺植物三倍体育种技术的可能性。 38
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研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。
到目前为止，已有40多种植物的胚乳进 行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞 、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马 铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植 株。其它有的分化除芽、根、叶等或得到愈 伤组织。
植物胚胎培养
（2）防止幼胚早熟萌发的方法
①提高培养基渗透压。胚龄越小要求的渗透 压（糖浓度）越高，高糖浓度控制幼胚早熟 萌发的效果早已被证实。下述实例阐明不同 胚龄对糖浓度的要求。
②提高无机盐浓度。提高无机盐浓度也是为 了提高培养基渗透压。可加入适量的NaCl 以提高渗透压，浓度一般为0．2％－0．4 ％，超过0．8％对胚有毒害作用。
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（二）幼胚
发育早期的幼胚，由于胚胎发育要求更 为完全的人工合成培养基，而且剥离技 术要求很高，用成熟胚的培养方法很难 成功，可以采用胚珠预培养的方法。
具体做法：将授粉后的子房剥出用药剂
进行表面消毒，在无菌条件下切取胚珠
进行预培养。培养一定时间后，再将胚
从胚珠中剥出，接着培养裸露的胚，使
曼陀罗：5.0一8.1
水稻：5.0
番茄： 6.50
大麦：4.9
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(三) 环境条件对胚性发育的影响
1）光照条件：
由于胚在胚珠内发育是不见光的。一 般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适 宜。光照对胚胎发育有轻微抑制作用， 离体培养条件下，幼胚正常胚性发育对 光的要求，还应根据植物种类来决定。
③加人甘露醇提高渗透压。甘露醇的浓度为 1．l％－5．5％，以部分地代替蔗糖，使幼 胚在等渗条件下继续胚性发育。
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（二） 培养基酸碱度对胚性发育的影响
培养基酸碱度对胚性发育也是非常重 要的。通常胚培养所用pH值的范围为。 因植物种类不同而有所差异。
如：
荠菜： 5.4－7.5
桃：5.8
（五）克服种子的自然不育性
（六）种子生活力的测定
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内容 3
胚培养技术
胚培养技术1. 胚培养技术的概述胚培养技术是一种利用体外培养环境来支持和促进胚胎发育的技术。
通过控制培养条件，可以模拟体内的环境，并为胚胎提供所需的营养和生长条件，以促进其正常发育。
胚培养技术可以应用于多个领域，包括生殖医学、动物繁殖和植物育种等。
2. 胚胎的发育过程在理解胚培养技术之前，首先需要了解胚胎的发育过程。
胚胎的发育可以分为以下几个阶段：•受精：在受精过程中，精子和卵子融合形成受精卵。
•分裂：受精卵开始不断分裂，形成多个细胞。
•悬浮：细胞继续分裂并逐渐形成一个团簇。
•分化：团簇内的细胞开始分化为不同的细胞类型，最终形成胚胎。
•培养：培养胚胎提供所需的营养和生长条件，促进其正常发育。
3. 胚培养技术的应用3.1 生殖医学胚培养技术在生殖医学中扮演着重要的角色。
通过体外受精（IVF）和胚胎植入（ET）等技术，可以帮助那些无法自然受孕的夫妇实现生育愿望。
IVF是最常用的生殖医学技术之一，其过程包括将卵子和精子体外结合，形成受精卵。
受精卵随后被转移到培养皿中，通过胚培养技术提供所需的环境来促使其继续发育。
在适当的时机，医生将胚胎植入到女性子宫内，希望实现着床和宫内妊娠。
3.2 动物繁殖胚培养技术也在动物繁殖领域得到广泛应用。
通过胚胎的体外培养，可以更好地控制繁殖过程，提高繁殖效率，增强种畜的遗传品质。
胚培养技术可以用于动物的克隆、胚胎移植和生殖组织的保存等方面。
3.3 植物育种在植物育种中，胚培养技术也具有重要的意义。
通过体外培养胚胎，可以加快植物的繁殖速度和育种进程，产生更多的优良品种。
胚培养技术可以应用于植物的遗传改良、种子繁殖和病毒病防治等方面。
4. 胚培养技术的关键因素胚培养技术的成功与否取决于多个关键因素，包括培养基组成、温度、湿度、pH值和培养时间等。
培养基是支持胚胎生长和发育所需的培养介质，它通常包含多种有机物质和无机盐，以满足胚胎的营养需求。
培养基的组成需要根据不同物种和发育阶段进行调整。
胚胎培养
.
1. 培养基：
White Rangwang MS B5 Nitsch
无机盐+糖(3-5%)+生长辅助物质(维生素、AA、 椰乳等)
.
荠菜不同发育时期胚培养的营养需要
胚长度 胚龄 （μm）
营养需要（培养基营养）
早球形胚 20~60 小于40μm长的胚所需营养尚不清楚
后球形胚 61~80 大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%、 IL
心形胚 鱼雷胚
成熟胚
81~450 大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2% 451~700 Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl
胚
（2N）
一.培养类型
1、离体胚培养时期 A.异养期 B.自养期
A.异养期，完全依赖于周围细胞中的代谢，而 且依赖于周围胚乳消耗的养料。B.自养期，胚 能吸收培养基中的无机盐和糖，经过自身的代 谢作用合成其生长所必需的物质。
.
2、离体胚培养类型 ⑴成熟胚培养 ⑵幼胚培养
.
2、离体胚培养类型
据培养目的不同
➢ 无机氮：
包括硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐；
➢ 渗透压：
蔗糖，8%-10%，不同发育期，渗透压不一 样，初期高（WHY）。因为自然条件下，原 胚被一层高渗液体包围着。
➢ 复杂的天然提取物：
椰乳 CM有促进幼胚生长和分化的作用
➢ 活性炭：吸附有毒. 物质
3 . 有利幼胚培养的因素
第六章动物人工繁殖
3、异种体细胞克隆阶段
异种体细胞克隆就是将一种动物得体细胞核移植到另一种动物得去核(遗传物质)卵母细胞 中。 由于濒危物种得个体数量少,很难提供用于克隆得卵母细胞和代孕受体,这就促使科学家提 出了异种克隆得设想。 异种克隆研究面临着许多问题,如体细胞核能否在异种卵胞质中去分化并支持早期胚泡发育？ 异种核质能否相容？异种重构胚能否着床并进行全程发育等问题。 1999年,中科院动物所实验室将成年大熊猫体细胞作为供核体细胞移植到去核(遗传生物)日 本大耳白兔卵母细胞中成功地构建异种重构胚,体外培养获得孵化囊胚。 2001年将重构胚移植寄母子宫,获得了着床得重大进展。 2002年,不仅异种重构胚能够在异种寄母子宫中着床,而且还能发育,这就是异种克隆大熊猫 研究中攻克得最后一个难题中得最新进展。
试管婴儿得三个阶段:
第一代试管婴儿:最早成功得常规技术。 第二代试管婴儿:采用显微受精技术将单个精子注射进卵细胞内使其受精。适用 于男性原因得不孕,如少精、弱精等。1996年,我国第二代试管婴儿(ICSI)在中山 医科大学获得成功。 第三代试管婴儿:对体外受精得胚胎取出细胞进行遗传学诊断后再行胚胎移植。 我国第三代试管婴儿(PGD)在中山医科大学获得成功。 2000年3月,我国首例超快速冷冻胚胎移植得试管婴儿在湖南医科大学人类生殖 工程研究室诞生,标志着我国在该领域得研究已进入世界先进行列。 进一步,美国、日本、台湾正研制多胞胎和“人造子宫”以完成怀孕全过程。
胚胎工程---体外受精(IVF)(第一步骤)
精子获能就是精子获得穿透卵子透明带能力得阶段。
精子获能分为体内获能与体外获能 体内获能:精子在附睾内已经获得了受精能力,但由附睾分泌得一种物质附于精
子表面,抑制了她得受精能力,这种物质被称为去能因子。去能因子就是顶体 酶得抑制剂。 体外获能:精子通过用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获 能得过程。 2 、卵子回收及成熟培养 3 、卵子和精子得体外受精(in vitro fertilization IVF) 受精成功得标志至少就是看受精卵就是否可以发育至囊胚期阶段 4 、受精卵得体外发育及体外培养
植物的胚胎培养ppt课件
图8-1 小麦幼胚体细胞无性系（左）及其再生（右）
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幼胚的发育时期
表8-1 荠菜胚胎不同发育时期对营养的需求（引自Torrey，19
胚发育时期 胚长（μm）营养要求
球形胚早期 22-60 球形胚晚期 61-80
心形胚期 81-450
小于40 μm的胚对营养的需求不详
基本培养基（大量元素①+微量元素②+维生 素③+2%蔗糖）+IAA（0.1 mg/L）+KT （0.001 mg/L）+硫胺腺嘌呤（0.001 mg/L）
仅基本培养基
鱼雷形胚期 451-700 大量元素①+维生素③+2%蔗糖
拐杖形胚及 700及更
成熟期
大
大量元素①+2%蔗糖
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在培养中胚柄的存在对于幼胚的存活是一个关键因素。
表8-3 红花菜 豆中胚柄对胚 在离体条件下 生长和发育的 作用（引自
Yeung等， 1979）
开始培养时期① （鲜重）
心形早期 （0.87±0.02mg
维生素，对发育初期的幼胚培养来说，则是必须的。 以不加植物生长调节剂为宜。
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离体胚培养一般用固体培养基，大多数植物的 离体胚在25～30℃生长良好。一般离体幼胚 培养前期在散射光下培养，后期则要在2000 Lx光强度左右培养。
4）胚乳看护培养
非常幼小的杂种胚，采用看护培养，即把发育不 全的杂种胚埋在从正常发育的胚珠中取出的胚乳 内，培养至幼苗期。
水稻成熟胚培养
5
观赏与药用（紫杉醇） 种子有休眠特性
台湾红豆杉成熟胚培养
6
种子有休眠特性 （种皮与未完成 后熟的原因）
牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖
胚胎培养的操作步骤
胚胎培养的操作步骤一、获取胚胎在胚胎培养过程中，首先需要获取胚胎。
这一步骤通常在试管婴儿程序中进行，通过超排卵和人工受精等方法获取胚胎。
二、胚胎质量检查在获取胚胎后，需要对胚胎进行质量检查。
通过显微镜观察胚胎的形态和发育情况，评估胚胎的等级和发育潜力。
这一步骤有助于选择优质的胚胎进行培养。
三、胚胎培养液准备为了提供胚胎生长所需的营养物质，需要准备适当的胚胎培养液。
根据胚胎的发育阶段和实验需求，可以选择不同的培养液配方。
确保培养液的清洁度和适宜的温度，以维持胚胎的正常生长。
四、胚胎移植将经过质量检查的胚胎转移到准备好的培养液中，进行进一步的体外培养。
在这一步骤中，要确保胚胎在适宜的环境中顺利生长。
五、培养环境控制胚胎培养的环境对胚胎的生长至关重要。
控制培养室的温度、湿度、气体浓度等参数，确保环境条件适宜胚胎发育。
定期监测和记录环境数据，确保胚胎生长环境的稳定性。
六、观察胚胎发育在胚胎培养过程中，需要定期观察胚胎的发育情况。
通过显微镜观察胚胎形态变化，记录胚胎生长数据，评估胚胎的健康状况。
及时发现和处理异常情况，确保胚胎正常生长。
七、胚胎移植回体当胚胎发育到一定阶段时，需要将胚胎移植回母体或代孕母亲体内。
这一步骤需要根据程序指南和伦理要求进行。
确保移植过程中的安全性和有效性，关注移植后的护理和监测工作。
八、后续护理在胚胎移植后，对母体或代孕母亲进行适当的护理和监测。
这包括提供必要的医疗支持和心理辅导，以及定期进行产前检查。
密切关注母体和胎儿的健康状况，确保妊娠过程的顺利发展。
胚胎培养
4.2 原胚(幼胚)的培养的条件
很少三倍体(稳定型)，大多为二倍体，非整倍体 (畸变型)。
WHY？
畸变型胚乳类型：多倍性细胞嵌合体，核型胚乳
核型胚乳：被子植物中最普遍的胚乳发育形式。 初生胚乳核第一次分裂和以后的多次分裂不伴随 细胞壁的形成，胚乳核游离在胚囊中。
细胞型胚乳：从初生胚乳核分裂开始，产生细胞 壁，形成胚乳细胞。
• 原因: • 胚乳愈伤发生的部位：不同部位胚
畸形苗
分离变异体
未成熟幼胚
发育不正常而死（即胚性发育）
3、成熟胚的培养
3-1、材料的消毒与接种
健壮优良的个体自交种或杂交种子，常规消毒灭菌， 剥离胚。
3-2、培养基 大量元素和微量的无机盐为基本成分
谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长
附加成分
植物天然浸提物（YE）促进胚生长 硫氨素促进胚根的伸长
生长素低浓度促进胚的发育（胚根）
赤霉素促进有后熟作用的种子萌发
3-3、培养条件 pH一般为5.2~6.3
12小时光照和25C，热带兰花杂交种胚30 C
4、原胚(幼胚)的培养
• 4.1 培养方法 4.1.1 取材：子房 4.1.2 常规表面消毒 4.1.3 在高倍显微镜下 剥离幼胚，接 种 于培养基 4.1.4 送入培养室培养
4.2 原胚培养的条件
3.3 培养基成份
WT、MS＋植物激素
3.3.1 生长素＋细胞分裂素合理搭配，效果更 好
胚胎培养的技巧
胚胎培养的技巧胚胎培养是一种重要的实验技术，用于研究和应用胚胎发育的机理及其相关问题。
正确的胚胎培养技巧是保证胚胎发育正常的基础，下文将详细介绍胚胎培养的技巧。
首先，胚胎培养要使用高质量的培养基。
胚胎培养基是一种特殊的液体，里面含有胚胎发育所需的营养物质和生长因子。
常用的胚胎培养基有经典的全面培养基（例如M16或KSOM）和改进的有血清/无血清培养基（例如G1.2或KSOM-AA）。
这些培养基都需要严格的无菌操作来避免细菌、真菌和其它污染物的污染。
其次，胚胎的离体培养环境也是非常关键的。
培养箱是胚胎离体培养的重要设备，能够提供适宜的温度、湿度和气体环境。
一般来说，胚胎的培养温度为37，湿度为95%以上，培养箱内的气氛成分为5% CO2、5% O2和90% N2。
胚胎在这样的环境下能够更好地存活和发育。
另外，胚胎的操作应该尽量轻柔，以避免损伤胚胎。
在进行胚胎培养的过程中，需要使用显微操作技术将胚胎转移至新的培养皿中。
为了避免潜在的损伤，可以使用特制的胚胎转移螺丝杆或注射针来操作。
此外，胚胎的培养容器也要选择适合的大小和形状，以确保胚胎有足够的生长空间。
此外，胚胎培养过程中的时间控制也非常重要。
在胚胎离体培养的过程中，不同的发育阶段需要不同的培养时间。
例如，在小鼠胚胎培养中，受精卵需要培养约24小时才能发展成为2细胞胚，再培养约48小时才能发展成为典型的8细胞胚。
因此，控制培养时间是保证胚胎发育正常的关键。
最后，胚胎培养过程中的质量控制也是非常重要的。
胚胎的质量控制可以通过观察胚胎的形态和发育来进行。
正常发育的胚胎应该有均匀的细胞分裂和明确的细胞核存在。
通过观察胚胎的外观，可以判断其是否发育正常。
同时，还需要进行胚胎的染色体或基因分析，以检查胚胎是否有染色体异常或基因突变。
总之，胚胎培养是一项复杂而精细的实验技术，需要注意许多细节。
正确选择培养基，提供适宜的培养环境，轻柔操作胚胎，控制培养时间和进行质量控制都是保证胚胎培养成功的关键。
胚胎培养
件不同而相互转化的问题。
（4）按预决定观点，生长素对由直接途径和间接途径体 细胞胚发生的作用
的体细胞胚的确是起源于多细胞，仍有待深入研究。
**总之，体细胞胚胎的发生是一个非常复杂的生理过程，仍 有许多问题尚需进一步研究。
四、体细胞转变为胚性细胞的机制
**合子胚来源于受精卵； 体细胞胚是非合子胚，未
**体细胞胚无论起源于哪一种细胞，
都存在着一个共同的问题，即体细
经过雌雄配子受精这一过
程，机制是什么？
单倍体植株。
植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显
的特点：
1、具有两极性
2、存在生理隔离
3、遗传性相对稳定
二、体细胞胚胎发生的方式 **植物组织培养过程中植物体细胞胚胎途径可归纳为 两类：直接途径和间接途径。 **直接途径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育 而成 **间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从 已形成的体胚的一组细胞中发育而成，如香雪兰 （Freesia refracta）花序外植体经直接体细胞胚胎 发生途径形成再生植株。
（1）成熟胚培养
（2）幼胚培养
双子叶植物胚的发育途径
原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷 胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体
成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。 它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培
养基上，就能正常生长成幼苗。由于种子外部有 较厚的种皮包裹，不易造成损伤，易于进行消毒， 因此，将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒种 的表面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌 条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基 上培养。
植物胚胎培养
减数分裂
中央细胞
过图 程示
为 胚 珠 和 胚 囊 的 发 育
精选版课件ppt
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据培养目的不同
胚培养
剥取的离体胚发育时 期的不同
幼胚培养 成熟胚培养
成熟胚培养一般较易获得成功
精选版课件ppt
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（一）幼胚培养 幼胚完全是异养的，离体条件下培养要求
培养基成分复杂，培养不易成功。
幼胚培养的关键技术： 取材时期 幼胚剥离 培养条件的控制（是否需要特殊处理）
木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱导 产生callus
精选版课件ppt
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B、培养基和激素的影响 培养基：MS、B5、MT、White、LS等
水解酪蛋白、酵母提取物也很必要
激素：要求特殊
大麦胚乳只有在添加2，4-D的培养基上才能生长 猕猴桃胚乳培养中，玉米素最好 枣的胚乳培养中，激素似乎无特殊要求
数量 （mg/L）
500 125 125 125
0.025
成分
ZnSO4 7H2O
MnSO4 4H2O H3BO3 FeC6O5H7 5H2O Gly
数量 （mg/L）
成分
0.5
VB1
3.0
VB6
0.5
烟酸
10.0 蔗糖
7.5
琼脂
数量 （mg/L）
0.25 0.25 1.25 50 000
7 000
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4、离体受精的细胞学研究现状
（1） 配子识别——判别糖蛋白的作用 利用分离的雌、雄配子对其细胞膜特征，如表面膜蛋白
特别是糖蛋白的分布等直接进行分析，这可以帮助判断 糖蛋白在被子植物中是否和在动物及低等植物中一样是 配子识别必不可少的；
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第六章胚胎培养
一、胚胎培养的意义
1.概念
胚胎培养指胚及其胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下，使胚发育成幼苗的技术2.分类
广义: 离体胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养、试管受精、胚轴、胚芽等
狭义：离体胚培养（成熟胚培养、幼胚培养）
3.意义
可克服一些早熟品种胚早期败育现象，从而缩短育种周期，增加种子发芽度
可克服远缘杂种的不育性
利用胚乳培养可获得无籽的三倍体果实
可用于研究与胚发育有关的内外因素以及有关的代谢和生理生化变化
4.发展简史
1904年，Hanning培养萝卜、辣根的胚，提前萌发成苗，成为世界上胚胎培养最早成功的一例
30年代，Tudey培养多种果树胚胎获得成功
1942年，Dietrich对十字花科、豆科、菊科、葫芦科和禾本科的多种植物离体胚培养进行研究
二、离体胚培养
（一）成熟胚培养
指子叶期后至发育完全的胚的离体培养
易成功，在含有大量无机无素和蔗糖的培养基上培养即可萌发
培养目的
研究发育过程的形态建成、激素的作用、营养要求等生理问题
培养方法
消毒（种子70%酒精5-30`表面消毒---饱和漂液或0.1%升汞10-30 min----无菌水冲冼3-4次）——取胚（无菌解剖,直接取胚）——培养（置于培养基上培养----萌发成苗）
（二）幼胚培养
1.概念
指子叶期以前的具有胚结构的幼小胚培养
2.培养方法
包括消毒(子房)、取胚、接种。
需在高倍解剖镜下取胚，操作要细心
3.胚发育方式
a.胚胎发育：即按胚胎的正常发育途径生长发育最后成苗，是最理想的发育方式
b.胚性发育：培养的幼胚可增大，但不能萌发成苗，只呈现胚性生长
克服方法
1.提高渗透压
2.改变激素的种类或浓度
3.加入天然复合物
4.改善培养条件(pH、温度、光）
c.早熟萌发：指离体培养的幼胚越过正常胚胎发育阶段,在未达到生理和形态成熟的情况下,萌发长成幼苗。
形成畸形、弱苗或死亡.
克服途径:提高培养基渗透压(蔗糖、无机盐、甘露醇) 胚龄越小要求的渗透压（糖浓度）越高。
产生愈伤组织或胚状体
生长调节剂浓度高时易形成愈伤组织
4.影响胚培养成功的因素
○1胚的发育程度：胚越小, 离体培养难度越大
○2培养基
a.基本培养基：MS、B5、white
b.碳源：蔗糖最佳，2-4%。
重要作用是调节渗透压
不同发育时期的胚要求不同浓度的蔗糖浓度，胚年龄越小，蔗糖浓度越高
结论：
渗透压与幼胚生长关系密切，胚越小，Vp要求越高
在胚培养中，要定期将胚转移到逐渐降低Vp的培养基中
推论：
高渗透压调节胚的生长，减少由于低渗而造成对从高渗环境中分离出的胚的影响
高渗可抑制早熟萌发，并把细胞的伸长状态转到分裂状态
c.生长调节物质：IAA、KT、GA等合理浓度配比
不同植物的胚培养要求的生长物质不同（种类、浓度等）
在培养一种新的植物幼胚之前，对生长物质合理的种类、浓度进行筛选
d.胚乳营养物质
研究表明，培养基中添加胚乳抽提物可促进幼胚生长
小胚接种于破碎的胚乳上培养成功率提高
e.天然复合物：椰子汁、椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白
○3胚胎培养的环境条件
a. 温度
通常25-30℃。
有些种类、品种需低温打破休眠
b. 光照
黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜
促进胚芽生长，抑制胚根生长
根据植物种类决定光照条件
c. pH 值
通常5.6-5.8之间。
有同植物种类,最适pH不同
三、胚珠培养
（一）胚珠培养的目的
克服幼胚培养难度大,不易成功
有些种类成熟胚很小,取胚珠培养较易成功
利用未受精的胚珠培养可诱发大孢子发育成单倍体
（二）胚珠培养的发展
1932年,white,胚珠培养,使胚珠只进行了很有限的生长
1942-1943年,withner,兰花胚珠培养,获得成熟种子
1958年,Maheshwari,培养授粉5天的罂粟胚珠成功,在试管内萌发成苗
胚珠培养还处于试验摸索阶段,育种方面的应用也刚开始,园艺植物如洋葱、四季桔、矮牵牛、凤仙花等胚珠培养获得成功
（三）培养方法
授粉或未授粉子房——表面消毒——无菌解剖——取出胚珠——培养
培养基：
基本培养基：Nitsch、white常用；MS、B5、N6
添加物：生长调节特质+其它（糖、V、椰乳等）
（四）胚珠离体培养的原理
胚是一个完整的细胞体系,位于胚珠之中,它与包围着它的胚珠其他部分构成一个整体.当进行离体培养时,胚珠与培养接触,胚也会受到来自培养基中的各种因素的刺激,发生反应
离体培养的胚,发育受到外源物质和胚珠中本身存在的内在因素的共同作用
提供胚生长的适合内在和外在的因素,是取得胚珠培养成功的关键
（五）影响离体胚珠培养成功的因素
1.胚的发育时期
发育时期越早,越难培养成功。
球形期以后的胚珠培养较易成功
2.胎座和子房的影响
带有部分胎座和子房组织的胚珠培养较易成功
影响机制不祥
3.培养基附加物质的影响
添加复合物对许多植物的胚珠培养有效
不同植物、不同发育时期添加物种类、数量不同
四、子房培养
（一）概念：子房培养指受粉或未受粉的子房的离体培养
受粉的子房----成熟胚
未受粉子房----单倍体植株
（二）培养方法
1.材料消毒
未受粉子房----花被包裹，只需对花蕾灭菌即可
受粉的子房----需表面灭菌
2.材料的选择
未受粉子房----选取卵细胞适宜的发育时期.通常接近成熟时的子房培养较易成功
3.培养基
基本培养基：MS、White、Nitsch、Heller等；N6、B5用于禾本科植物
适当添加生长素类物质有效
碳源多用蔗糖，浓度3-10%
4.环境条件
T：22-27℃，冬作物可低些
光照：500-1500lux
5.附属花器
附属花器对胚发育生长有利
机制不祥
6.子房植株的倍性
子房存在两种细胞（性细胞和体细胞），子房植株出现混倍现象
获得单倍体要促进大孢子细胞分裂，抑制体细胞分裂
五、离体受精（试管受精）
（一）概念：试管受精指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，花粉萌发产生
的花粉管进入胚珠，从而完成受精过程的技术
（二）意义
克服自交不亲和性
克服杂交时受精遇到的一些障碍
缺点：
花粉不能在柱头上萌发
花粉管太短
生长太慢
（三）方法
1.花粉收集
花蕾开放前数天,将花套袋,开花当天或前一天,取尚未裂开的花蕾,常规表面灭菌,无菌条件下收集花粉
2.剥取子房和胚珠
开花前一天,对花套袋,去雄,开花前一天或花后1-2天,将花蕾取下,常规表面消毒,无菌条件下剥取子房或胚珠
3.离体授粉受精
将花粉撒在培养基上,再将子房接种上去,待花粉萌发,伸入珠孔受精
将子房接种到培养基上,再将花粉直接撒在子房上,直接萌发受精
4.胚培养
将授粉受精后的子房移至Nitsch固体培养基上培养
胚形成后移至胚培养基上培养
（四）影响试管受精成功的因素
1、离体胚珠的成活率和受精力，关键是培养基。
2、花粉萌发和花粉管的生长速度，关键是培养基,注意钙和硼的作用。
3、花粉的灭菌，新鲜花蕾浸渍灭菌,然后剥出花粉使用。
紫外线照射灭菌,15min。
六、胚乳培养
胚乳为胚的发育和种子萌发时幼苗生长提供营养物质
被子植物的胚乳为双受精的产物，所以通常为三倍体
裸子植物的胚乳由雌配子体发育而来，为单倍体
早在三十年代，人们就进行了胚乳培养，已证明胚乳细胞同样具有潜在的形成发生能力，只要条件适宜“全能性”即可表现出来
（一）胚乳培养的意义
1.基础理论方面
了解胚乳的全能性
了解胚与胚乳的相互关系
研究胚乳细胞合成蛋白、糖等物质的生理机制
2.育种方面
胚乳植株染色体倍性不稳定，多数为多倍体和非整倍体，从而为园艺植物多倍体遗传育种提供丰富的原始材料
胚乳培养可获得无籽结实的三倍体植株
胚乳培养的遗传基础2/3来自母本，从而提高对育种后代的预见性
（二）胚乳培养的方法
1.愈伤组织的诱导
取授粉4-8天的幼果——表面灭菌——无菌取出胚乳——接种——愈伤组织2-30mm——分
化培养基——胚乳植株
○1MS、White、LS，2.4-D 0.5-2.0 mg/ml，BA 0.1-1.0 mg/ml，蔗糖2-3%，黑暗或弱光
○2MS、White，NAA 0.5-2.0 mg/ml，BA 0.5-3.0 mg/ml，充足的光照，注意转移时愈伤的年龄
（三）胚乳植株的倍性
多数胚乳植株都是由具有多种数目的染色体细胞组成的嵌合体
可从中筛选取出各种类型非整倍体，在遗传育种中具有一定利用价值
目前为止，胚乳培养成功的例子十分有限，应深入开展这方面的研究，尽快开辟诱导形成三倍体植株的途径
（四）胚乳离体培养的研究进展
仅能形成愈伤组织：黄瓜、檀香、小麦、沙针、黑麦草、美洲槲寄生、澳洲根寄生
达到器官分化水平：玉米、蓖麻、巴豆、变叶木、葡萄荷叶芹、黑种草等
形成完整植株：大麦、水稻、苹果、柚、橙、马铃薯、桃、荷叶芹。