第9章 胚胎培养与人工种子

（3）人工胚乳
胚乳是胚胎发育的营养条件，因此 人工胚乳的基本成分仍是胚发育所需各 类营养成分，此外，还可根据需要添加 激素、抗生素、农药等成分，以提高人 工种子的抗性与品质。
人工种子
三、人工种子的意义
1、人工种子结构完整，体积小，便于 贮藏与运输，可直接播种，易于机械化 操作； 2、不受季节限制，不受环境制约，胚 状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生 产；
※两种植物胚乳培养的方法
A、枸杞
开花20d的枸杞胚乳 MS + 2，4-D 0.2mg/L
callus
生根
MS
分化出苗
MS + BA 0.2mg/L
不同倍性的胚乳植株
B、葡萄
取出种子 切去合点部分
接种
White + CM10% + 2，4-D 2.0 + CH 500 +KT 1.0 + 蔗糖 3%~4% 琼脂8%
2、胚培养 指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中 分离出来，置于培养基上进行离体培养的 方法。
胚 电 镜 扫 描 图 片
双 子 叶 植 物 胚
3、胚乳培养 指处于细胞期的胚乳组织的离 体培养。
4、胚珠培养 指未受精或受精后的胚珠离体 培养。
不同植物的胚珠形态结构
倒生胚珠
5、子房培养 指授粉和未授粉的子房培养。它对 于研究果实发育的生理、离体受精等有 重要意义。
成熟胚
小于40μ m长的胚所需营养尚不清楚 大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%、 IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L 81~450 大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2% 451~700 Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl 42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、 VB6、烟酸、糖2% 700（最 Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl 大极限） 42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%
（二）成熟胚培养 成熟胚是自养的，培养基需要简单。 主要目的: ◆研究胚发育过程的形态建成 ◆生长调节物质的作用 ◆胚与胚乳相互关系和营养要求
培养方法： A、将受精后成熟或未成熟种子或果实， 用70%—75%酒精表面消毒消毒几分钟 B、用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消 毒10min，无菌水反复冲洗 C、无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥 取胚接种在培养基上
特点：
初生胚乳核的分裂开始，即产生细胞 壁，形成胚乳细胞
◆ ◆
无游离核时期
大多数双子叶合瓣花植物是这样的胚 乳，如番茄、烟草、芝麻等。
3、沼生目型胚乳
◆ ◆
核型胚乳与细胞型胚乳的中间类型
初生胚乳核的第一次分裂将胚囊分隔 为两室，其中珠孔端室比合点端室宽大 核进行分裂形成状态的游离核，最后 形成细胞
三、胚的培养
指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离 出来，置于培养基上进行离体培养的方法。
植物胚结构
胚 电 镜 扫 描 图 片
双 子 叶 植 物 胚
据培养目的不同
幼胚培养 成熟胚培养
胚培养
剥取的离体胚发育时 期的不同
成熟胚培养一般较易获得成功
（一）幼胚培养 幼胚完全是异养的，离体条件下培养要求 培养基成分复杂，培养不易成功。 幼胚培养时，其发育过程有以下几种发育 方式： a、胚性发育，此种方式不能萌发成苗 b、早熟萌发，长成的苗十分瘦弱 c、产生愈伤组织，再由愈伤组织分化形成 胚或不定芽
◆
（二）胚乳培养的关键
A、胚乳发育时期的影响
发育早期胚乳：操作不便，诱导率低
游离核期或刚转入细胞期的核型胚乳：难得callus 旺盛生长期胚乳：易诱导产生callus
★ 旺盛期胚乳特征
§胚已分化完成
§胚乳已形成细胞组织 §充分生长，达到成熟大小 §外观为半透明的固体状 §富有弹性
一些草本植物胚乳培养的适宜取材时期 水稻：授粉后4 d 黄瓜：授粉后7 ~ 16 d 黑麦草：授粉后8 ~ 10 d 梨：授粉后20 d
（一） 胚珠培养
1、胚珠培养的意义
有利于合子和早期原胚的培养
胚分化不全的种子的胚培养 获得杂交后代和优良品种 离体授粉的需要 获得无病毒苗
不同植物的胚珠形态结构
2、胚珠培养的方法
长度小于3mm的胚珠， 难与直接解剖，可先接 种于液体培养基中，根 据培养情况采取相应培 养条件。
（二） 子房培养 1、子房培养的意义
1、核型胚乳 ◆被子植物中普遍的胚乳发育形式
◆初生胚乳核的第一次分裂和以后的多次分裂，
都不伴随壁的形成
◆各个胚乳核呈游离状态分布在胚囊中 ◆发育到一定阶段后，常在胚囊外围的胚乳核
之间出现细胞壁 ◆为单子叶植物和具有离瓣花的双子叶植物中 普遍存在，如小麦、水稻、玉米、棉花、油菜、 苹果等
2、细胞型胚乳
3、有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、 珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒 材料； 4、可在人工种子中加入抗生素、农药、菌 肥等成分，提高种子活力和品质； 5、体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固 定杂种优势。
四、人工种子技术
6、试管受精 指在无菌条件下培养离体的未受精 子房或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的 花粉进入胚珠而完成受精过程。
二、胚胎培养的应用
1、克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 2、打破种子休眠，提早结实，缩短育种年限 3、使生活力低下或无生活力的种子萌发 4、使柑橘类植物合子胚正常发育 5、测定种子生活力 6、获三倍体或单倍体植株 7、快速繁殖特殊植物 8、用于理论研究
2、人工种子的结构
（1）胚状体（或芽） 人工种子的胚主要是指体细胞胚，此 外还有顶芽、腋芽、小鳞茎等也可以做为 人工种子的胚。
（2）人工种皮 特点： ◆对胚状体或芽无毒害 ◆柔软且有一定机械抗压能力 ◆能保持一定水分及营养物 ◆允许种皮内外气体交换通畅 ◆不影响胚萌发突破 ◆播种后易于化解 目前人工种皮常选用的材料有藻酸盐 等水凝胶、琼脂糖、角叉胶等。
2、母体组织的影响 柱头可影响某些植物受精，应切除柱 头和花柱。 而有些植物则需要保留，更有利于离 体受精，如烟草。 3、花粉萌发和花粉管生长 离体花粉萌发率和花粉生长速度直接 影响试管受精成功率。
荠菜不同发育时期胚培养的营养需要
胚龄 早球形胚 后球形胚 心形胚 鱼雷胚 胚长度 （μ m） 20~60 61~80 营养需要（培养基营养）
CuSO4 5H2O
Na2MoO4
蔗糖浓度是4% ~ 5%，水解酪蛋白为500mg/L，利于花粉 萌发和种子发育
3、离体受精障碍
★花粉在柱头上不萌发
★花粉管不能进入胚珠 ★花粉在花柱中破裂 ★受精后，胚和胚乳之间的不亲和性 ★受精后，胚乳发育不良 ★杂种胚不能发育成熟
七、影响因素
1、胚珠（子房）的成活率及育龄 离体胚珠（子房）培养的成活率直接 影响试管受精的成功率。 胚珠（子房）离体成活率的关键是培 养基成分的筛选。
四、胚乳培养
胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子 结合而成的3倍体组织。由它可获得无子结实的3 倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。
不同胚乳发育类型及发育时期直接影响外植 体取材时期以及胚乳细胞产生愈伤组织频率。
胚乳培养的后代，常发生细胞染色体数目变 化，形成多倍体、非整倍体等。
（一）胚乳的发育类型
★有效地挽救杂种胚的败育
★单倍体植株的培育 ★离体授粉的需要 ★离体条件形成果实 ★花被功能研究
2、子房培养的方法
授粉或授粉 后的子房
表面消毒
接种培养
受精后的子房仍需进行表面消毒后再 接种。而未受精子房可将花被表面消毒后， 在无菌条件下直接剥取子房接种。
子房培养只需较简单的培养基即可形 成果实，并含成熟种子。
激素：要求特殊
大麦胚乳只有在添加2，4-D的培养基上才能生长
猕猴桃胚乳培养中，玉米素最好
枣的胚乳培养中，激素似乎无特殊要求
C、其他因素的影响
蔗糖浓度：3% ~ 5%
温度：25℃
pH值：如 玉米 6.1 ~ 7.0 ； 苹果 6.0 ~ 6.2等
（三） 培养方法： A、取授粉4-8d后的幼果，常规消毒 B、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳 C、接种在培养基上，在25-27℃和黑暗条件或散射 光下培养形成愈伤组织 D、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下 不定芽 E、插入生根培养基中，光下培养10-15d，切口处长 出白色的不定根
离体受精及植株再生过程
花粉 试管内 授粉
胚珠
10d后
胚珠 培养 3周后
2、技术关键
A、花粉的采集和灭菌
★确定开花、花药分裂、授粉、花粉管进入
胚珠和受精作用时间
★去雄后将花蕾套袋隔离 ★采集花粉粒 ★消毒 ★无菌条件分裂花粉 ★授粉
B、外植体选择
★开花前套袋、去雄 ★开花后1 ~ 2d，采集花蕾，放入无菌室培养准备 ★切去柱头，防止不授粉 ★胚珠剥离时间（开花后1 ~ 2d效果好）
第九章 植物胚胎培养与人工种子
第一节 植物胚胎培养
第二节 人工种子
第一节 植物胚胎培养
植物胚胎培养包括幼胚培养、成熟 胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培 养和试管受精等内容。
植物胚胎结构
一、胚胎培养概念
1、胚胎培养 指使胚或具胚器官在离体无菌条件 下发育成幼苗的技术。 广义胚胎培养研究还包括胚乳培养 和试管受精等技术。
六、植物离体授粉受精
离体受精技术的突破的技术前提： a、雌配子和雄配子分离技术 b、单对原生质体融合技术 c、微培养技术
1、离体受精方法 开花前数天套袋，开花前一天或当天取 花蕾或花药，表面消毒后，无菌条件下收集 花粉。 采用直接引入法、注射法进行子房试管 授粉，或者是采用哺育法、接近法进行胚珠 试管授粉。
大麦：授粉后10 ~ 20 d
玉米和小麦：授粉后8 ~ 12 d
一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus诱导率很低， 甚至无callus 木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱 导产生callus
B、培养基和激素的影响 培养基：MS、B5、MT、White、LS等 水解酪蛋白、酵母提取物也很必要
C、适合的培养基
离体受精的主要过程
⊙花粉的萌发和花粉管的生长，受精
⊙受精胚珠发育为成熟的种子，存在生活力的胚
培养基应促进受精后的胚珠正常发育
离体受精胚珠培养的改良Nitsch（1951）培养基配方
成分 Ca（NO3） 2 4H2O KNO3 KH2PO4 MgSO4 7H2O 数量 （mg/L） 500 125 125 125 0.025 0.025 成分 ZnSO4 7H2O MnSO4 4H2O H3BO3 FeC6O5H7 5H2O Gly 泛酸钙 数量 （mg/L） 0.5 3.0 0.5 10.0 7.5 0.25 成分 VB1 VB6 烟酸 蔗糖 琼脂 数量 （mg/L） 0.25 0.25 1.25 50 000 7 000
1个月，胚乳愈伤组织长大，胚解体
五、胚珠和子房培养
未授粉胚珠和子房培养是离体受精的基础， 可诱发大孢子发育成单倍体植株，且孤雌产生 的单倍体植株获得率较孤雄生殖高。 胚珠培养中，已授粉具有球形胚或更后期 的胚珠易培养成种子，且培养基及添加成分相 对要求不高。而受精不久的胚珠则需要成分复 杂的培养基，培养难度大。
荠菜不同发育时期胚培养的营养需要
胚龄 早球形胚 后球形胚 心形胚 鱼雷胚 胚长度 （μ m） 20~60 61~80 营养需要（培养基营养）
成熟胚
小于40μ m长的胚所需营养尚不清楚 大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%、 IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L 81~450 大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2% 451~700 Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl 42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、 VB6、烟酸、糖2% 700（最 Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl 大极限） 42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%
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第二节
人工种子
一、人工种子的概念
人工种子是指植物 离体培养中产生的胚状 体或不定芽包裹在含有 养分和保护功能的人工 胚乳和人工种皮中所形 成的能发芽出苗的颗粒 体。
二、人工种子的类型及结构
1、人工种子主要包括： a、裸露的或休眠的、经过或未经过干燥 处理的繁殖体 b、用聚氧乙烯等多聚体包裹的繁殖体 c、用水凝胶包裹的繁殖体 d、液胶包埋的、用流质播种法播种的体 细胞胚