ww大黄素影响钙敏感性调节机制的研究
大黄素增强结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道的表达(1)解读
大黄素增强结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道的表达(1)】目的：研究大黄素对结肠近端平滑肌细胞钙离子依赖氯离子通道（ClCa channel）的作用。
方法：采用RM6200四道仪记录黄体酮对平滑肌的等长收缩活动作用，相对定量的单细胞RT PCR法检测平滑肌细胞ClCa通道mRNA的表达。
结果：大黄素显著增强离体结肠平滑肌肌条和单个平滑肌细胞的收缩，并可使ClCa电流显著增强，作用与剂量呈正相关。
DIDS和NFA可阻滞大黄素的作用。
豚鼠近端结肠平滑肌细胞有ClCa1和ClCa2基因的mRNA表达，ClCa1基因的mRNA表达强度是ClCa2基因的mRNA的5.3±0.71（n=5,P<0.01）倍。
50μM大黄素孵育可以使ClCa1基因的mRNA表达增强（n=5,P<0.01）。
结论：大黄素可通过兴奋氯离子通道电流引起结肠平滑肌收缩，大黄素对氯离子通道兴奋作用可能与增强结肠平滑肌细胞ClCa1基因表达有关。
【关键词】结肠；平滑肌细胞； ClCa通道；膜片钳；豚鼠大黄素(emodin) 是大黄(Rhubarb)有效成分蒽醌类衍生物之一，已被证实可增强肠道蠕动，促进平滑肌细胞的收缩活动［1,2］。
钙离子依赖氯离子通道(Ca2 activated Cl- channels, ClCa Channel)是平滑肌组织中非常重的，与收缩密切相关的离子通道。
而大黄素对ClCa通道的作用，国内外未见相关报道。
本研究利用全细胞膜片钳和相对定量的单细胞RT PCR等技术研究大黄素对大鼠近端结肠ClCa通道以及基因表达的影响，进一步探讨大黄素促结肠动力作用机制。
1 材料与方法1 1 标本制备健康成年清洁级豚鼠，250～300g，雌雄不拘，卒击枕部至昏，断颈放干血液，剖腹取6cm 左右长的近端结肠，迅速放入充以95 % O2 和5 % CO2的混合气的Tyrode 液中，沿肠系膜纵行剪开，将去黏膜的组织剪成宽3 mm、长15 mm 的结肠带肌条和环行平滑肌肌条。
大黄单蒽醌类单体的组合抑制脂多糖升高巨噬细胞[Ca2+]i的作用特征
![大黄单蒽醌类单体的组合抑制脂多糖升高巨噬细胞[Ca2+]i的作用特征](https://img.taocdn.com/s3/m/355fbd1b227916888486d78c.png)
大黄单蒽醌类单体的组合抑制脂多糖升高巨噬细胞[Ca2+]i的作用特征刘慧君，陈立君，胡芬，周学远，杨文修南开大学生物物理系, 生物活性材料教育部重点实验室（300071）email:yangwenx@摘要：利用细胞钙离子成像分析系统检测单细胞内自由钙离子浓度（[Ca2+]i）的动态变化，来研究大黄单蒽醌类单体：大黄素（Emodin）、大黄酸（Rhein）、芦荟大黄素（Aloe-emodin）和大黄素甲醚（Physcion）的不同组合方式对细菌脂多糖 (LPS）刺激的大鼠腹腔巨噬细胞（PMφ）[Ca2+]i的影响。
结果显示：大黄酸分别与大黄素、大黄素甲醚或芦荟大黄素两药组合都显著抑制LPS刺激PMφ的[Ca2+]i升高，体现了药物的协同抑制作用，并进一步证实，其中大黄酸起着关键作用；而大黄素和芦荟大黄素组合对LPS的作用没有明显影响。
大黄酸、大黄素和芦荟大黄素（或大黄素甲醚）三药组合更显著抑制了LPS刺激的[Ca2+]i升高，其效应均强于三药单独或两药组合对LPS的抑制作用，大黄酸的参与显著改变了大黄素和芦荟大黄素（或大黄素甲醚）组合对LPS刺激的[Ca2+]i的影响性质。
四种大黄单蒽醌类单体组合能够完全消除LPS刺激的PMφ [Ca2+]i升高。
以上结果表明：不同药物组合方式可以适应调节巨噬细胞免疫活性的不同需要，并提示，大黄酸可能通过抑制其他单体自身活化PMφ的机制，而在组合药物对LPS的抑制效应中起关键作用。
关键词：单蒽醌类单体；药物组合；腹腔巨噬细胞；脂多糖； [Ca2+]i1.引言由感染、创伤、缺血及再灌注等产生的肠源性内毒素（细菌脂多糖，LPS）活化巨噬细胞等免疫细胞，失控性释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素类（Ils）等多种炎性介质，继而通过活化内皮细胞、激活补体等途径造成多脏器组织损害，引发多脏器功能不全综合征(MODS)，病情恶化会造成器官功能衰竭甚至导致死亡[1,2]。
因此，研究LPS刺激巨噬细胞失1控性释放细胞因子和药物对其作用的机理，开发新型有效治疗药物，已成为近年生命科学和医学合作研究的热点。
大黄素抗肿瘤分子机制的研究进展
大黄素在细胞内呵产生ＲＯＳ，并且在多种肿瘤细 胞中低剂量大黄素即可增强Ａｓ：Ｏ，的细胞毒作用；而 在高浓度情况下，大黄素在体内和体外实验中均能独 立发挥细胞毒作用。该效应涉及到氧化还原介导的 ＮＦ—ＫＢ、ＡＰ．１活性抑制。Ｙｉ Ｊ等口纠实验证实，低浓度 的大黄素（０．５—１０斗ｍｏｌ／Ｌ）与Ａｓ：０，合用后，通过产 生ＲＯＳ及ＲＯＳ介导的促存活转录因子ＮＦ．ＫＢ、ＡＰ—ｌ 活性抑制，可增强ＨｅＬａ细胞对Ａｓ：０，的敏感性。 Ｗａｎｇ ＸＪ等Ⅲ’进一步通过基于ｃＤＮＡ芯片的全基因转 录谱研究证实，Ａｓ：Ｏ，与大黄素共处理与Ａｓ：Ｏ，单独 处理相比，ＨｅＩ。ａ细胞大量的基因表达具有显著性差 异，这些基因参与细胞功能的不同方面。除氧化还原 调节和凋亡外，ＲＯＳ还影响细胞信号转导、细胞器功 能、细胞周期和细胞骨架等相关蛋白编码基因的表达。 在Ａｓ：Ｏ，细胞毒的基础上，大黄素能进一步增强 Ａｓ：Ｏ，诱导的细胞凋亡。
和Ｓ等¨＂实验表明，大黄素通过对ＦＡＫ，
ＥＲＫｌ／２、Ａｋｔ和ＡＰ一１、ＮＦ—ＫＢ转录活性的抑制作用，能 够有效抑制透明质酸诱导的ＭＭＰＯ分泌及神经胶质 瘤的侵袭与转移。Ｈｕａｎｇ Ｑ等旧驯实验亦表明，大黄素 体外能抑制ＴＰＡ诱导的ＨＳＣ５、ＭＤＡ．ＭＢ０２３１细胞侵 袭，这主要是通过阻断ＡＰ一１、ＮＦ－ＫＢ信号通路而抑制 ＭＭＰ－９的表达。大黄素抑制ＥＲＫ、ＪＮＫ而不是Ｐ３８ ＭＡＰＫ的磷酸化，导致ｃ—Ｊｕｎ磷酸化和ＡＰ－１ ＤＮＡ结合 的减少。此外，大黄素还能抑制ＴＰＡ诱导的ＩＫＢａ降 解，Ｐ６５的核转位及ＮＦ—ＫＢ的ＤＮＡ结合活性。Ｈｕａｎｇ Ｑ等旧¨还证实，Ｐ１３Ｋ亦是大黄素作用的分子靶点，大 黄素可显著抑制ＥＧＦ诱导的Ｃｄｅ４２和Ｒａｃｌ激活以及 相应的细胞骨架改变，通过干扰Ｃｄｃ４２／Ｒａｃｌ与Ｐ２１ 激活激酶复合物的形成，阻断Ｐ１３Ｋ—Ｃｄｃ４２／Ｒａｃｌ信号 通路而抑制了肿瘤细胞迁移。
大黄素的原理
大黄素的原理大黄素是一种天然植物色素，属于类胡萝卜素家族。
它在植物中起着重要的生理功能，并对人体健康有着多种益处。
大黄素的原理主要包括它的化学结构、抗氧化活性、光敏性等方面。
首先，大黄素的化学结构决定了它的功能。
大黄素的分子式为C40H56O2，它由四个异戊二烯环共同结合而成，其中的双键和离域电子对使得大黄素具有很强的抗氧化能力。
这种化学结构使大黄素能够承担多种生理功能，如光保护、色彩鲜艳等。
其次，大黄素的抗氧化活性是其重要的生理功能之一。
由于大黄素具有很强的捕捉自由基的能力，它能够减少细胞内的氧自由基的产生，防止脂质过氧化反应的发生，提高细胞的抗氧化能力。
而氧自由基的过多产生与许多疾病的发生密切相关，如癌症、心血管疾病等。
因此，大黄素的抗氧化活性能够帮助减少自由基对细胞的损害，预防和改善多种疾病。
另外，大黄素还具有光敏性。
光敏性是指物质在光照下会发生光化学反应的特性。
大黄素能够吸收特定波长的光线，激发其电子结构转变，形成激发态的大黄素分子。
这种光敏性使大黄素在光敏过程中将光能转化为化学能，进而参与光合作用等生物过程。
光合作用是植物中重要的能源供应路径，它能够将阳光能转化为化学能，并合成有机物质。
大黄素作为光敏色素，能够接受光子的能量，转化为光合作用所需的化学能量，促进植物的生长和发育。
此外，大黄素还具有抗炎和免疫调节功能。
炎症是人体对损伤或感染的一种非特异性免疫反应，旨在修复受损组织或抵御病原微生物入侵。
大黄素作为抗氧化剂和抗炎物质，能够减轻炎症反应，抑制炎症细胞的活化和释放炎症因子。
此外，大黄素还能够调节免疫系统的功能，增强机体免疫力，提高人体对疾病的抵抗力。
综上所述，大黄素的原理主要包括其化学结构、抗氧化活性、光敏性以及抗炎和免疫调节功能。
大黄素作为一种天然植物色素，具有多种生理功能，并对人体健康有着积极的影响。
对于维护和改善人体健康，大黄素的应用可能会在日常生活和医学领域中发挥重要作用。
大黄素的药理作用研究进展
大 黄 素 的 药 理 作 用 研 究 进 展
黄伟锋 福建省厦 门市 医药研究所 ３ ６ １ ０ ０ ８
【 摘 要】 大黄 素是 中药大 黄的重要单体 ， 具有 多种功效 。它能抑菌 、 抗炎 、 调节免 疫 、 抗 氧化 、 保 护肝 肾、 利尿 、 治疗胰 腺
炎、 抑制血小板 聚集 、 改善微循环 、 降低血液粘度 、 抗肿瘤等， 具有 较好 的临床应用价值 。本文概述 了国内外对大 黄素的药 理 作用及机制方 面的研 究进 展。
抑 制细 菌胶 原酶 来抑 制细 菌生 长 。 ２ 抗 炎及 免疫 调 节作 用
食， 荡涤肠 胃， 推 陈 致新 ， 通利 水 谷 ， 调 中化食 ， 安 和 五脏 ” 。 《 本 草 纲 目》 谓： 大黄可“ 主 下痢 赤 白 ， 里 急腹 痛， 小便淋 沥 ， 实热 燥 结 ， 潮热谵语 ， 黄 疸 诸火 疮 ” 。 大黄素 （ ｅ ｍｏ ｄ ｉ ｎ ） 化 学名为 １ ， ３ ， ８ 一 三羟基 一 ６ 甲基 蒽醌
２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ２ ） ： ６ ８ ．
［ ９ ］ 榻柱能 ， 马常青 ， 祝最成 ， 等． 杉树皮夹板外 固定结合驳骨
油外敷治疗桡骨远端骨折 １ ９ ７ 例［ Ｊ ］ ． 中医 外 治 杂 志 ，
２ ０ １ ２ ， ２ １ （ ６ ） ： ２ ４ ．
［ １ ０ ］ 韩 松． 闭合 复位 纸夹 板 固定 治疗 伸 直型桡 骨 远端 骨折 １ １ ８ 例［ Ｊ ］ ． 中国中医药现代远程教育 ， ２ ０ ０ ９ ， ７ （ ２ ） ： ３ ０ ．
柳 州 医学
２ ０ １ ３ 年第２ ６ 卷第 ４ 期
Ｌ ｉ ｕ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ６ ， Ｎ ｏ ． ４
大黄素抗炎作用及相关机制研究进展
大黄素抗炎作用及相关机制研究进展高红刚(综述);周菊华(审校)【摘要】Objective Emodin is a natural occurring anthraquinone derivative isolated from roots,which has diuretic,vasorelaxant,anti-bacterial,anti-viral,anti-inflammatory,and anti-cancer effects in previous re-searches.More and more researches on the antiinflamatory activities of emodin have been reported recently. The anti-inflammatory effects of emodin have been exhibited in various in vitro as well as in vivo models of inflammation.The mechanisms may be that emodin is a pleiotropic molecule capable of interacting with sev-eral major molecular targets and cell including NF-κB,PPAR,inflammasome,SDF-1 and macrophage whichare involved in inflammation.This review summarizes reported anti-inflammatory activities and mechanisms of emodin so as to provide references for the further elucidation of emodin antiinflamatory mechanisms and the development of the related drugs.%大黄素为蒽醌类衍生物，具有利尿、舒张血管、抗菌、抗病毒、抗炎和抗癌等药理活性。
有关大黄素的开发利用进展的文章
有关大黄素的开发利用进展的文章大黄素是一种来源于大黄植物的成分，被广泛用于医药和保健领域。
近年来，随着科技的不断进步，大黄素的开发利用也在不断取得进展。
本文将就大黄素在医药和保健领域的应用进行探讨。
在医药领域，大黄素被发现具有多种药理作用，如抗炎、抗菌、抗氧化等。
研究表明，大黄素对一些炎症反应具有明显的抑制作用，可以帮助缓解炎症引起的疼痛和不适。
此外，大黄素还具有抗菌作用，可以有效抑制细菌的生长繁殖，对一些感染性疾病有一定的治疗作用。
同时，大黄素还能够清除体内的自由基，具有抗氧化的作用，有助于延缓衰老和提高免疫力。
除了在医药领域，大黄素在保健领域的应用也备受关注。
随着人们对健康的重视，越来越多的人开始关注天然植物提取物的保健功效。
大黄素作为一种天然成分，被认为具有良好的保健效果。
一些研究表明，大黄素可以帮助调节体内的代谢，促进消化吸收，有助于改善肠道健康。
此外，大黄素还被发现对降血脂、降血糖等方面有一定的作用，有助于预防心血管疾病等慢性病的发生。
随着大黄素研究的不断深入，越来越多的应用领域被发掘出来。
例如，一些研究表明，大黄素对肿瘤具有一定的抑制作用，有望成为肿瘤治疗的新型药物。
此外，大黄素还被发现对神经系统具有保护作用，可以改善记忆力、延缓神经衰退等。
因此，大黄素在神经科学领域也具有广阔的应用前景。
总的来说，大黄素作为一种天然植物提取物，具有广泛的应用前景和发展空间。
随着科技的不断进步，相信大黄素的开发利用将会取得更多的进展，为人类健康带来更多的福祉。
希望未来能够有更多的研究机构和企业投入到大黄素的研究和开发中，推动大黄素在医药和保健领域的应用不断创新，为人类健康做出更大的贡献。
大黄素药理作用的分子机制研究进展
大黄素药理作用的分子机制研究进展刘 晗,高 云(南昌大学基础医学院生理学教研室,江西南昌 330006)收稿日期:2009-08-08,修回日期:2009-09-15基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 30860333);江西省自然科学基金资助项目(N o 2007GZY1002)作者简介:刘 晗(1986-),女,硕士生,研究方向:神经生理学和药理学,E 2m ai:l s up erhan ru @163.co m ;高 云(1973-),女,副教授,博士,硕士生导师,研究方向:神经生理学和神经药理学,通迅作者,E 2ma i :l gaoyun90@163.co m中国图书分类号:R 205;R 282171;R 28411;R 97513文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2009)12-1552-04摘要:大黄素是中药大黄的主要有效单体,具有多种药理作用,具有较高的临床应用价值。
近年来国内外有关大黄素药理作用分子机制的研究较多,特别对其消炎、抗肿瘤的作用高度关注。
这些作用主要是通过改变离子浓度及转运、抗氧化和自由基、影响炎症因子的分泌和酶活性、细胞凋亡等途径实现的。
该文对此进行了总结,希望能为其实际应用提供理论依据。
关键词:大黄素;药理作用;分子机制;离子转运;炎症因子;细胞凋亡大黄素是一种蒽醌类衍生物,主要来源于蓼科植物掌叶大黄根茎,其化学名称为1,3,82三羟基262甲基蒽醌(1,3,82tr i hydro xy 262m e t hyl 2anthraqu i no ne),是中药大黄的主要有效单体。
长期以来,大黄素被传统中医认为具有泻下的作用,现认为还有抗菌消炎[1]、抗肿瘤[2]、免疫抑制[3,4]、保肝[5]、抗肾纤维化[6]等药理作用。
目前开展了大量的大黄素药理作用分子机制方面研究,根据相关文献报道,这些作用主要是通过改变离子浓度及转运、抗氧化和自由基、影响炎症因子的分泌和酶活性、基因合成及表达、细胞生长的各个阶段实现的。
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・论著・大黄素影响钙敏感性调节机制的研究吴斌1Δ,齐清会2【摘要】目的研究大黄素对G蛋白耦联的钙敏感性调节影响的机制。
方法用酶解法分离大鼠胃平滑肌细胞,采用钙钳制技术控制平滑肌细胞内游离钙离子水平。
用图像分析系统测量平滑肌细胞长度。
采用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光技术分析RhoA在细胞内的时空分布变化。
结果大黄素在平滑肌细胞内游离钙离子水平固定时剂量依赖性收缩细胞。
G蛋白降解产物GDP类似物GDPβs剂量依赖性对抗大黄素收缩胃平滑肌细胞作用。
C3-transferase(RhoA抑制剂)抑制大黄素引起的细胞收缩,大黄素可引起RhoA膜移位。
结论大黄素对G蛋白耦联的钙敏感性调节有影响,并且是通过RhoA途径。
【关键词】大黄素;胃平滑肌细胞;钙敏感性【中图分类号】R285.5 【文献标识码】 A 【文章编号】1606-8106(2007)15-1345-05To r sear ch the mechanism of emodin influencing calcium sensibitityWU bin,QI Qing-hui.Department of Transpla ntation,The First Center Hospita l,Tianjin300192,China【Abstr act】Objective It has been noted that emodin can influence calcium sensibitity but its precise mecha２nism remains unsolved.To investigate how emodin influence calcium sensibitity.Methods Cells were isolated from the muscle layers of Wistar rat stomach by enzymatic digestion.Intracellular free calcium ions level of smooth mus２cle cell was controlled by the technique of calcium claw cell length was measured by computerized image microme２try.RhoA distribution at rest state or after stimulation was measured with immuoflurescence confocal microscopy. Conclusion Emodin can influence calcium sensibitity by the approach of RhoA route.【K ey words】emodim;gastric smooth muscle cell;calcium sensibility目前的研究表明平滑肌细胞的收缩机制为: (1)[Ca2+]i的升高:钙升高后,通过肌球蛋白轻链激酶(MLCK)途径磷酸化肌球蛋白轻链(MLC20)引发收缩。
(2)钙敏感性的升高:这一机制是通过抑制肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的活性来实现的[1]。
钙敏感性的增加使得在相同的[Ca2+]i浓度条件下,细胞可以产生更大的收缩力。
调节钙敏感性的信号转导途径被认为是:激动剂通过G蛋白耦联受体激活RhoA(一种22-26-kDa的small GT２Pase),随之激活其下游的激酶ROK(RhoA kinase),磷酸化MLCP的调节亚单位,从而抑制MLCP的活性抑制MLC20脱磷酸化[2]。
大黄(Rhubarb)是通里攻下中药中的代表性药物,具有明确增强肠道蠕动的作用,被广泛用于急腹症的治疗中。
大黄素是大黄的重要有效成分,为蒽醌类化合物,具有多种药理作用。
Cheng等人的研作者单位:1300192天津,天津市第一中心医院移植学部(Δ通讯作者)2116011辽宁大连,大连医科大学附属第一医院普外一科究发现大黄素通过升高[Ca2+]i促进大鼠膈肌的收缩。
林秀珍等研究表明大黄素可以促进离体肠道平滑肌条的收缩,杨文修等证实大黄素可促进细胞膜去极化,缩短膜电位振荡周期,增加峰电位发放频率,增加分节律收缩的幅值指数。
我们在之前的研究中已证实大黄素对大鼠胃平滑肌细胞有收缩作用,并也证实能够影响[Ca2+]i,但是否影响钙敏感性尚未证实,本实验将初步解决这一问题。
1材料与方法1.1实验材料和仪器健康成年Wistar大鼠(天津市医学实验动物中心提供),清洁级,雌雄各半,鼠龄3～4个月,体重(205±25)g,Emodin、GDPβs、GTPγs、C3-transferase、β-escin、DMEM(sigma),一抗mouse monoclonal anti-RhoA IgG(SANTA CRUZ),二抗、抗体稀释液、Triton-100、多聚甲醛(北京中山生物公司),余试剂均为国产分析纯。
Bio -rad Radiance2000型激光扫描共聚焦显微镜,超净工作台,细胞培养箱,Olympus倒置显微镜, Cmais2000图像分析系统,Naro超纯水系统。
1.2实验方法1.2.1 胃平滑肌细胞的分离大鼠禁食2天,脱颈处死,无菌操作取胃,生理盐水彻底冲净,刮去黏膜,将肌肉组织剪成约1～2mm3体积大小,放于15ml含胶原酶Ⅱ型(0.1%的胶原酶)的DMEM消化液中,37℃振摇约30min,吸出上清液,置于冰浴离心管中备用。
同等条件下再消化一次,收集二次上清液离心,用DMEM再洗一次。
最后重新悬浮于含15%～20%的胎牛血清和抗生素的DMEM培养液中。
50目筛网过滤,收集细胞,调整细胞浓度。
4%台盼蓝染色判断细胞活力在95%以上,细胞接种于培养瓶中,放入CO2孵箱培养。
1.2.2 可通透胃平滑肌细胞的制备当酶消化过程完成后,将消化液吸出,并用细胞质缓冲液(mmol/L:NaCl20,KCl100,MgSO45,NaH2PO40.96,CaCl20.61,EGTA1,2%BSA,pH7.2)洗3次,洗液与消化液一起,1000r/min离心5min,弃上清,用2ml细胞质缓冲液悬浮沉淀,并吹打成细胞悬液。
细胞分散后,加入75μg/ml的皂苷孵育4min,离心1000r/min5min,沉淀重新悬浮于无皂苷含1.5mmol/L ATP,5mmol/L磷酸肌酸,10U/ml肌酸磷酸激酶的细胞质缓冲液中。
1.2.3 平滑肌细胞钙钳制技术如上处理细胞后,根据Ca2+EGTA的平衡结合常数K进行计算,将高浓度(10mmol/L)和具一定Ca2+浓度的溶液按一定比例混合,可获得所需Ca2+浓度的溶液,将胞浆游离Ca2+浓度钳制在某一要求的水平,这样可以观察不依赖胞浆游离Ca2+浓度的细胞活动过程,据国外文献报道我们把Ca2+浓度钳制在Pka=6.3这一最佳水平。
分四组:(1)大黄素;(2)大黄素+GDP类似物GDPβs;(3)GDP类似物GDPβs;(4)正常对照组。
各组均分5个浓度梯度,大黄素组为1、5、10、50、100μmol/L;GDPβs组为10、50、100、500、1000μmol/L;大黄素+GDPβs组为前两组浓度相应一一配伍而成。
1.2.4 平滑肌细胞收缩的测定取0.25ml细胞悬液,加入相应浓度的实验试剂。
30s后加入2.5%戊二醛终止反应。
对照组加入相同体积缓冲液,亦于30s后加入戊二醛终止反应。
应用图像分析系统测定平滑肌细胞长度,随机测定50个细胞的长度。
平滑肌细胞的收缩反应的计算公式为:收缩变化百分数=(用药组平均长度-对照组平均长度)/对照组细胞平均长度×100%。
1.2.5免疫荧光共聚焦显微镜RhoA成像收集按上述方法分散的细胞接种于六孔板中的盖玻片上,培养基为含20%胎牛血清的DMEM。
用免疫荧光方法标记:4%多聚甲醛固定10min,用PBS冲洗3次,每次5min;然后0.2%Triton-100作用10min, PBS冲洗3次,每次5min;一抗mouse monoclonal an２ti-RhoA IgG37℃孵育1h,PBS冲洗3次,每次5min;二抗Goat anti-Rabbit IgG FITC孵育1h,PBS 冲洗3次,每次5min;缓冲甘油封片,Bio-Rad Ra２diance2000激光共聚焦显微镜检测,FITC激发波长为488nm,发射波长为520nm。
空白对照组与第二抗体孵育。
沿平滑肌细胞Z轴以0.4μm间距行断层扫描,收集各Z轴平面PKCα分布信息。
设定膜周边区(peripheral)为细胞外围15%区域,其平均荧光强度值为P值,其余70%区域为胞浆区(cytosol２ic),其平均荧光强度值为C值。
不同平面的P/C 值代表RhoA在平滑肌细胞内的空间分布。
1.3统计学方法数据均以珋x±s表示,采用Student’s t-test方法进行统计处理。
P<0.05提示差异有显著性。
2结果2.1大黄素对胃平滑肌细胞长度的影响(1)倒置显微镜下,分离的胃平滑肌细胞呈梭形,长度各异,有的处于舒张状态,有的处于不同的收缩状态下。
细胞的长度在67～141μm之间,平均长度为(96.22±16.12)μm(见图1)。
(2)实验结果显示大黄素对胃平滑肌细胞有收缩作用,并随浓度的增加收缩幅度明显增加;GDPβs对胃平滑肌细胞有舒张作用,并随浓度的增加舒张幅度明显增加;GDPβs 并能抑制大黄素的收缩作用,也呈浓度依赖性(见图2,表1)。
各组间不同浓度间统计分析显示差异有显著性(见表2)。
各浓度组间不同组间统计分析显示差异有显著性(见表3)。
表1 各加药组对SM C收缩的影响(收缩变化百分比,%)组别浓度(μmol/L)0(对照)12345 E00.539.3715.0016.7920.91 E+GDPβs0-0.31-1.43-4.50-7.30-8.78 GDPβs0-1.89-3.29-5.95-12.01-15.05表2 各组间不同浓度SMC平均长度(μm)的统计分析组别12345F P E86.097684.485381.615275.312273.5146 6.7270.003 E+GDPβs85.746888.568690.846792.300095.5720 5.8980.006 GDPβs87.646188.622191.302694.960698.945714.9210.000表3 各浓度不同组间SMC平均长度(μm)的统计分析浓度E E+GDPβs GDPβs F P186.097685.746887.64610.3560.786 284.485388.568688.6221 1.5820.268 381.615290.846791.30267.9120.009 475.312292.300094.960622.9000.000 573.514695.572098.945740.6420.0002.2C3-transferase(RhoA抑制剂)对大黄素收缩作用的影响为研究RhoA信号途径在大黄素收缩中的作用,我们分别使用C3-transferase(RhoA抑制剂)与结肠平滑肌细胞孵育,观测C3-transferase对大黄素收缩作用的影响。