龙眼胚性愈伤组织中TFL1基因克隆及其表达分析
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因在 多 年生 植物 中与维持 童期 性状 有关 。
条 ５ ＇ － Ｒ ＡＣ Ｅ引 物 ，并 结 合 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｒ ａ ｃ ｅ ｒ Ｍ Ｔ ５ Ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｒ 和
儿Ｊ 作 为 重要 的开 花抑 制 基 因 ， 在龙 眼 的研 究 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｒ ａ ｃ ｅ ｒ Ｍ Ｔ ５ Ｎ ｅ ｓ ｔ ｅ Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ 引物 ， 以龙 眼 松散 型 胚性 中未 见 报道 。 近 年来 ， 福建 农林 大学 园 艺植 物生 物工 愈 伤 组 织 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 为 模 板 ，进 行 巢 式 Ｐ Ｃ Ｒ反 应 扩 增
８ 期
陈裕 坤等
龙眼胚性愈伤组织 中 Ｔ Ｆ Ｌ １ 基 因克 隆及其表达分析
１ ７
分生组织 ， 在 顶 端 开 花 ； 超 量表达 Ｔ Ｆ Ｌ １基 因 导 致 园艺 植物 生物 工程 研究 所 实验 室 龙 眼转 录组 数据 库 拟南 芥 营养生 长和花序 生长都 延长 ， 开花时 间推迟嘲 。 Ｗｉ ｇ ｇ ｅ等 同 研究表 明 ， ｍ 基 因通 过 营 养 生 长 阶段 中注 释 为 吼 的 Ｕ ｎ ｉ ｇ ｅ ｎ ｅ序列 ， 经 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ数据 库 比对 分 析后 ，采用 Ｄ Ｎ Ａ ＭＡ Ｎ ７ ． ０分别 设 计 其上 下 游
１ ． ２ ． ３ 生 物 信 息学 分 析 。使 用 Ｄ Ｎ Ａ ＭＡ Ｎ ７ ． ０进 行 核
龙 眼松 散 型 胚 性 愈 伤 组 织 （ “ 红核 子 ” 品种 Ｌ Ｃ ２ 苷 酸序列 的拼接 以及 氨基 酸序 列 的多 重 比对 ；采 用 细胞系） ，由赖 钟雄 于 １ ９ ９ ４年诱 导 并 由福建 农 林 大 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｄ ｉ ｓ ｐ ｌ ａ ｙ Ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｒ 进 行 基 因组 序 列 分 析 ； 学 园 艺植 物生 物工 程研 究所 长期 进行 继代 保 存 ［ １ ４ ～ ６ ／ 。 使用 Ｅ ｘ Ｐ Ａ Ｓ ｙ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｐ ａ ｒ ａ ｍ在线 软件预测 Ｄ １ ＭＦ Ｔ和 龙 眼胚 性 愈伤组 织 的转 录组 由福 建 农林 大学 园艺植 Ｄ １ Ｔ Ｆ Ｌ １ 的理 化性 质 ；信号 肽 预测 软件 为 Ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ Ｐ ４ ． ０ 物生物工程研究所提供 ， Ｓ Ｒ Ｒ ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｎ ｕ ｍ ｂ ｅ ｒ ｓ ： 自莆 田农业 科 学研究 所 。
Ｄ Ｉ Ｔ Ｆ Ｌ １的潜 在 ｍ ｉ Ｒ Ｎ Ａ ｓ ， 并研 究 其 在 “ 四季 蜜 ” 龙 眼 引 物序 列及 扩增 用途 见表 １ 。 不 同组 织部 位 中 的表 达模 式 ， 为 进一 步 研 究 Ｄ Ｉ Ｔ Ｆ Ｌ １
依据 。
１ 材 料 与方 法 １ ． １ 供试 材 料
低水平表达延长植物 的营养生长 ，通过在花序分生 引物 ， 以龙 眼 松散 型胚 性 愈伤 组织 ｅ Ｄ Ｎ Ａ为模 板 扩
组 织 中大量 表达 来 维持 花序 的无 限生长 ，从 而 抑制 增 Ｔ Ｆ Ｌ １的部 分序 列 。 花 分生 组织 特异 基 因 的表 达 ，最 终 导致 植物 开 花 时
Ｐ Ｃ Ｒ反应 体 系 和扩 增程 序 参 照赖 呈 纯等 『 】 ９ １ 的方 行 相应 的调 整 。获得 目的 片段后 切 胶 回收 ， Ｔ Ａ克 隆
后进 行 Ｐ Ｃ Ｒ检测 ， 并送 深圳 华 大基 因公 司测序 。
在龙 眼成 花表 达调 控 和开 花 中的作 用 机理 提 供理 论 法 ， 根据 扩 增 不 同 的 目的 片段 ， 对Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 程 序 进
（ ２ ） ３ 一 Ｒ Ａ Ｃ Ｅ和 ５ ～ Ｒ Ａ Ｃ Ｅ 引 物 设 计 采 用
间延 迟 。在多 年 生 的高 山南芥 中 ， Ｔ Ｆ Ｌ １阻止 幼 年植 Ｒ ＡＣ Ｅ法 ，根据 转录组分析所得 的序列分别设计 ２条 株 感受 低 温 春 化 罔 ； Ｔ Ｆ Ｌ １在柑 橘 中调 控 童期 性 状 ［ ； ３ － Ｒ Ａ Ｃ Ｅ引 物 ， 结 合 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｒ ａ ｃ ｅ ｒ Ｍ Ｔ ３ Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ和 促使 将 梨 的 Ｐ ｃ Ｔ Ｆ Ｌ １ 一 和 Ｐ ｃ Ｔ Ｆ Ｌ １ — ２基 因经 Ｒ Ｎ Ａ ｉ 干 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｒ ａ ｃ ｅ ｒ Ｍ Ｔ ３ Ｎ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ Ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｒ 引物 ， 以龙 眼松 散 型胚 扰后所 获得 的转 基 因植株 开花 提早 ＿ ｌ ０ ； 将 苹 果 的 性愈伤组织 ｃ Ｄ Ｎ Ａ为模板 ， 进行巢式 Ｐ Ｃ Ｒ反应扩增 Ｔ Ｆ Ｌ １基说明 Ｔ Ｆ Ｌ １基 ３ 末 端序 列 ； 根 据转 录组 分析 所 获得序 列 分别 设计 ２
程研究所实验室对龙眼体胚发生过程开展相关的分 ５ 末 端序 列 。 子生物学研究 ，建立 了龙眼胚性愈伤组织转录组数 （ ３ ）拼 接 验证 与 ｇ Ｄ Ｎ Ａ扩 增 对 转 录组 分 析所 据库 『 ｌ ２ １ ， 对 龙 眼体 胚 发 生 过 程 中 的 ｍ ｉ Ｒ Ｎ Ａ ｓ进 行 了 得 序 列 、 ３ 末端序列和 ５ 末 端 序 列 的测 序 结果 进 行 设 计 拼接验 证 引物 ， Ｐ Ｃ Ｒ反应 验证 拼 接结 鉴定［ １ ３ ］ 。 该研究在这些基础上 ， 克隆了龙眼胚性愈伤 全 长拼 接 ， 组 中 ｍ 的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ全长和 ｇ Ｄ Ｎ Ａ序列 ， 借助生物信 果。 同时利用拼接验证 的引物 ， 以龙眼胚性愈伤组织 息 学 方 法 初 步 推 测 ＤＩ Ｔ Ｆ Ｌ １的 功 能 ， 预 测 调 控 Ｄ Ｎ Ａ为 模板 ， Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 获得 其 ｇ Ｄ Ｎ Ａ序 列 。所 有 的
条 ５ ＇ － Ｒ ＡＣ Ｅ引 物 ，并 结 合 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｒ ａ ｃ ｅ ｒ Ｍ Ｔ ５ Ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｒ 和
儿Ｊ 作 为 重要 的开 花抑 制 基 因 ， 在龙 眼 的研 究 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｒ ａ ｃ ｅ ｒ Ｍ Ｔ ５ Ｎ ｅ ｓ ｔ ｅ Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ 引物 ， 以龙 眼 松散 型 胚性 中未 见 报道 。 近 年来 ， 福建 农林 大学 园 艺植 物生 物工 愈 伤 组 织 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 为 模 板 ，进 行 巢 式 Ｐ Ｃ Ｒ反 应 扩 增
８ 期
陈裕 坤等
龙眼胚性愈伤组织 中 Ｔ Ｆ Ｌ １ 基 因克 隆及其表达分析
１ ７
分生组织 ， 在 顶 端 开 花 ； 超 量表达 Ｔ Ｆ Ｌ １基 因 导 致 园艺 植物 生物 工程 研究 所 实验 室 龙 眼转 录组 数据 库 拟南 芥 营养生 长和花序 生长都 延长 ， 开花时 间推迟嘲 。 Ｗｉ ｇ ｇ ｅ等 同 研究表 明 ， ｍ 基 因通 过 营 养 生 长 阶段 中注 释 为 吼 的 Ｕ ｎ ｉ ｇ ｅ ｎ ｅ序列 ， 经 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ数据 库 比对 分 析后 ，采用 Ｄ Ｎ Ａ ＭＡ Ｎ ７ ． ０分别 设 计 其上 下 游
１ ． ２ ． ３ 生 物 信 息学 分 析 。使 用 Ｄ Ｎ Ａ ＭＡ Ｎ ７ ． ０进 行 核
龙 眼松 散 型 胚 性 愈 伤 组 织 （ “ 红核 子 ” 品种 Ｌ Ｃ ２ 苷 酸序列 的拼接 以及 氨基 酸序 列 的多 重 比对 ；采 用 细胞系） ，由赖 钟雄 于 １ ９ ９ ４年诱 导 并 由福建 农 林 大 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｄ ｉ ｓ ｐ ｌ ａ ｙ Ｓ ｅ ｒ ｖ ｅ ｒ 进 行 基 因组 序 列 分 析 ； 学 园 艺植 物生 物工 程研 究所 长期 进行 继代 保 存 ［ １ ４ ～ ６ ／ 。 使用 Ｅ ｘ Ｐ Ａ Ｓ ｙ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｐ ａ ｒ ａ ｍ在线 软件预测 Ｄ １ ＭＦ Ｔ和 龙 眼胚 性 愈伤组 织 的转 录组 由福 建 农林 大学 园艺植 Ｄ １ Ｔ Ｆ Ｌ １ 的理 化性 质 ；信号 肽 预测 软件 为 Ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ Ｐ ４ ． ０ 物生物工程研究所提供 ， Ｓ Ｒ Ｒ ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｎ ｕ ｍ ｂ ｅ ｒ ｓ ： 自莆 田农业 科 学研究 所 。
Ｄ Ｉ Ｔ Ｆ Ｌ １的潜 在 ｍ ｉ Ｒ Ｎ Ａ ｓ ， 并研 究 其 在 “ 四季 蜜 ” 龙 眼 引 物序 列及 扩增 用途 见表 １ 。 不 同组 织部 位 中 的表 达模 式 ， 为 进一 步 研 究 Ｄ Ｉ Ｔ Ｆ Ｌ １
依据 。
１ 材 料 与方 法 １ ． １ 供试 材 料
低水平表达延长植物 的营养生长 ，通过在花序分生 引物 ， 以龙 眼 松散 型胚 性 愈伤 组织 ｅ Ｄ Ｎ Ａ为模 板 扩
组 织 中大量 表达 来 维持 花序 的无 限生长 ，从 而 抑制 增 Ｔ Ｆ Ｌ １的部 分序 列 。 花 分生 组织 特异 基 因 的表 达 ，最 终 导致 植物 开 花 时
Ｐ Ｃ Ｒ反应 体 系 和扩 增程 序 参 照赖 呈 纯等 『 】 ９ １ 的方 行 相应 的调 整 。获得 目的 片段后 切 胶 回收 ， Ｔ Ａ克 隆
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在龙 眼成 花表 达调 控 和开 花 中的作 用 机理 提 供理 论 法 ， 根据 扩 增 不 同 的 目的 片段 ， 对Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 程 序 进
（ ２ ） ３ 一 Ｒ Ａ Ｃ Ｅ和 ５ ～ Ｒ Ａ Ｃ Ｅ 引 物 设 计 采 用
间延 迟 。在多 年 生 的高 山南芥 中 ， Ｔ Ｆ Ｌ １阻止 幼 年植 Ｒ ＡＣ Ｅ法 ，根据 转录组分析所得 的序列分别设计 ２条 株 感受 低 温 春 化 罔 ； Ｔ Ｆ Ｌ １在柑 橘 中调 控 童期 性 状 ［ ； ３ － Ｒ Ａ Ｃ Ｅ引 物 ， 结 合 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｒ ａ ｃ ｅ ｒ Ｍ Ｔ ３ Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ和 促使 将 梨 的 Ｐ ｃ Ｔ Ｆ Ｌ １ 一 和 Ｐ ｃ Ｔ Ｆ Ｌ １ — ２基 因经 Ｒ Ｎ Ａ ｉ 干 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｒ ａ ｃ ｅ ｒ Ｍ Ｔ ３ Ｎ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ Ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｒ 引物 ， 以龙 眼松 散 型胚 扰后所 获得 的转 基 因植株 开花 提早 ＿ ｌ ０ ； 将 苹 果 的 性愈伤组织 ｃ Ｄ Ｎ Ａ为模板 ， 进行巢式 Ｐ Ｃ Ｒ反应扩增 Ｔ Ｆ Ｌ １基说明 Ｔ Ｆ Ｌ １基 ３ 末 端序 列 ； 根 据转 录组 分析 所 获得序 列 分别 设计 ２
程研究所实验室对龙眼体胚发生过程开展相关的分 ５ 末 端序 列 。 子生物学研究 ，建立 了龙眼胚性愈伤组织转录组数 （ ３ ）拼 接 验证 与 ｇ Ｄ Ｎ Ａ扩 增 对 转 录组 分 析所 据库 『 ｌ ２ １ ， 对 龙 眼体 胚 发 生 过 程 中 的 ｍ ｉ Ｒ Ｎ Ａ ｓ进 行 了 得 序 列 、 ３ 末端序列和 ５ 末 端 序 列 的测 序 结果 进 行 设 计 拼接验 证 引物 ， Ｐ Ｃ Ｒ反应 验证 拼 接结 鉴定［ １ ３ ］ 。 该研究在这些基础上 ， 克隆了龙眼胚性愈伤 全 长拼 接 ， 组 中 ｍ 的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ全长和 ｇ Ｄ Ｎ Ａ序列 ， 借助生物信 果。 同时利用拼接验证 的引物 ， 以龙眼胚性愈伤组织 息 学 方 法 初 步 推 测 ＤＩ Ｔ Ｆ Ｌ １的 功 能 ， 预 测 调 控 Ｄ Ｎ Ａ为 模板 ， Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 获得 其 ｇ Ｄ Ｎ Ａ序 列 。所 有 的