植物金属硫蛋白的提取及检测

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金属硫蛋白提取条件试验

兔肝金属硫蛋白提取工艺研究党蕊叶1齐凡2蒋志武1 王开锋1 权清转1权启俊3赵淑琳1（1.陕西省动物研究所, 陕西西安710032；2.陕西省科学院，陕西西安，3.陕西同腾生物科技有限公司, 陕西省澄城715200）摘要：伊拉兔子经ZnSO4腹部皮下注射，诱导其肝脏合成锌金属硫蛋白，将肝脏加入溶剂经研磨、加热、分离制成金属硫蛋白提取液。

本文系统的研究了提取液Tris-HCl的浓度、pH和稀乙醇对金属硫蛋白提取率的影响，并用正交试验法对加热的时间和温度进行了筛选，为金属硫蛋白的提取研究提供资料。

实验结果表明：提取液的浓度和pH值对金属硫蛋白的提取效果影响较大，稀乙醇对金属硫蛋白的提取影响不大，大于30%的乙醇溶液导致金属硫蛋白提取率下降。

实验的最佳提取条件为：Tris-HCl的浓度范围0.01 mol/L～0.02 mol/L，pH范围8.0~8.6，热处理的条件为：加热温度78-80℃，加热时间5-8分钟。

关键词:金属硫蛋白、提取工艺、提取液中图分类号：Q503金属硫蛋白（metallothionein,简称MT）是1957年由Margoshes和Valee[1]首次从马的肾脏中分离出来并命名的，它是一类富含半胱氨酸且能被金属离子诱导的低分子金属结合蛋白质。

经过四十多年来的研究，人们对金属硫蛋白的认识已越来越深，实验表明：金属硫蛋白具有解除重金属毒性和抗辐射、消除自由基、修复受损组织等功效[2,3]，现已被广泛用于医药、保健品及化妆品添加剂等领域中[4,5]。

哺乳动物金的属硫蛋白分子量约有6500道尔顿，是由60-62个氨基酸组成的单链蛋白质，其中约有20个半胱氨酸残基，不含芳香族氨基酸和组氨酸，氨基酸末端N-乙酰蛋氨酸，羧基末端均为丙氨酸，多数排列为cys-X-cys结构，数量是7个，与结合的金属含量一致。

无金属结合的金属硫蛋白称为硫蛋白(thionein)，结构呈无序状态，当与金属离子结合后折叠成有序结构[6,7]。

镉诱导黄瓜金属硫蛋白的分离、纯化和鉴定

维普资讯
安徽农业科学，ｕｌｆｎｕＡｒｃ．０８３（８＂５４５５７４ＪｍａｏＡｈｉｇ．Ｓｉ０，６１）７１ —７１。７２ｏｉ２
责任编辑
刘月娟
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况玲玲
镉诱导黄瓜金属硫蛋白的分离、纯化和鉴定
ｓｉＩｈｏｍｕｉｕｅｏｅｎｒｔｎｏＡｗｓ１０ｇＬｎｎｅｉｔａｎｅｃｎｅｔｔｎｏｃｍｅｄＭｅｃｅ．２Ｉ，．ｕｔ１ｅｏｔｍｄｃｄｃｎｅｔｉｆＣａ０ｍ／，ａｄｕｄｒｔｓｒｔｔｈｏｃｎａｏｆｃｕｂｒＣ－Ｔｒａｈｄ２６－＇ｉｎａｏ０ｈｅｍｅｔｒｉｕＪｇｏ
ＭｌｕａｅｇｔｆｕｕｒＣ－ＴＷＳ．Ｄ：ＩｏｃｓｎｌｕｕｅＷＳｅｓｉｅｏＣｏｅｌｃｒｗｉｏｃｅｒｈ￣ｄＭａ９５ｋｎｌｉｃｍｂｒａｎｉｖｔ．ＣｕｏＣｓｔ
ｄｏｆｐａｔＭＴｎｔｔｏＡｉｈｎｉ￣ｎｏｌｎａｄｈａｆＣｎｔｅｅｖｒｏｔ．
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植物金属硫蛋白提取液配方对镉中毒大鼠抗氧化作用的研究

ＸｉｊａｇＭｅｉａｉｅｓｔｎｉｎｄｃｌＵｎｖｒｉｙ，Ｕｒｍｑ３０，Ｃｈｎ）ｕｉ８０１１ｉａ
Ａｂｔａｔｓｒｃ：ＯｂｅｔｖＴｏｓｕｙｔｅｐｅｅｔｖｎｕａｉｅｅｆｃｓｔａｘｒｃｆｐａｔｍｅａｌｔｉｎｉｎｊｃｉｅｔｄｈｒｖｎｉｅａｄｃｒｔｖｆｅｔｈｔｅｔａｔｏｌｎｔｌｈｏｅｎｏｏ
ＤＵｎｙｎ，ＧＯＮＧｉｎｆＹａ — ａＪａ－ｕ，ＬＩＪｉｗｅＵ－ｎ
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ｔｓａｌｓｈｅｃｄｉｍｏｉｏｎｄｓａｓｗｅｅｄｖｉｄｉｏｓｘｇｒｐｓ：ｎｅａｉｅｃｎｔｏｒｐ；ｐｏ — ｏｅｔｂｉｈｔａｍｕｐｓｎｉｇｍｅｏｌ，ｒｔｒｉｄｅｎｔｉｏｕｇｔｖ — ｏｒｌｇｏｕｓｉｉｅｃｔｏｌｇｒｐ；ｔｒｖｅｉｅｇｒｕｐｎｄｔｒａｍｅｒｕ．Ｅｘｔａｔｏｆｐａ — ｔｌｏｈｉｎｅｎｉ — ｔｖ — ｏｎｒｏｕｗｏｐｅｎｔｖｏｓａｗｏｔｅｔｎｔｇｏｐｓｒｃｌｎｔｍｅａｌｔｏｉｎｔｒｅｔｄｏｒｖｎｔｖｏｅｖｎｅｎｐｅｅｉｅｇｒｕｐｓｔｅｓｂｆｒＣ１ｗｅｅｕｅｗｏｗｅｋｅｏｅＣｄ２ｒｓｄ，ａｒａｍｅｔｇｒｐｓｔｅｓａ — ｎｄｏｎｔｅｔｎｏｕｗｏｗｅｋｆｔｒＣｄ２ｗｅｅｕｓｄＷｅａｌｚｄｔｅＳＯＤｉａｉｙ，ＧＳＨ— ｎｄＭＤＡｏｅｔｉｌｄｓｒｅＣ１ｒｅ．ｎａｙｅｈｖｔｌｔＰｘａｃｎｔｎｎｂｏｏｅｕｍＯｉｑｕｒｎｇｔｎｉｉ

金属硫蛋白_MT_分离纯化技术进展

金属硫蛋白(MT)分离纯化技术进展王　翔1,张大成1,李　婷1,王　玮1,任宏伟2,韩铁钢2,俞梅敏2 (11北京大学微电子学系,北京100871;21北京大学生命科学学院,北京100871)E2mail:wxiang@摘要:较全面地总结了近几年来金属硫蛋白最常见的分离纯化方法,并较详细地介绍了磁法分离纯化、芯片检测等新技术。

关键词:金属硫蛋白;分离纯化;蛋白质芯片中图分类号:R318　文献标识码:A　文章编号:167124776(2003)07/0820335203 Development of the purif ication for metallothionein(MT)WAN G Xiang1,ZHAN G Da2cheng1,L I Ting1,WAN G Wei1,Ren Hong2wei2,Han Tie2gang2,Yu Mei2min2(1.Instit ute of Microelect ronics,Peki ng U niversity,Beiji ng100871,Chi na;2.School of L if e Science,Peki ng U niversity,Beiji ng100871,Chi na)Abstract:Several purification methods of metallothionein(M T)used at present have been listed and compared.A new method of magnetic purification and protein chip analyze has also been in2 troduced.K ey w ords:metallothionein;purification;protein chip1　引　言金属硫蛋白(Metallothionein,M T)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。

金属硫蛋白的分离与纯化

金属硫蛋白的提取以及纯化方法很多, 包括层析法[ 5] 、高效液相色谱法[ 6] 、毛细管电泳法[ 7] 等, 但是多数只能用于实验室研究, 在工业生产中仍采用层析法。本文在原有粗品的生产工艺基础上采用进一步离子交换层析和脱盐, 研究了精品的生产工艺, 同时对诱导后家兔肝、肾和肺中金属硫蛋白的含量进行了比较, 对诱导次数以及采用生理盐水作为诱导剂进行了研究。利用研究的纯化工艺对粗品进行纯化实验, 实验结果令人满意。本文的研究对扩大 M T 的原料来源及更进一步开发利用提供理论基础。
将新鲜的兔肝经过打碎成匀浆后( 在工艺图中简称兔肝) , 加入 Tris H Cl 缓冲液提取, 匀浆液中加入变性液( 等体积氯仿乙醇( 0. 08 1) ) 搅拌均匀后高速冷冻离心分离, 除去非蛋白和杂蛋白物质, 离心液经加热变性 3~ 5 min 再迅速冷冻, 经离心分离除去大部分的杂蛋白, 经浓缩和分子筛凝胶过滤层析, 离子交换层析, 收集含金属硫蛋白的部分, 经低温冷冻干燥, 得到金属硫蛋白的冻干粉。生产工艺流程如下:
为 M T 1 和 M T 2 的吸收峰。在溶液中由于 M T 1 比 M T 2 少一个负电荷, 所以 M T 1 比 M T 2 先出峰。为了得到纯度更高的 MT 精品, 通常收集图 2 中吸光度在 2. 0 以上的部分进行冻干, 这样得到的金属硫蛋白含量可以达到 95% 以上。
图 1 MT 精品离子交换色谱图 Fig. 1 Ion exchange chromatogram of purif ied MT
sample ( g)
65. 86 14. 45 33. 49 15. 66 42. 19 31. 85
M T (mg/g)
2. 88 1. 15 1. 21 1. 79 1. 13 0. 08

金属硫蛋白的简便提取与分离

第9卷第1期1996年2月同　位　素Jou rnal of Iso topesV o l.9　N o.1Feb.1996金属硫蛋白的简便提取与分离3余美祥　贺佑丰33　周　棱33　刘一兵33韩世泉33　赵永刚33　王文清(北京大学技术物理系,100871)预先给家兔注射CdC l2以诱导金属硫蛋白(M etallo th i onein,M T)的合成,取肝脏匀浆、离心,综合采用加热分离和酒精沉淀分离、经Sephadex G250、D EA E2Sepharo se和Sephadex G225柱先后层析,即可获得高纯度的两个M T亚型。

经109Cd示踪证实,该方法可靠;经H PL C分析,所得M T产品纯度达H PL C纯。

该方法采用低速离心、紫外监测,无需测金属离子含量来确定M T的组分,方法简单、快速,适于一般实验室对M T的提取与分离。

关键词　金属硫蛋白　109Cd示踪　分离金属硫蛋白(M etallo th i onein,M T)含61个氨基酸,其中20个半胱氨酸,不含芳香氨基酸。

M T富含金属,对金属的代谢、贮存、运输有重要作用。

M T能较强地清除体内自由基[1]。

M T的提取和分离是研究和应用M T的首要任务。

目前M T的分离一般分为三步,首先是用Sep hadex G275或Sep hadex G250柱将M T与其它杂蛋白分离,然后用D EA E离子交换法梯度淋洗将电荷数不同的两个M T亚型分开,最后进行脱盐[2]。

在整个过程中都要测定金属离子含量,并且需要超过10000×g的离心分离,这给M T的分离纯化带来一些困难。

有一些实验室将匀浆上清液加热沉淀以除去比M T相对分子量大的蛋白,或在-20℃用乙醇沉淀分离除去比M T相对分子量小的蛋白[3,4]。

我们综合采用这两种方法,建立了一种简便的M T提取与分离方法。

1　实验部分1.1　实验材料家兔四只,雄性,体重约3.5kg。

金属硫蛋白的检测方法及其应用

金属硫蛋白的检测方法及其应用金属硫蛋白（Metallothionein）是一类富含半胱氨酸残基和金属的小分子蛋白质物质，简称MT，又叫金属硫氨酸甲基内盐。

主要存在于动物的肝脏、肾脏、胰腺和小肠中，因动物的不同，其分布和半衰期略有差异。

其研究和开发涉及农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域。

1MT的一般性质根据与MT结合的金属种类、摩尔含量来分别命名，如Cd-MT、Cu-MT或Cd7-MT、Zn7-MT（表示每个分子中结合7个原子Cd或Zn）或Cd、Zn-MT这类形式。

也可用罗马数字和小写字母标出分子结构的差别，如人MT-Ⅰb、MT-Ⅱa等。

MT的三级结构由α结构域（羧基末端后30个氨基酸残基）和β结构域（氨基末端前30个氨基酸残基）构成，分子呈哑铃形。

每个区域有4个Cys巯基结合金属原子。

等电点PI一般在4左右。

分子量范围较大，为2 000～13 800Da，其中哺乳动物的MT分子量为6 000～7 000Da。

分子中不含芳香族氨基酸，没有280nm的吸收峰，与不同金属结合产生不同特征吸收峰，脱掉金属后，硫蛋白在190nm处有一明显的肽键吸收峰。

MT的金属具有动力学不稳定性，巯基具有亲核性，决定了MT 易与某些亲电物质特别是某些自由基相互作用，消除辐射形成的·OH 自由基。

MT具有抗应激作用，如动物注射糖皮质激素、干扰素、白细胞介素－Ⅰ后，肝脏中的MT合成增加；各种炎症因子及机体的应激状态（如寒冷、过度疲劳、饥饿等）都增加MTmRNA的转录。

并且MT可保护细胞抵抗重金属和烷化剂的致癌、致突作用。

重金属（Cd、Zn等）可使MT合成速率增加，可防止Zn和Cu、Hg中毒。

但MT 并不是对所有能诱导它合成的金属都具有解毒作用，如Ag、Au、Co 和Ni都能诱导MT的合成，却不对这些金属有解毒作用。

另外在细胞内，Cd-MT具有保护作用，但在细胞外，Cd-MT具有比Cd2+本身更大的肾细胞毒性。

维药鹰嘴豆金属硫蛋白的提取检测

ＬＩＳＨＩＺＨＥＮＭＥＤＩＣＩＮＥＡＮＤＭＡＴＥＲＩＡＭＥＤＩＣＡＲＥＳＥＡＲＣＨ２０１３ＶＯＬ
．
２４ＮＯ．５
时珍国医国药２０１３年第２４卷第５期
维药鹰嘴豆金属硫蛋白的提取检测
文献标识码：Ａ
文章编号：１００８－０８０５（２０１３）０５ — １０９５０２－
金属硫蛋白（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，ＭＴ）存在于除结缔组织外的所血红蛋白１００ｔｘｌ混匀，静止１０ｍｉｎ后沸水浴加热２～３ｍｉｎ，有真核生物中，是一种分子量较小（６０００～７０００）、富含半胱氨１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清液。再加入２％牛血红蛋白酸的非酶蛋白质。金属硫蛋白具有强的抗氧化、重金属解毒、１００ｉｘ１混匀，静止１０ｍｉｎ沸水浴加热２～３ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离抗热等性能。由于其广泛的生理功能，自２０世纪５０年代被发现心１０ｍｉｎ，收集上清液。用原子吸收光谱（ＡＡＳ）法测定镉含量。以来金属硫蛋白就成为生物化学及生命科学领域的研究热点。按每分子类ＭＴ结合７个镉离子计算类金属硫蛋白含量。但是有关植物中金属硫蛋白的研究报道较少。我们对新疆地产２．３紫外扫描测定类ＭＴ含量对类ＭＴ提取液在１９０～３００ｎｍ的药食兼用植物鹰嘴豆中金属硫蛋白含量进行了检测，以期对今范围之间扫描，镉一金属硫蛋白在２５５ｎｍ处有特定的紫外吸收后鹰嘴豆产品的功能开发提供理论依据。峰。脱金属处理：１ｍｌ类金属ＭＴ提取液加入２００ｌ的１ｍｏＬ／Ｌ１材料ＨＣ１，２００ｌ的０．５ｍｏＬ／ＬＥＤ—ＴＡ，混合后室温下反应３０ｍｉｎ，脱１．１豆种由新疆木垒县大龙王食品有限公司提供，均为当年金属处理后再进行紫外扫描，脱金属后吸收峰消失。产鹰嘴豆。２．４鹰嘴豆金属硫蛋白分子量的测定１．２仪器及试剂Ｃｉｎｔｒａ１０ｅ型Ｕｕ—ＶｉｓｉｂｌｅＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（紫外２．４．１样品处理样品处理：取以上类ＭＴ提取液装入透析袋扫描仪，美国），ＨＩＴＡＣＨＩ２０Ｐｒ一５２Ｄ型低温冷冻离心机，日立ｚ中，在聚乙二醇一６００（ＰＥＧ一６００）中透析浓缩。浓缩液经高效液７０００型偏振塞曼原子吸收分光光度计，血红蛋白（Ｓｉｇｍａ公司相柱层析，离子交换层析脱盐后收集纯化金属硫蛋白分离液。取产品），ＣｄＣ１・２．５ＨＯ（分析纯，西安化学试剂厂），ｐＨ＝８．６Ｔｉｆｓ分离液和ＳＤＳ样品缓冲液各５Ｏｌ混匀后在沸水中煮沸５ｍｉｎ。ＨＣ１（Ｓｉｇｍａ公司产品），９５％乙醇（分析纯，西安化学试剂厂）。２．４．２分离胶及浓缩胶的配制分离胶浓度１２％，浓缩胶５％。．４．３点样标准蛋白与待测样品各２０ｌ，然后在点样孔两边Ｌｃ一２０高效液相色谱仪，ＨＥ一１２０垂直板电泳槽，凝胶成像仪２各加５０ＩｘｌＳＤＳ样品缓冲液以防止扩散。（Ｔａｎｏｎ一４５００）。２．４．４电泳浓缩胶中电流为２０ｍＡ，待溴酚蓝移动至距底边１２方法

植物金属硫蛋白的研究进展

合重金属离子的低分予量蛋白质”。自Ｃｓｒｉｅｌａｔｌ和不含Ｃｓ中间区分开，Ｃｙ的排列方式一般为Ｃｅｎｙ的ｓＣ、
Ｂｒｅ于１７年首次从大豆根中发现植物ＭＴ后，近ＣＣ和ＣＸＣ。Ｉ类金属硫蛋白Ｃｓａｎｔｔ９７ｓＸＸｔＩＩ－，ｙ分布在整个氨基３０年来，植物金属硫蛋白的研究得到了快速的发展。酸序列中＿Ｉ类金属硫蛋白是由长度不同的肽链构成４ＩＩ；本文就其分类、多念性、理化性质、金属结合特性、的多聚物，为非基凶编码产物，是以谷胱甘肽为底物功能及表达特点逐一练述，并为其表达特征、组织、催化合成的金属硫醇盐多肽，被特称为植物螯合驮Ｉ。
器官特异性及基因组的结构、染包体的定位、在上
壤中富集重金属等进一步的研究打下坚实的基础。
３植物金属硫蛋白的的空间结构
用核磁共振、ｘ射线等技术研究发现，动物ＭＴ中氨基酸顺序不同，但空问结构却相似，即ＭＴ整个
１植物金属硫蛋白的特性
基金顶重庆市自然科学基金项目（ＳＣ，２０Ｂ２２。ＣＴ０８Ｂ１６）作者简介：翟军鹏（９３１１８，男．【运域人．硕ｊ研究生， …珂：植物分ｌｌ物学方面的研究。 ※通讯｝。ｒ牛１睹要从事
样具有多态性。
４植物金属硫蛋白的功能

植物金属硫蛋白

第一作者简介：赵博（ ;<"; —），女，硕士研究生，主要从事植物转基因研究。 .=>9?(： @A9B9CDE F9G’’) D’> !# 通讯作者：收稿日期： !$$H I $J I !H
)期
赵博等：植物金属硫蛋白"型与谷胱甘肽在烟草中的表达和合成特性
));
［ !" # !$ ］白类似的抗重金属和氧胁迫的功能。由于功
［ U， H］并具有铜亲和性的特点。植物 8/P 与抗逆反
应、胚胎发育、果实成熟、衰老等过程有关，并在不同情况下通过不同的机制发挥清除自由基及抗氧［ H］化作用，增强细胞活性。 8/! 在植物和哺乳动物减缓重金属胁迫过程中的抗逆作用和组织细胞［ " ‘ ;$ ］损伤修复过程中具有显著功能。 X67 （谷胱甘肽）在植物体内具有和金属硫蛋
植物金属硫蛋白 ! 型与谷胱甘肽在烟草中的表达和合成特性
赵# 博# 祖元刚# 安志刚 !
（东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨# ;K$$J$ ）
摘# 要# 利用从印度芥菜（ !"#$$%&# ’()&*# ）中获得的金属硫蛋白 ! 型（ +L8/! ）基因通过农杆菌介导法转入模式植物种烟草中。转基因烟草在经过继代组织培养和抗生素筛选以及 M45 和 NOPQ= O:B C(’Q 检测后，确定目的基因 +L8/=! 被整合到烟草基因组中并具备表达功能。与对照野生型相比，转入金属硫蛋白 ! 型的烟草在植物形态和根部发育方面都发生了显著的性状变化。在正常条件下，转基因植物叶片组织中谷胱甘肽的含量与野生型没有明显差别，但经过 ;$$ >>’( ・ - I ; 4R! S 胁迫后，谷胱甘肽的含量明显高于野生型。在转基因植物细胞膜系统中 &=型 3/M 酶的活性低于野生型，而 M=型 3/M 酶的活性则表现出明显的升高趋势。关键词# 印度芥菜；谷胱甘肽；金属硫蛋白 ! 型；烟草； M=型 3/M 酶； &=型 3/M 酶中图分类号： TH"# # 文献标志码： 3# # 文章编号： ;UH% I K;$! （ !$$" ） $! I $!!! I $K

植物金属硫蛋白的研究进展

第7卷第3期 2021 年 6 月
生物化工 Biological Chemical Engineering
文章编号：2096-0387（2021）03-0170-03
Vol.7 No.3 Jun. 2021
植物金属硫蛋白的研究进展
邱颖胜 1，刘燕敏 1，魏超 2，董舒乐 1，刘骕骦 1*
（1. 湖州学院生命科学与健康系，浙江湖州 313000；2. 肇庆学院生命科学学院，广东肇庆 526061）
Biochemistry (Mosc),2016,81(6):565-573.
Expression and Induction During Senescence and in Response to [13] CHEN Y,ZHI J,LI X,et al.Diversity in Cadmium Accumulation and
积极的作用。Liu 等利用酵母双杂交和双分子荧光互补（BiFC）实验发现大豆基质金属蛋白酶 Gm1MMP 与 GmMT4 存在互作关系，并推测 Gm1-MMP 与
的萌发有关。番茄中，SlMT1 在根中高表达，SlMT2 在叶片中高表达，SlMT3 在根、叶片和果实中高表达， SlMT4 主要在果实中高表达 [8]。瓜尔豆中，CtMT1 在
面的研究进展进行综述，以期为进一步阐明植物金属
因类型、物种、组织和器官、生长发育时期和
硫蛋白的功能特征以及新种质的创新奠定基础。
环境因子的不同，植物 MTs 基因呈现出不同的表达
基金项目：浙江省自然科学基金（LQ20C130003）；湖州学院大学生创新创业训练科研项目（2021CXCY06）。作者简介：邱颖胜（2000—），男，浙江宁波人，本科在读，研究方向：种子生物学。通信作者：刘骕骦（1990—），男，黑龙江绥化人，博士，讲师，研究方向：植物耐逆分子生物学。E-mail：8387870552@ 。

九州虫草中金属硫蛋白的诱导、提纯及性质研究

ＷＡＮＧＷｅｉ，ＸＩＥＢｏ。ＵＵＦａｎｇ。ｅｔａｌ

（１．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＧａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８０，Ｃｈｉａ；ｎ２．ＧｕｉｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｃｈｉａ；ｎ
ａｓａｍｅａｎｓ．ａｎｄｔｏｓｅｌｅｃｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｓｗｅｌｌａｓｖｅｉｒｆｙｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｎａｔｕｒｅｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎｌａ
ｔｏｉｎｄｕｃｅｈｅｔｓｙｎｈｅｔｓｉｓｏｆｍｅｔｌｌａｏｔｈｉｏｎｅｉｎ．Ｔｈｅｍｅｔｌｌａｏｔｈｉｏｎｅｉｎｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄａｆｔｅｒｃｅｌｌｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，ｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｓｔｅｐｓ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｗａｓｍａｄｅｏｎｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｚｉｎｃｓｕｌｆａｔｅｉｎｄｕｃｉｎｇｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｅｃｒｅｔｉｎｇｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，ａｎｄｄｅｔｅｍｉｒｎａ－ｔｉｏｎｗａｓｍａｄｅｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓ，ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌｃｏｎｔｅｎｔ，ａｎｄｈｅｔｃｏｎｔｅｎｔｏｆｚｉｎｃｍｅｔａｌｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｇｍｅｔｌｌａｏｈｉｔｏｎｅｉｎｆｔａｅｒｐｕｒｉｉｆ－ｃａｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓＷｉｔｈｚｉｎｃａｔｏｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１５ｇ・Ｌ～ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎａｃｈｉｅｖｅｓｍａｘｉｍｕｍｙｉｅｌｄｉｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｕｐｔｏ

金属硫蛋白检测方法研究进展1

中国食物与营养2010年第09期Food and Nutrition in Chi na No.09，2010金属硫蛋白检测方法研究进展梁鹏，吴晓萍，廖爱琳（广东海洋大学食品科技学院，湛江 524025）摘要：金属硫蛋白是一种富含金属和半胱氨酸的低分子蛋白质，主要包括Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn等硫蛋白，具有在体内可被金属和其他因素诱导合成的生物学特性。

本文综述了目前7种常用的金属硫蛋白检测方法。

关键词：金属硫蛋白；金属结合法；电化学法金属硫蛋白(Metallothionein,简称M T)是一类广泛存在于生物体内的低分子量（约6500D a）金属结合蛋白，富含半胱氨酸，又叫金属硫氨酸甲基内盐，能被金属诱导。

主要存在于动物的肝脏、肾脏、胰腺和小肠中。

近年来，很多实验表明，金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢，具有拮抗电离辐射、清除自由基以及对重金属解毒的作用，还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关。

到目前有几种方法已用于生物组织和体液中M T的定量，但尚无标准方法。

本文重点综述7种方法，介绍其特点，有助于在进行有关研究时选择和建立适宜的检测方法。

1 金属结合法金属结合法(Metal bindin g )主要基于M T对金属的高亲合力、且不同金属的亲合力具有差异性及其热稳定性而建立。

主要通过测定M T结合金属—竞争性替换金属含量来检测M T中金属含量的增高，从而计算出MT的含量。

1973年，P i o t r o w s k i等首先建立了金属结合法 (203H g-T C A法)用于测定组织中的M T。

由于H g2+在酸性环境下不仅可与M T结合而且还可置换其他金属离子(如p H=2.1时，分别有98％的H g2+和1％的C d2+与M T 结合)。

因此，本法适用于在利用酸沉淀其他蛋白而将M T分离出来时的测定[1]。

但此法的203H g的加入量极其重要，如加入量过小，反应体系中尚有未与203H g结合的MT，而导致测定结果偏低；相反，加入量过大, 则203H g呈游离状态或与不被T C A所沉淀的低分子量组分相结合，又可使测定结果偏高。

九州虫草中金属硫蛋白的诱导、提纯及性质研究

九州虫草中金属硫蛋白的诱导、提纯及性质研究王巍;谢波;刘芳;吴观生;刘师宏;庄建;陈寄梅;郭惠明;朱平【摘要】Objective To explore an economic, efficient, easy metallothionein production process, with biological fermentation engineering as a means, and to select the optimal production extraction conditions as well as verify the extracted metallothionein nature by orthogonal experimental method. Methods Submerged fermentation Kyushu as genetically engineered Cordyceps fungi, ZnSO4 stimulation was used to induce the synthesis of metallothionein. The metallothionein was isolated after cell disruption, crude extraction and chromatography steps. Preliminary study was made on the optimum conditions for zinc sulfate inducing cordyceps secreting metallothionein,and determination was made of the relative molecular mass, sulfhydryl content, and the content of zinc metal of the resulting metallothionein after purification. Results With zinc atom concentration of 15 g· L-1 metallothionein achieves maximum yield in the fermentation process,up to 10. 86 mg ·g-1 mycelium( wet weight ). The molecular weight of the zinc metallothionein is about 7 kD,each molecule metallothionein containing 21 cysteine and seven zinc atoms. Conclusion Through protein column chromatogram and ultraviolet scan pattern analysis the extraction of protein proves to accord with the characteristics of metallothionein.%目的以生物发酵工程为手段,探寻一种经济,高效,简易的金属硫蛋白生产工艺,并用正交试验法优选出最适的生产提取条件及验证所提取的金属硫蛋白性质.方法以经过基因工程改良的九州虫草真菌为菌种,采用液态深层发酵增殖菌丝体并用ZnSO4刺激诱导其合成金属硫蛋白,后经细胞破碎,粗提取和层析等步骤,得到锌金属硫蛋白,同时初步研究硫酸锌诱导虫草金属硫蛋白的最佳条件,提纯后所得金属硫蛋白的相对分子质量,巯基含量及金属锌的含量.结果较传统动物肝脏提取方法,九州虫草菌株发酵法可快速高效的制得金属硫蛋白,发酵过程中培养基中锌原子浓度达15 g·L-1时金属硫蛋白达到最高产率,可达10.86mg·g-1菌丝体(湿重).该种锌金属硫蛋白分子量约为7 kD,每分子金属硫蛋白含有由21个半胱氨酸和7个锌原子.结论通过蛋白柱层析图谱,紫外光扫描图谱分析,证明所提取蛋白符合金属硫蛋白的相应特征.【期刊名称】《安徽医药》【年(卷),期】2013(017)003【总页数】3页(P373-375)【关键词】生物工程;九州虫草;金属硫蛋白;生产;测定【作者】王巍;谢波;刘芳;吴观生;刘师宏;庄建;陈寄梅;郭惠明;朱平【作者单位】广东省心血管病研究所,广东省人民医院,广东省医学科学院,广东,广州,510080【正文语种】中文金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类低分子量、富含巯基、能结合金属离子且具有独特性能的蛋白质。

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ＭＴｒｍｅｖｓｏｉｅｓｅｌｎｓＴｈｂｏｂｎｅｗｓｅｒｂｌｅｒａｅｆｅｒａｍｅｔｏｅｖｎｔｌ．ｆｏ１ａｅｆｍａｚｅｄｉｇ．ｅａｓｒａｃａｒｍａｋｅｙｄｃｅｓｄａｔｒｔｅｔｎｆｒｍｏｉｇｍｅａｓＷｈｎａｌｚｄｂＤＳ—ＰＡＧＥ，ｉｇｅｂｎｅｒｔｌｃｌｒｗｅｇｆ１ｅｎａｙｅｙＳａｓｎｌａｄｎａｈｅｍｏｅｕａｉｈｔｏ４ＫＤａｗａｏｎＴｈｓｒｓｌｓｓ・ｓｆｕｄ．ｉｅｕｔｕｇｇｓｅｈａｈｅｅｔａｉｎｏｉｅｃｎａｎｄＭＴ．ｅｔｄｔｔｔｘｒｔｏｆｍａｚｏｔｉｅＫｅｒｓ：ｔｌｏｈｏｅｎ；ｌｎ；ｉｅ；ｘｒｃｉｎｙｗｏｄＭｅａｌｔｉｎｉｐａｔｍａｚｅｔａｔｏ
因此对ＭＴ的研究已经成为热点领域。相比于动物ＭＴ植物中ＭＴ的研究起步较晚，多方面研究也不，很
十分深入。在植物ＭＴ提取方法的基础上，索了一种制备植物金属硫蛋白的方法，成功地在玉米中提摸并
取了ＭＴ并进行了鉴定。
玉米郑单９子浸种后放于白瓷盘中２８种５℃下水培发芽生长，长出２～待４片叶子时，取叶片１～称２ｇ并用剪刀剪碎；入１Ｌ０１ｍｌＨ８６的ｓ，加０ｍ．ｏｐ． —ＨＣ缓冲液，电动玻璃匀浆器在冰浴条件下充分１用
收稿日期：０９一１６２０Ｏ一ｌ作者简介：徐振彪（９０一）男，１７，硕士，讲师，主要研究方向：生物化学与分子生物学。
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８８・
山东农业大学学报（自然科学版）
第４卷ｌ
交浆，匀浆液放于４℃浸提５—８ｈ后４ｏ００ｒｐ离心１ｉ；１０ｍＣ２５ｍｎ收集上清液，于１０℃ 水浴加热５并０
山东农业大学学报（自然科学版）００，４１：８８，２１１（）７— ８
ＪｕｎｌｆｈｎｏｇＡｒｕｔｒｎｖｒｉ（ａｒｌｃｅｃ）ｏｒａｏａｄｎｇｃｌａＵｉｅｓｙＮｔａＳｉｎｅＳｉｕｌｔｕ
植物金属硫蛋白的提取及检测
１２主要试剂及仪器．
Ｔｉ、ＤＡ、Ｃ、水乙醇等为国产分析纯试剂。ｒＥＴＨ１无ｓＵＶ一１４２０紫外可见分光光度计，日本岛津公司。ＳＧ３３ＩＭＡＫ０高速台式冷冻离心机，国产。德
ＭＴ提取方法
徐振彪，王平翠，孙永乐，宋林霞
（山东理工大学生命科学院，山东淄博２５４）５０９
摘要：在综合动物金属硫蛋白的提取方法上，摸索了一种用于玉米金属硫蛋白的提取方法。以玉米幼苗叶片为材料，通过本研究所述方法提取了玉米金属硫蛋白（ｅｌｔｉｅ，）ｍｔｌｈｏｉＭＴ的粗提液，ａｏｎｎ该粗提液的特征吸收峰在２０９ｎｍ处，且经脱金属处理后其２０ｎ９ｍ处特征吸收峰明显降低，ＳＳ—ＰＧ经ＤＡＢ检测，分子量１ｄ在４Ｋａ附近有单一
条带，明所获粗提液中含有玉米金属硫蛋白。表
关键词：金属硫蛋白；植物；玉米；提取中图分类号：８ＱＳ１５文献标识码：Ａ文章编号：００— ３４２１）１— ０７— ２１０２２（００００８０
ＥＸＴＲＡＣＴＩｏＮＡＮＤＤＥＴＥＣＴＩｏＮｏＦＰＬＡＮＴＥＴＡＬＬｏＴＨＩＭｏＮＥＩＳｕ，ＵＮｎＹｏｇ—ｌＳＯＮＧｎ—ｘａｅ，Ｌｉｉ
（ｏｅｅｏｉｃｅｃ，ｈｎｏｇＵｉｅｉｆｅｈｏｏｙＺｂ５０９ＣｉａＣｌｇｆｆＳｉｅＳａｄｎｎｖｒｔｏｃｎｌ，ｉ２５４，ｈｎ）ｌＬｅｎｓｙＴｇｏ
ＡｂｔａｔＢｓｄｏｈｘａｔｎｍｔｏｓｆｔｌｔｉｅＭＴｉｎｍａ，ｅｈｄｗｓｃｎｔｃｅｔｅｔｃｓｃ：ａｅｎｔｅｅｔｃｉｅｈｄａｌｈｏ（）ｎａｉｌａｍｔｏａｏｓｕｔｘａｔｒｒｏｏｍｅｏｎｓｒｄｏｒ
１材料与方法
１１实验材料．
玉米种子郑单９，品种夏播生育期９，型紧凑，病，杆成熟，均株高２０ｃ一般亩产量８该８ｄ株抗活平４ｍ，６０～５ｇ是我国北方地区常见的优良玉米种植品种。购自淄博市农科院。０７０ｋ，
金属硫蛋白（ｔｌｈｏｅｎＭ是一种富含半胱氨酸的低分子量特殊非酶蛋白质，１５ＭｅａｏｉｎｉＴ）ｌｔ于９７年从马肾上腺皮质中首次发现。由于ＭＴ在金属元素代谢、抗辐射、氧化、抗清除自由基等多方面都发挥重要作用，