细胞跨膜蛋白提取方法

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简述物质跨膜转运的方式及其特点

简述物质跨膜转运的方式及其特点跨膜转运是指物质在生物膜上的跨越过程，是细胞内外物质交换的重要方式。

生物体内的物质跨膜转运主要包括主动转运、被动转运和细胞内外物质交换等几种方式。

这些转运方式各具特点，下面将分别进行介绍。

一、主动转运主动转运是指细胞通过跨膜蛋白质的活性转运，耗费能量将物质从浓度低的一侧转移到浓度高的一侧。

最常见的主动转运蛋白是ATP 酶，在细胞膜上能够将物质与ATP结合，并通过ATP的水解释放的化学能将物质跨膜转运。

主动转运的特点是能够逆转物质的浓度梯度，使得物质从低浓度区域转移到高浓度区域，从而维持细胞内外的浓度差异，维持细胞内环境的稳定。

二、被动转运被动转运是指细胞通过跨膜蛋白质的通道或载体蛋白，在浓度梯度的作用下，使物质自由地从高浓度区域转移到低浓度区域，不需要耗费额外的能量。

被动转运可以分为通道转运和载体转运两种方式。

通道转运是指跨膜蛋白形成通道，使得物质可以通过通道自由扩散，如离子通道蛋白；而载体转运是指跨膜蛋白在物质结合后发生构象变化，使物质经过载体蛋白的转运。

被动转运的特点是依赖于浓度梯度，不需要额外能量的消耗，但无法逆转物质的浓度梯度。

三、细胞内外物质交换细胞内外物质交换是指细胞与外界环境之间的物质交换过程，包括分子在细胞膜上的吸附、扩散、渗透等方式。

细胞膜是一个半透明膜，能够选择性地允许某些物质通过，而阻止其他物质的通过，从而实现对物质的筛选和交换。

细胞内外物质交换的特点是依赖于物质的特性和细胞膜的性质，通过不同的方式实现物质的进出。

总的来说，物质跨膜转运是细胞内外物质交换的重要方式，主要包括主动转运、被动转运和细胞内外物质交换几种方式。

不同的转运方式具有各自独特的特点，能够满足细胞对物质的需求，维持细胞内外环境的稳定。

通过这些转运方式，细胞能够有效地实现物质的吸收、排泄和运输，保证细胞正常生理功能的进行。

在细胞内外物质交换的过程中，各种转运方式相互配合，共同维持细胞内外的物质平衡，保证细胞的正常运作。

提取膜蛋白的方法

提取膜蛋白的方法提取膜蛋白是一项关键的实验步骤，用于研究膜蛋白的结构和功能。

本文将介绍几种常用的膜蛋白提取方法。

1. 浸泡法浸泡法是一种简单的膜蛋白提取方法。

将细胞或组织样品置于适当的缓冲液中，如磷酸盐缓冲液或生理盐水中，并加入一些溶解剂（如阴离子洗涤剂）以破坏膜结构。

浸泡一段时间后，离心以分离出溶液中的膜蛋白。

2. 磷脂双层溶液法磷脂双层溶液法利用磷脂双层膜的特性来提取膜蛋白。

首先，将细胞或组织样品放入含有磷脂双层的液体中。

磷脂双层膜与细胞膜相似，可吸附并保持膜蛋白的结构和功能。

然后，用洗涤液洗涤磷脂双层，使膜蛋白释放到洗涤液中。

3. 超声法超声法是一种物理方法，通过超声波的能量来提取膜蛋白。

将细胞或组织样品置于含有缓冲液的管中，并使用超声波处理。

超声波的能量可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到缓冲液中。

然后，对溶液进行离心，将膜蛋白分离出来。

4. 酸碱提取法酸碱提取法利用pH的变化来提取膜蛋白。

首先，将细胞或组织样品放入酸性或碱性溶液中，并搅拌。

酸性或碱性环境可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到溶液中。

然后，通过调整pH值，使膜蛋白沉淀，进一步提纯。

5. 亲水基质法亲水基质法是一种通过亲水基质与疏水膜蛋白的选择性结合来提取膜蛋白的方法。

细胞或组织样品与亲水基质接触，亲水基质与细胞膜的亲水区域结合，使膜蛋白释放到溶液中。

然后，通过离心和洗涤步骤来分离和纯化膜蛋白。

这些方法在膜蛋白的研究中应用广泛，但根据具体的实验目的和样品特性，可以选择适合的方法进行膜蛋白提取。

实验中还应注意选择合适的缓冲液、溶液浓度和温度，并结合离心、洗涤等步骤进行蛋白的纯化和分离。

此外，需要根据实验目的选择合适的检测方法，如SDS-PAGE、Western blot等来确定提取的膜蛋白的质量和纯度。

总之，膜蛋白提取是膜生物学研究的重要一环，不同方法适用于不同的样品和实验要求。

正确选择和操作提取方法可以高效地提取膜蛋白，并为后续研究提供可靠的样品。

生物化学与分子生物学_中国药科大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年

生物化学与分子生物学_中国药科大学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年1.肌细胞中一分子葡萄糖经糖原合成加在糖原分子上，之后又通过糖原分解过程分解，最终可产生（）分子ATP参考答案:12.食物中很少被机体利用的组分是（）参考答案:碱基3.以下化合物，能够激活糖异生途径的是参考答案:乙酰辅酶A4.关于磷酸戊糖途径，以下说法错误的是参考答案:转酮酶的辅酶TPP来自于维生素B25.关于三羧酸循环的描述，错误的是参考答案:柠檬酸、琥珀酸、苹果酸和顺丁烯二酸都是反应的中间代谢物6.在红细胞中，葡萄糖分解代谢并产生能量分子ATP的途径是什么？反应中唯一一次氧化还原反应生成的产物为参考答案:糖酵解 1,3-二磷酸甘油酸7.下列不属于糖胺聚糖的化合物为参考答案:琼胶8.关于维生素C结构和性质的叙述，哪一项是错误的？参考答案:维生素C 具有酸性是因为-COOH释放质子9.长期生食鸡蛋，容易缺乏的维生素为参考答案:生物素10.以下化合物中，不含腺苷酸组分的为参考答案:ACP11.关于维生素，以下说法不正确的是参考答案:参与凝血过程的维生素是维生素K，它只有天然存在的形式12.下列物质代谢过程发生在内质网和细胞质的是参考答案:胆固醇合成13.缺乏会引起恶性贫血的维生素是：①泛酸；②叶酸；③钴胺素；④抗坏血酸参考答案:②③14.有关维生素B1的叙述不正确的是参考答案:噻吩环上的C会形成碳负离子行使亲核基团功能15.维生素PP缺乏将导致参考答案:癞皮病16.关于泛酸，以下说法不正确的是参考答案:广泛存在于生物界，涉及多种缺乏症17.化学渗透学说中提到的质子推动力包括参考答案:线粒体内膜外酸内碱的化学势能_线粒体内膜外正内负的电势能18.基因的功能主要表现在两个方面，即（）参考答案:基因的表达_通过DNA复制，传递遗传信息19.下列有关卫星DNA说法正确的是（）参考答案:是一种高度重复序列_可存在于染色体的着丝粒区域_卫星DNA只发现于真核生物_常成串排列20.关于病毒基因组的特点，下列说法正确的是（）参考答案:病毒基因组可以是DNA，也可以是RNA_病毒基因组有基因重叠现象_RNA 病毒很容易产生突变21.原核生物基因组的特点是（）参考答案:原核生物基因组包括染色体DNA和质粒DNA_相关基因组成操纵子结构_基因多数是单拷贝的_非编码核苷酸序列少22.下列有关质粒的叙述，正确的是（）参考答案:质粒所带基因赋予宿主细胞特定的表型，比如抗性质粒带有抗性基因，可使宿主菌对某些抗生素产生抗性_基因工程中常用质粒作为基因克隆和表达的分子载体_质粒是细菌细胞质中能自主复制和遗传的环状DNA分子23.以下哪些过程可以促进尿素合成？参考答案:精氨酸浓度增高_N-乙酰谷氨酸生成增多_高蛋白膳食24.双脱氧链末端终止法测序的原理不正确的是参考答案:能在电泳结果图中直接读出序列25.关于糖、脂、氨基酸代谢联系错误的是参考答案:脂肪可以转变为糖、氨基酸26.竞争性抑制剂存在时，Km值的变化情况是参考答案:增加27.下列属于酶活性的共价修饰调节的是参考答案:肽链苏氨酸残基磷酸化28.下列哪对物质是合成嘌呤环和嘧啶环都必需的？（）参考答案:Gln/Asp29.已知某种酶的Km值为25mmol/L，欲使酶促反应达到最大反应速度的50%，该底物浓度应为参考答案:25mmol/L30.使酶发生不可逆破坏的因素是参考答案:强碱31.有机磷农药参考答案:是酶分子的羟基抑制剂32.下列对于酶的叙述，哪一项是正确的？参考答案:有些酶是RNA33.诱导契合学说是指参考答案:底物改变酶构象34.酶催化所必需的基团是指参考答案:位于活性中心内、外的，维持活性所必需的基团35.酶蛋白分子中，参与酸碱催化的最主要的基团是参考答案:咪唑基36.2,4－二硝基苯酚抑制细胞线粒体的功能, 可能是由于阻断下列哪一种生化作用而引起?参考答案:破坏质子梯度的产生37.酶原所以没有活性是因为参考答案:活性中心未形成或未暴露38.cAMP可别构激活下列哪种酶参考答案:蛋白激酶A39.下列关于同工酶的叙述，正确的是参考答案:是催化相同的化学反应，而酶分子结构不同、理化性质可各异的一组酶40.人体内的20种氨基酸都可以转变为糖参考答案:错误41.下列关于关键酶叙述错误的是参考答案:催化的反应是可逆反应42.联系糖，脂代谢重要枢纽物质是参考答案:磷酸二羟丙酮43.乙酰辅酶A不能转变为参考答案:α-酮戊二酸44.锌指结构包括（）参考答案:2个β-折叠和1个α-螺旋45.嘌呤环9号位N原子来源于（）参考答案:Gln的酰胺N46.转录合成RNA的原料是（）参考答案:NTP47.以下关于亮氨酸拉链说法错误的是（）参考答案:亮氨酸拉链以C端和DNA结合48.以下关于ρ因子的说法正确的是（）参考答案:ρ因子具有解旋酶活性49.以下关于维生素的描述，正确的是参考答案:水溶性维生素均可作为酶的辅因子参与代谢50.关于硫辛酸，以下说法不正确的是参考答案:是一种羧基载体51.Western Blot设计的原理是参考答案:抗原抗体相互作用52.镰刀形红细胞贫血症是由HbA的结构变化引起，其变化特点是参考答案:HbAβ-链的N-端第六位谷氨酸残基被缬氨酸取代53.如果想提取一个跨膜的膜蛋白，以下可以将其从细胞膜中解离的试剂为参考答案:SDS54.Hb的氧合曲线呈现S形的原因是参考答案:Hb有协同效应55.下列关于蛋白质变性的描述，正确的是参考答案:蛋白质变性后丧失原有的生物活性56.一个操纵子通常含有（）参考答案:一个启动子和数个编码基因57.以下乳糖操纵子结构顺序正确的是（）参考答案:I-CAP结合位点-P-O-Z-Y-A58.以下不能诱导原核生物乳糖操纵子表达的是（）参考答案:葡萄糖59.以下哪种情况，乳糖操纵子的转录活性最高（）参考答案:高乳糖，低葡萄糖60.顺式作用元件是指（）参考答案:与结构基因串联的特定DNA序列61.转录因子的结构不包括（）参考答案:mRNA结合结构域62.以下有关乳糖操纵子的说法正确的是（）参考答案:阻遏蛋白与操纵序列结合抑制转录63.下列关于α-螺旋结构的叙述，正确的是参考答案:构成螺旋构象的作用力是氢键64.下列除了哪一种化合物外，都是呼吸链的组分？参考答案:NADPH65.呼吸链的电子传递体中，有一组分是脂质而不是蛋白质，这就是参考答案:CoQ66.呼吸链的各细胞色素在电子传递中的排列顺序是参考答案:b→c1→c→aa3→O267.ATP的合成部位是参考答案:F1因子68.目前公认的氧化磷酸化理论是参考答案:化学渗透假说69.下列呼吸链组分中氧化还原电位最高的是参考答案:Cytc70.ATP从线粒体生成后向外运输是通过参考答案:ATP-ADP转位酶71.H和电子通过呼吸链传递给氧的过程中，遇到了氢氰酸，这时发生了参考答案:呼吸链电子传递中断，氧化磷酸化被抑制72.转录因子转录激活结构域类别不包括（）参考答案:富含碱性氨基酸的结构域73.比较真核生物与原核生物的基因组DNA复制，二者相同之处是参考答案:合成方向都是5'→3'74.在原核生物基因组DNA复制过程中，RNA引物通常由（）降解去除参考答案:DNA Pol I75.DNA复制时，下列（）是不需要的？参考答案:限制性内切酶76.真核生物中RNA聚合酶II的转录产物是（）参考答案:hnRNA、LncRNA、miRNA77.DNA复制中的引物是（）参考答案:由DNA为模板合成的RNA片段78.1958年Meselson和Stahl利用15N标记大肠杆菌DNA的实验首先证明了下列（）机制参考答案:DNA的半保留复制机制79.下面（）突变最可能是致死的参考答案:染色体DNA分子中，插入一个碱基对80.端粒酶是一种（）参考答案:反转录酶81.肝脏是机体物质代谢的枢纽，也是体内能进行糖异生的唯一器官参考答案:错误82.以下关于蛋白质分离和含量测定的叙述，错误的是参考答案:BCA法不是蛋白质定量的方法83.关于氨基酸和蛋白质，以下叙述错误的是参考答案:凝胶层析时，分子量小的蛋白质先流出柱子84.赖氨酸pK1(α-COO-)=2.18，pK2(α-NH3+)=8.95，pK3(ε-NH3+)=10.53，那么其pI值应为参考答案:9.7485.大肠杆菌RNA聚合酶中σ因子的功能是（）参考答案:识别DNA链上的起始点86.抑制嘌呤核苷酸从头合成途径的抗肿瘤药物有（）参考答案:6-巯基嘌呤_氨甲蝶呤87.关于氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ的叙述，正确的是（）参考答案:位于细胞质_UMP是该反应的抑制剂_消耗ATP88.次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶参与下列哪种反应（）参考答案:嘌呤核苷酸补救合成89.在体内能分解为β-丙氨酸的核苷酸是（）参考答案:UMP90.下列描述正确的是（）参考答案:饮食以肉食为主的人和以米饭为主的人比较，前者得痛风的可能性大91.人体内嘌呤核苷酸分解代谢的最终产物是（），与其生成有关的重要酶是（）参考答案:尿酸，黄嘌呤氧化酶92.Gln不参与以下哪个代谢反应？（）参考答案:由dUMP生成 dTMP93.不需要DNA连接酶参与的反应是（）参考答案:RNA的转录94.以下关于一碳单位的生理功能的说法错误的是（）参考答案:一碳单位代谢障碍会导致再生障碍性贫血95.尿素合成的关键酶是（）参考答案:氨甲酰磷酸合成酶I96.肌肉组织中氨的转运方式为（）参考答案:丙氨酸-葡萄糖循环97.体内氨基酸脱氨的主要方式是（）参考答案:联合脱氨基98.下列关于L-谷氨酸脱氢酶催化L-谷氨酸脱氢的说法错误的是（）参考答案:以FAD或FMN为辅基99.在泛素-蛋白酶体途径的胞内蛋白质降解中，发挥识别待降解蛋白质并将泛素转移至蛋白质功能的酶是（）参考答案:E3泛素连接酶100.下列关于蛋白质消化的说法错误的是（）参考答案:食物中的蛋白质在口腔中被初步消化101.氮平衡是指摄入蛋白质的含氮量与排泄物中含氮量之间的关系，恶性营养不良的病人会出现（）参考答案:氮负平衡102.以下氨基酸中不是营养必需氨基酸的是（）参考答案:Asp103.人类基因组计划（HGP）研究表明人单倍体基因组中含有的碱基对数约为（）参考答案:3×109bp104.基因组是指（）参考答案:一种生物体具有的所有遗传信息的总和105.下列属于真核生物基因的特点是（）参考答案:断裂基因106.人类基因组中，编码蛋白质的基因大多数属于（）参考答案:单拷贝序列107.大肠杆菌DNA复制需要：(1)DNA聚合酶Ⅲ；(2)解链蛋白；(3)DNA聚合酶Ⅰ；(4)引物酶；(5)DNA连接酶参加。

细胞膜蛋白提取方法

中间涡旋振荡混匀 2 次。 5. 再次高速涡旋振荡 5 秒，然后在 4℃，500×g 条件下离心 3 分钟，弃沉淀。 6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，加入 10ul 试剂 B，充分混匀。 7. 37℃水浴 10 分钟。 8. 在 37℃ 1000×g 离心 5 分钟。 9. 此时溶液分为两层，小心吸取分离出管底部大约 20ul 液体。 10. 用适量稀释液 C 稀释该溶液，即得膜蛋白样品。 11. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
1. 提取液制备：每 200ul 蛋白提取液 A 和 C 中分别加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取 5-10×106 个细胞①，在 4℃，500×g 条件下离心 2-3 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 在细胞沉淀中加入 200μl 冷的提取液 A，高速涡旋振荡 15 秒，置冰上 20 分钟，
使用本产品发表的部分新文献：
● Ge Zhao, Siyuan Li, Wei Zhao et al.
Phage Display against Corneal Epithelial Cells
Produced Bioactive Peptides That Inhibit Aspergillus Adhesion to the Corneas
产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3401 BB-3721 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3311 BB-3703
细胞膜蛋白提取试剂盒
产品组成：
产品组成规格
提取液 A 提取液 B 膜蛋白稀释液 C 蛋白酶抑制剂混合物

细胞膜-胞浆-核膜蛋白分步提取方法

蛋白提取步骤： 1. 提取液制备：每400ul 冷的蛋白提取液A/D 中加入分别加入2ul 蛋白酶抑制剂混合物和2ul 磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。 2. 取5-10×106 个细胞①，在4℃，1000rpm 条件下离心5-10 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，用细胞刮刀收集细胞。（组织样本50-100mg 剪碎，加冷PBS，用组
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
浴10 分钟，37℃下②1000g-2000g 力离心5 分钟，此时溶液分为两层
（对着光线看），上层为核内蛋白，下层是核膜蛋白约为20-40μl。小心移除上层，用1-2 倍体积的提取液D 溶解下层即为细胞核膜蛋白。 9. 在步骤6 中所得到的上清（I）中加入5ul 提取液C，充分混匀。37℃水浴10 分钟。
10. 37℃下② 1000g 离心3 分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），上层是胞浆
蛋白部分，下层是细胞膜蛋白部分约为40-50μl。 11. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。
12. 用80-200μl 冰冷的提取液D 溶解步骤10 中的下层部分，即得细胞膜蛋白。 13. 将上述蛋白提取物定量③后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验④。
织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5 分钟，小心将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。在4℃，500g 条件下离心2-3 分钟，弃上清。）
3. 用冷PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 每5×106 个细胞中加入400ul 冷的蛋白提取液A，混匀后，在4℃条件下用试剂盒所配针筒反复吸吹细胞，使细胞完全破裂。 5. 在4℃，1000g 条件下离心5 分钟。 6. 快速将上清（I）吸入另一预冷的干净离心管，在沉淀中加入200μl 冷的提取液 B，高速涡旋振荡15 秒。 7. 将混匀的提取液B 置2-8℃振荡1-2 小时，至沉淀充分裂解，沉淀明显减少。8. 37℃水

蛋白质膜分离

蛋白质膜分离是一种实验技术，用于将细胞膜中的蛋白质与其他细胞组分分离开来，以便对其进行进一步的研究和分析。

这种技术常用于生物学和生物化学研究中，特别是在研究细胞膜蛋白的结构、功能和相互作用方面。

常见的蛋白质膜分离方法包括：
1. 亲和纯化：利用蛋白质与某些特定配体（例如抗体、配体分子等）之间的特异性相互作用，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。

例如，可以使用标记有特定抗体的磁珠或琼脂糖柱进行亲和纯化。

2. 凝胶电泳：利用凝胶电泳技术，根据蛋白质的大小、电荷等特性将蛋白质从混合物中分离出来。

常用的凝胶电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和原位凝胶电泳（Native PAGE）。

3. 离心分离：利用离心技术，将细胞裂解液或组织匀浆在不同离心速度下离心，从而分离出不同密度或大小的细胞组分。

通过不同离心速度的选择，可以将膜蛋白从其他细胞组分中分离出来。

4. 超声波破碎：利用超声波对细胞进行破碎，将细胞膜破碎释放出的膜蛋白与其他细胞组分分离开来。

5. 亲水性与疏水性分离：利用膜蛋白通常具有的疏水性和亲水性特点，采用相应的溶剂或条件将其从其他细胞组分中分离出来。

例如，可以利用疏水性相互作用将膜蛋白从细胞溶液中提取到有机溶剂中。

这些方法通常会根据具体的研究目的和实验条件进行选择和优化，以达到最佳的分离效果。

在实际操作中，常常需要结合多种方法进行蛋白质膜的分离和纯化。

物质的跨膜运输方式

物质的跨膜运输方式生命体系中的细胞是基本的单位，通过细胞膜与外界进行物质交换和信息传递。

在细胞膜中，存在多种跨膜运输方式，包括主动转运、被动扩散和细胞外液相转移等，这些方式能够帮助细胞实现物质的吸收、排泄和传递，保证生命体系的正常运转。

本文将对这几种跨膜运输方式进行详细介绍。

一、主动转运主动转运是指细胞膜通过能量耗费将物质从低浓度向高浓度方向转移的过程。

这种方式需要ATP的供能，因此也被称为ATP酶转运。

主动转运可以分为直接和间接两种。

1.直接主动转运直接主动转运是指细胞膜上的蛋白质通过ATP酶催化将物质转移到高浓度方向。

其中，钠-钾泵是最为典型的直接主动转运方式。

钠-钾泵是一种跨膜蛋白，能够将细胞内的三个钠离子和两个钾离子互换，使得细胞内外的离子浓度差得以维持。

这种方式在神经元的信号传递、肌肉收缩、肾脏的滤波功能等方面都发挥着重要作用。

2.间接主动转运间接主动转运是指细胞膜上的蛋白质利用ATP酶耗费的能量将物质转移到高浓度方向，但是这种方式并不直接与物质结合，而是通过运输载体进行。

例如，葡萄糖转运蛋白就是一种间接主动转运方式。

在细胞内，葡萄糖转运蛋白可以将葡萄糖分子转移到高浓度方向，从而实现葡萄糖的吸收和利用。

二、被动扩散被动扩散是指物质在浓度梯度的作用下自由地从高浓度向低浓度方向扩散的过程。

这种方式不需要能量的供应，是细胞内物质转移的主要方式之一。

被动扩散可以分为简单扩散和载体介导扩散两种。

1.简单扩散简单扩散是指小分子物质通过细胞膜的疏水层自由地扩散到低浓度方向，如氧气、二氧化碳等气体分子、水分子等。

这种方式具有高效性和速度快的特点，但是只适用于小分子物质的扩散。

2.载体介导扩散载体介导扩散是指物质通过跨膜载体蛋白的介导实现扩散。

这种方式适用于大分子物质的扩散，如葡萄糖、氨基酸等。

在载体介导扩散中，跨膜蛋白会与物质结合形成复合物，然后通过分子运动的方式将物质转移到低浓度方向。

三、细胞外液相转移细胞外液相转移是指物质通过细胞膜的外部液相转移到细胞内或细胞外的过程。

跨膜蛋白的表达过程

跨膜蛋白的表达过程跨膜蛋白是一类重要的膜蛋白，存在于生物体的细胞膜上。

它们具有跨越细胞膜的能力，并在细胞膜两侧发挥重要的生物学功能。

跨膜蛋白的表达过程涉及多个步骤，从基因转录到蛋白质合成再到转运和定位至细胞膜上。

本文将详细介绍跨膜蛋白的表达过程，并对相关的机制进行分析和探讨。

跨膜蛋白的表达过程可以从基因转录开始。

首先，细胞核内的DNA会解旋，形成一个可以用作mRNA合成模板的DNA链。

这个过程称为转录。

转录过程中，RNA聚合酶会通过识别和结合基因的启动子区域，开始合成mRNA链。

在跨膜蛋白的基因中，基因序列中会包含编码跨膜区域的信息。

在RNA合成结束后，转录过程会通过终止信号而终止。

这时，产生的mRNA链会进一步经历剪接过程。

剪接过程是一种将mRNA前体中的内含子序列移除，使编码剩余序列连接起来的过程。

跨膜蛋白的剪接过程往往复杂多样，它可以产生多种变体，编码不同长度和结构的跨膜蛋白。

在剪接后，mRNA会进入细胞质，在此过程中发生翻译，即mRNA合成蛋白质。

翻译是通过转运RNA（tRNA）和核糖体两个重要的分子机制来完成的。

在跨膜蛋白的翻译过程中，起始密码子将在核糖体的识别下与tRNA配对，开始合成蛋白质链。

在翻译过程中，tRNA会通过与mRNA上的密码子配对，带来氨基酸，以及位置信息，将氨基酸正确地连接起来，形成蛋白质链。

对于跨膜蛋白，翻译机器必须正确地合成包含跨膜螺旋结构的氨基酸序列。

在蛋白质合成完成后，新合成的蛋白质通常需要参与折叠、修饰和定位等一系列后续过程，以确保其正确的功能和位置。

对于跨膜蛋白，定位至细胞膜上是非常重要的。

通常，蛋白质在细胞质中会与伴体蛋白相互作用，并形成复合物。

这些伴体蛋白可以帮助新合成的蛋白质正确地折叠和定位。

跨膜蛋白通常具有一个信号序列，称为信号肽或膜领域，这个序列能够将蛋白质定位至细胞膜。

一些跨膜蛋白的信号序列位于蛋白质的氨基端，被称为氨基端信号肽，而另一些跨膜蛋白的信号序列则位于蛋白质的内部或羧基端。

细胞膜蛋白的提取方法

细胞膜蛋白的提取方法
生物侠们，还在实验室奋战吗？还在为科研经费不够发愁吗？今天我就给各位通宵达旦的大侠们带来一个福音。

下面就让我替他给你讲讲，抓紧时间啊！
首先你需要一株需要提前膜蛋白的细胞、NP40、氯化钠、Tris-Hcl、SDS、脱氧胆酸钠和PMSF，东西齐全了，就开始配裂解液吧。

下面是配方哦！
RIPA Buffer For100ml:
150mM NaCl5ml3M NaCl
50mM TrisHCl pH8.05ml1M TrisHCl pH8.0
1mM EDTA pH8.00.2ml0.5M EDTA pH8.0
1%NP-405ml20%NP-40
0.1%SDS1ml10%SDS
0.1%Deoxycholate100mg Deoxycholate
那东西都齐全了，那么来开始讲步骤吧！
1.收集细胞，将1000转离心收集的（最好低温哦）细胞悬于裂解液中20分钟；
2.就12000离心吧，收集沉淀哦；
3.在加入裂解液；
4.然后超声10-15次，每次2秒，间隔15秒；
5.再12000低温离心，收集上清，开始做实验咯！。

跨膜蛋白定向转运的过程

跨膜蛋白定向转运的过程跨膜蛋白是细胞膜上的一类重要蛋白质，它们在细胞内外之间扮演着重要的信息传递和物质转运的角色。

然而，跨膜蛋白在合成后需要准确地定向转运到细胞膜上，以发挥其功能。

本文将介绍跨膜蛋白定向转运的过程。

跨膜蛋白定向转运的过程可以分为合成、折叠、定向转运三个主要步骤。

首先是合成阶段。

跨膜蛋白的合成通常发生在内质网（endoplasmic reticulum，ER）内。

在合成过程中，核糖体将mRNA翻译成蛋白质，并通过信号肽（signal peptide）引导这些蛋白质进入内质网。

信号肽通常位于蛋白质的N末端，它能够与内质网上的信号识别粒子结合，并将蛋白质导向内质网。

接下来是折叠阶段。

在内质网内，跨膜蛋白需要正确地折叠成具有稳定结构的形态，以保证其功能的正常发挥。

为了帮助跨膜蛋白正确折叠，细胞内还存在一系列分子伴侣，如辅助折叠酶和伴侣蛋白。

它们能够与跨膜蛋白相互作用，协助其正确折叠并防止其聚集。

最后是定向转运阶段。

已经折叠好的跨膜蛋白需要被定向转运到细胞膜上。

这一过程通常涉及到一系列的分子机器和信号序列。

其中，转运途径的选择主要依赖于跨膜蛋白所具有的信号序列。

根据信号序列的不同，跨膜蛋白的定向转运可以通过囊泡介导的方式或直接插入到细胞膜上。

囊泡介导的定向转运是一种常见的方式。

在此过程中，跨膜蛋白在内质网上形成囊泡，然后通过囊泡融合的方式将其运输到细胞膜上。

这一转运过程涉及到多个分子机器的参与，如囊泡蛋白和膜融合蛋白。

通过这些蛋白的相互作用，跨膜蛋白能够被准确地转运到细胞膜上。

另一种方式是直接插入到细胞膜上。

在这种情况下，跨膜蛋白的信号序列能够直接与细胞膜上的特定受体相互作用，从而实现其定向转运。

这种方式通常适用于某些特定的跨膜蛋白，如离子通道蛋白。

跨膜蛋白定向转运的过程涉及到合成、折叠和定向转运三个主要步骤。

在细胞内，跨膜蛋白通过信号肽进入内质网，然后在内质网内正确折叠，并最终通过囊泡介导或直接插入到细胞膜上完成定向转运。

跨膜蛋白的合成过程

跨膜蛋白的合成过程1.引言1.1 概述概述部分的内容：跨膜蛋白是一类在细胞膜上起关键作用的蛋白质。

它们广泛存在于生物体的各种细胞和组织中，并参与了许多重要的生物过程，包括信号传导、物质运输、细胞识别和细胞附着等。

由于其重要性和复杂性，跨膜蛋白的合成过程一直是科学家们关注的焦点之一。

跨膜蛋白的合成过程涉及多个关键步骤和参与者。

通常情况下，跨膜蛋白的合成发生在细胞的内质网（endoplasmic reticulum，ER）中。

初步合成的蛋白质在细胞核内的核糖体中由氨基酸链逐渐组装而成。

随后，蛋白质会通过特定的信号肽（signal peptide）被定向输送至内质网的表面。

在内质网中，跨膜蛋白的合成和折叠过程是由分子伴侣和蛋白质复合物协同完成的。

分子伴侣（chaperones）可以帮助蛋白质正确折叠并防止其在合成过程中发生异常聚集。

同时，蛋白质复合物（protein complexes）则能够提供支持和指导，确保跨膜蛋白的正确定位和组装。

完成合成和折叠后，跨膜蛋白被运送至细胞膜，并通过内质网-高尔基体系统中的囊泡转运途径定向输送。

最终，跨膜蛋白会在细胞膜上定位并发挥其功能。

总之，跨膜蛋白的合成过程是一个复杂而精密的过程，涉及到多个参与者和步骤。

对跨膜蛋白的合成机制的深入研究不仅有助于我们对生物体内细胞的正常功能和疾病发生机制的理解，还可以为新药物研发和治疗策略的探索提供重要的启示。

因此，对跨膜蛋白合成过程的深入研究具有重要的理论和实践意义。

1.2 文章结构文章结构部分的内容可以按照以下方式编写：文章结构本文主要分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分主要包括概述、文章结构和目的三个方面。

概述部分将对跨膜蛋白的合成过程进行简要介绍，引起读者的兴趣。

文章结构部分则是对本文的整体结构进行说明，让读者了解本文的内容组织和安排。

目的部分则是明确本文的写作目标，为读者提供一个整体的了解。

正文部分将根据跨膜蛋白的定义和重要性，详细讲解跨膜蛋白的合成过程。

膜蛋白的提取方法

膜蛋白的提取方法
膜蛋白的提取方法通常包括以下几个步骤：
1. 细胞裂解：将包含膜蛋白的细胞或组织用不同的方式进行裂解，例如超声波处理、酸碱处理、高压处理等。

2. 膜蛋白分离：通过离心、过滤等方法将膜蛋白分离出来。

3. 纯化：采用膜层联萃取、柱层析、电泳等方法对膜蛋白进行纯化。

4. 确认：通过蛋白质定量、SDS-PAGE、Western blot等方法验证膜蛋白的存在和纯度。

常见的膜蛋白提取方法有：
1. 酸性洗涤法：利用低pH值时，膜蛋白和膜脂亲性增强的特性，将细胞裂解物在酸性条件下洗涤获得膜蛋白。

2. 有机溶剂提取法：利用膜蛋白亲性较强的有机溶剂，如丙酮、甲醇等，将膜蛋白从细胞裂解物中提取出来。

3. 离心法：通过离心分离膜细胞，从而获得膜蛋白。

4. 免疫亲和层析法：利用特异性抗体将目标膜蛋白从混合蛋白中分离纯化。

以上方法的选择需根据具体情况来定，不同的细胞类型或膜蛋白性质有着不同的最佳提取方法。

蛋白提取方法

蛋白提取方法蛋白质是生物体内非常重要的一类大分子有机化合物，它们在生命体内扮演着极其重要的角色。

蛋白质的提取是生物化学和生物技术中的一个重要环节，对于研究蛋白质的结构和功能具有非常重要的意义。

本文将介绍一些常用的蛋白提取方法，希望能够对相关领域的研究者有所帮助。

1. 细胞破碎法。

细胞破碎法是蛋白质提取的常用方法之一。

其原理是通过机械、化学或生物学方法破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。

通常采用超声波破碎、高压破碎或冻融破碎等方法进行细胞破碎。

这种方法提取的蛋白质纯度较高，适用于大多数细胞类型。

2. 溶液抽提法。

溶液抽提法是利用有机溶剂或其混合物与细胞内的蛋白质发生亲和作用，从而将蛋白质从细胞中提取出来。

这种方法操作简单，但需要注意有机溶剂对蛋白质的特异性，以及对蛋白质的影响。

常用的有机溶剂包括醇类、酚类和酮类等。

3. 离心法。

离心法是利用不同蛋白质在离心力作用下沉降速度不同的原理，通过超速离心将蛋白质分离提取出来。

这种方法适用于提取大量蛋白质，但需要注意离心条件的选择和操作技巧。

4. 亲和层析法。

亲和层析法是利用蛋白质与特定配体之间的特异性结合来实现蛋白质的纯化和提取。

这种方法操作简单，且提取的蛋白质纯度较高，适用于对蛋白质纯度要求较高的实验。

5. 膜分离法。

膜分离法是利用蛋白质在膜上的分配系数不同，通过膜的渗透分离来实现蛋白质的提取。

这种方法操作简单，但需要注意膜的选择和渗透条件的控制。

总结。

蛋白质提取是生物化学和生物技术中的重要环节，不同的提取方法适用于不同的实验要求。

在实际操作中，需要根据实验的具体要求选择合适的蛋白提取方法，并注意操作技巧，以获得高质量的蛋白样品。

希望本文介绍的蛋白提取方法能够对相关领域的研究者有所帮助。

细胞蛋白提取的方法

细胞蛋白提取的方法
细胞蛋白提取是一种从细胞中分离出蛋白质的重要实验操作。

常用的细胞蛋白提取方法有以下几种：
1. 碱裂解法：将细胞用碱性溶液（如Tris-HCl）破碎，破坏细胞膜结构释放细胞内的蛋白质。

2. 高渗透法：通过增加高盐浓度或高甘油浓度的溶液来破坏细胞膜，使蛋白质释放到溶液中。

3. 离心法：将细胞用生理盐水或缓冲液洗涤后，利用离心的力将细胞沉淀下来，然后用溶液溶解细胞膜并释放蛋白质。

4. 超声法：利用超声波的机械作用力破碎细胞，将蛋白质释放到溶液中。

5. 高压法：利用高压力将细胞膜破裂，释放蛋白质。

6. 化学法：使用化学试剂破坏细胞膜结构，如氯仿、酚酸等。

7. 冻融法：通过冻结和解冻的循环操作破坏细胞膜，释放蛋白质。

以上方法根据实验需要和研究对象的不同，可以选择适合的一种或多种方法进行细胞蛋白提取。

细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取
细胞膜蛋白的提取可以通过以下步骤进行：
1. 细胞收集：从所需的细胞类型中收集足够数量的细胞。

可以使用细胞培养方法培养细胞，或者从活体组织中分离细胞。

2. 细胞破碎：将细胞用适当的方法破碎，以释放细胞内的蛋白。

可以使用机械方法（如超声波破碎器或高压细胞击碎器）或化学方法（如洗涤液或界面活性剂）来破碎细胞。

3. 蛋白质提取：使用适当的缓冲液或溶液将细胞破碎物悬浮并离心，以去除细胞碎片和细胞核。

随后，可以使用不同的方法来提取膜蛋白，例如溶解细胞膜并提取蛋白。

4. 蛋白质纯化：使用不同的技术来纯化细胞膜蛋白。

这包括以蛋白质的特定性质为基础的方法，例如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。

5. 蛋白质浓缩：将纯化的细胞膜蛋白浓缩到所需的浓度。

可以使用蛋白质浓缩技术，例如氨基酸纤维柱、浓缩管或旋转蒸发器等。

6. 蛋白质鉴定：利用蛋白质检测方法，如SDS-PAGE、Western blotting或质谱分析等，确定提取的蛋白质的纯度和数量。

细胞膜蛋白的提取过程需根据实验目的和具体需求来选择和优化各个步骤。

膜蛋白的提取与分离资料

膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介：1细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。

1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。

1935年Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。

1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+3.5(亮)+2（暗）=7.5细胞质膜的主要功能概括如下：(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2)选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3)提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4)为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5)介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。

(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。

(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。

获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。

附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用２－Ｄ技术也好，ＩＣＡＴ乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。

完整版膜蛋白提取

1别离组织膜蛋白的方法1、取组织,参加10ml Buffer A 于冰上充分匀浆.2、J6-HC离心机800rpm , 4 c离心10min后,所得上清液转入超速离心管.3、100000g , 4c离心1hr.弃去上清,沉淀用适量的Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装至EP 管, Eppendorf 台式离心机10000rpm , 4 c离心30min.4、收集所得上清液即为膜组份.Buffer A : 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl (PH 7.5), 120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B : 20mM HEPES (PH 7.5 ) , 10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.2取约0.1g肝组织,参加2ml粉碎缓冲液,冰浴中超声粉碎,每次20秒,间隔30秒,共3 次,4° c 105xg条件下离心2小时,上清液为胞浆蛋白,沉淀局部参加1ml胞膜蛋白提取液,超声粉碎,4.c 105xg条件下离心2小时,上清液为胞膜蛋白.样品蛋白含量测定采用酚试剂法.3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1.将细胞种于T75或T175的培养瓶中培养数天,细胞铺满瓶底后,吸去培养液.将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%) 参加量以覆盖细胞为止,置于培养箱或在超净台内消化3〜5分钟,如仍未脱落瓶底,用吸管吹打,使细胞完全脱落.2.收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中,1000rpm离心10分钟,去上清液.3. 按2.5毫升(T75 ) /每瓶或5毫升(T175/每瓶参加冰冷的匀浆液(HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM )于离心管中,将溶液和沉淀转移到匀浆器中,匀浆.4.将匀浆液转入离心管中, 参加适量的Tris - HCl (50mM, PH7.4)4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟.在沉淀中参加同前量的匀浆液,再匀浆,匀浆后参加适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心,共离心三次.5.在最后一次离心彳#到沉淀中按250微升每瓶(T75)或500微升每瓶(T175)参加tris-HClbuffer,匀浆,取50微升匀浆液测量蛋白浓度.6.按实验要求,将匀浆分装于1毫升的Eppendoff管中,其于-80oC冰箱中待用.主要基于膜蛋白分子量较大,在40000g时易沉降来别离.做膜蛋白的免疫荧光, 可以用荧光抗体染色, 然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察,具体的protocol可以找到,就不多说了.需要注意的是,要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域,如果是胞外,可以直接染色；如果在胞内,那么需要用无水甲醇在-20度处理10min,使细胞膜通透,然后再用抗体孵育,这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合. 一般对膜蛋白的提取都是采用梯度离心或者高速离心的方法别离,可是我们现有的离心机都无法到达所需要的转速,所以我们试着采用分布溶解分布沉淀的方法.1)预冷的pbs洗去组织血液,除去结缔组织、脂肪.2) 4 C剪碎,加bufferA玻璃匀浆器匀浆至无大块状物,10 C超声波10min ,重悬,再破碎5—10min.3)12000rpm 离心10min,沉淀用bufferB 重悬,20 C超声波10min.4)12000rpm 离心10min,沉淀用bufferC 抽提.5)12000rpm离心10min,所得上清含有9%的膜蛋白.6)12000rpm离心10min,沉淀加bufferD沸水煮5min , 12000rpm离心10min,上清含有1%的膜蛋白. bufferA: 40mM Tris basebufferB: 8M urea ,100mM DTT, 40mM Tris basebufferC: 6-7M urea, 0.2mmol/L PMSF,40mM Tris basebufferD: 1% SDS, 50mM DTT,25%Glycerol,in 0.4M Tris-HCl pH8.8我们做的是动物组织的膜蛋白,提出来电泳条带还可以,只是我们没有专一膜蛋白抗体来检测提出来的是否是膜蛋白.但是这个方法是可行的5三、蛋白提取操作步骤I实体组织蛋白的提取1、组织样本(200〜300mg)尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎；2、组织样本中参加1mL Lysis Buffer (注：使用前,每mL Lysis Buffer参加1科L蛋白酶抑制剂和1科L 1M DTT ),置玻璃均浆器冰上均质30〜50次(或超声破碎细胞, 每次30 S ,3〜4次,每次间隔1 min),置于冰上冷却.均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不小于90%;3、将均浆液转移至冷的离心管中,于4C, 3000 rpm离心10 min,弃沉淀；4、取上清转移至新冷离心管中,于4 C , 14 000 rpm离心30 min ,所得上清转至新管中, 即为胞浆蛋白,分装冷冻保存；5、取沉淀,参加1mL冷的抽提Buffer,涡旋振荡混匀后,4c放置10〜15min；【注：因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4c混匀后参加】6、4 ℃ , 3000rpm离心5min ,取上清转移至新管(注意勿将沉淀带入上清),进行下步提取;7、置于37 c水浴10min；8、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相. 上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到.或室温静置30分钟〜1小时亦可见分层.以下亦同.】9、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min； 10、置于37 c水浴10min； 11、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；12、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min；13、置于37 c水浴10min；14、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量〔因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值〕,分装冷冻保存.6用RIPA强配方,把脱氧胆酸钠浓度调整至1.0%,同时参加NP-40和Triton X-100 ,浓度均为1%.我刚做了一个7次跨膜蛋白,LHR的WB.7提取总蛋白的方法不能用于膜蛋白的提取, 提供一个常用的方法：先别离膜,在提取膜蛋白. 这类方法在园子里有不少介绍. 我们实验室曾经采用蔗糖梯度超速离心别离膜,据说效果还可以.您可以试一下.呵呵——8细胞破碎后,先低速离心,除去未破碎的细胞和大的细胞碎片.保存上清,超速离心,可获得细胞膜.然后用detergent溶液萃取,就可以得到膜蛋白溶液了.9我有新的问题了...哪位仁兄有好的提取细胞膜蛋白的裂解液配方...我的膜蛋白总提不出来.我的细胞是HEPG2;目的蛋白是LDL受体；我的配方是这样的：4%CHAPS , 8 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride但是总提不出来....急！ ! ! ! !呵呵,CHAPS提取膜蛋白水平较差,尝试参加1%ASB-14 ,或者参加1 % Triton X-100,与CHAPS联合抽提.另外最好参加2M thiourea.祝好运1.6% Triton X-100, 5 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride ;2M thiourea; thiourea很贵吗我现在没有,又要急着用,能不能不用thiourea??thiourea不是很贵,merck250g才300多rmb.电泳时可以考虑用ASB-14 , sb3-10.没有的话,提取最好加点NP-40, 2M thiourea还是要的,要是有TBP就更好了.NP lysis buffer.NP 配方,stock solution 20ml (50mM Tris-HCL (PH8.0), 5mMEDTA, 0.05%NaN3, 0.14M NaCL, 100mM NaF), 1% Nonidet P40, 0.2TIU/ml aprotinin, 1.5uM pepstatin A, 20mM Iodoacetamide.NP配好后分装,-80度保存.用之前,参加NaV和PMSF.混匀后立即置于冰上.10如果你研究的蛋白表达比拟丰富没有必要提取膜蛋白,直接用RIPA裂解液裂解后离心取可溶性蛋白变性做WB就可以了；如果你蛋白的含量低或抗体特异性很差的话,你应该用试剂盒或超速离心提取膜蛋白,可以起到富集和纯化的作用,使你更容易得到好的结果！11RAPI的裂解液只能说是强的非变性裂解液,而算不上是强的变性裂解液.提取膜蛋白一般都在变性条件下才可以.所以,你应该改用其他更适合的强的变性裂解液,如含SB3-10、DM、ASB-14等膜助溶剂,或者SDS-Bolied loading bufffer,2-D 裂解液7M thiourea+2M urea 也可以12组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行(1)取组织,用PBS冲洗干净组织上的血液.参加10ml Buffer A ,用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆.每次30秒,重复3-5次.(2)离心机1000rpm , 4 C离心10min后,所得上清液转入超速离心管.(去掉大块组织及结缔组织)(3)100000g, 4c离心1hr,弃去上清.(此为胞浆蛋白,假设只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4 度,30分钟离心,取上清即可).沉淀用适量的Buffer B重悬,4度过夜后,分装至EP管, Eppendorf 台式离心机10000rpm, 4 C 离心30min.(4)收集所得上清液即为膜组份.Buffer A :0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl (PH 7.5), 120mM KCl , 1mM EDTA, 1mM EGTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B 20mM HEPES (PH 7.5), 10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM , PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.所得蛋白分装EP管(每管约50ul),取一管测蛋白浓度,其它放入-70度深冻冰箱保存.如果要定量的话,最好能立即根据浓度,参加上样缓冲,煮沸, 4度保存.反复冻融蛋白会降解,浓度不准.13我用来抽提大鼠脑组织细胞膜蛋白方法：取两只大鼠的整个脑组织,参加10ml Buffer A 于冰上充分匀浆.J6-HC离心机800rpm , 4 C离心10min后,所得上清液转入超速离心管.100000g, 4c离心1hr.弃去上清,沉淀用适量的Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装至EP管,Eppendorf台式离心机10000rpm, 4 C 离心30min.所得上清液即为膜组份.Buffer A : 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl 〔PH 7.5〕,120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mMPMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B ： 20mM HEPES 〔PH 7.5〕, 10%甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.CHAPS〔一种离子去污剂〕是提取膜蛋白的常用试剂一般用10mMol的浓度即可,你可以试试加到你的Buffer中,看效果如何.不过此药品很贵！lysis buffer的选择依赖于你所研究蛋白质的位置和性质：1〕细胞浆蛋白〔可溶性〕：Tris Buffer2〕细胞浆蛋白〔结合到细胞骨架〕：Tris-Triton buffer3〕膜结合蛋白：Np-40或RIPA4〕核蛋白：RIPA5〕线粒体蛋白：特殊的抽提裂解液6〕全细胞蛋白：Np-40 or RIPAWestern blotAdipose tissue membrane protein was extracted from approx. 20mg of adipose tissue. PAGE was performed according to Laemmli [ 8]. A portion of 2 g of adipose t issue membrane protein was applied per lane. In addition, 10 q of mononuclear cell membrane protein 〔corresponding to 1.7 106 mononuclear cells〕 was applied and used as a positive control for verification of blotting, incubation and detection. Tank blotting to nitrocellulose was performed according to standard protocols, with transfer for 3h at 70V and 15 C.°The blots were incubated with 1 闵/ml rabbit anti-〔human b2-adrenoceptor〕 IgG 〔Santa Cruz Biotechnology Inc.〕, and were then re-incubated with alkaline phosphatase-labelled goat anti-rabbit antibody. Detection was performed using DDAO [9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl)] phosphate (Pro-Q Western Blot Stain Kit; Molecular Probes Inc.) on a Fujifilm FLA-3000 instrument.Quantification of b2-adrenoceptor protein was performed by determining the fluorescence intensity of b2-adrenoceptor-antibody-immunoreactive bands. The concentration of b2-adrenoceptor protein is expressed as the intensity of the immunoreactive bands of the tissue samples in relation to the intensity of the immunoreactive bands of the mononuclear cell membrane protein internal standard. Like others before us trying to isolate the b2-adrenoceptor [9], we observed several immunoreactive bands on our Western blots ( Figure 1). On all blots we found a single major band at 57kDa and several smaller immunoreactive bands (38-52kDa). Theb2-adrenoceptor is known to have a molecular mass of 64kDa and to be very fragile, so the immunoreactive bands on our blots must represent proteolytic degradation products and/or secondarily modified b2-adrenoceptor. When trying toquantify the receptor it is therefore uncertain whether to include all visible bands [total band area (T)] or to include only the single major band (S). We have done both. Figure 1 shows the area included in determining the intensity of the single major band and total band area intensity.All blots were loaded with the same amount of membrane protein per well, but since we wished to determine the level of protein expression in relation to individual cells, the concentration is expressed as intensity of b2-adrenoceptor protein per ng of DNA. The coefficient of variation based on 13 double determinations was 28% for total band area determinations and 29% for single major band determinations14凯基膜蛋白提取试剂盒凯基膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒一、描述：本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白.其原理是裂解细胞后,先离心别离出质膜粗提物,再利用特殊的抽提Buffer,选择性地别离提取膜蛋白,抽提Buffer含一种特殊的去污剂,在4c时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer,但在37c时,抽提Buffer分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中,根楣该性质别离出膜蛋白.产物不仅含细胞膜蛋白,也含胞器质膜蛋白.提取方法简单,可靠, 快速.获得的膜蛋白纯度高,可用于PAGE电泳、Western Blot、免疫共沉淀等后续研究. 二、试剂盒组份三、蛋白提取操作步骤I实体组织蛋白的提取1、组织样本〔200〜300mg〕尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎；2、组织样本中参加1mL Lysis Buffer 〔注：使用前,每mL Lysis Buffer参加1科L蛋白酶抑制剂和1 ^L 1M DTT 〕,置玻璃均浆器冰上均质30〜50次〔或超声破碎细胞,每次30 S ,3〜4次,每次间隔1 min〕,置于冰上冷却.均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不小于90%;3、将均浆液转移至冷的离心管中,于4C, 3000 rpm离心10 min,弃沉淀；4、取上清转移至新冷离心管中,于 4 C , 14 000 rpm离心30 min ,所得上清转至新管中, 即为胞浆蛋白,分装冷冻保存；5、取沉淀,参加1mL冷的抽提Buffer,涡旋振荡混匀后,4c放置10〜15min；【注：因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4c混匀后参加】6、4 ℃ , 3000rpm离心5min ,取上清转移至新管〔注意勿将沉淀带入上清〕,进行下步提取；7、置于37 c水浴10min；8、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相. 上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到.或室温静置30分钟〜1小时亦可见分层.以下亦同.】9、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min；10、置于37 c水浴10min；11、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；12、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min；13、置于37 c水浴10min；14、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量〔因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值〕,分装冷冻保存.四、SDS PAGE电泳操作步骤1、进彳T PAGE电泳前,取该提取物,每100 dL膜蛋白提取物,参加约300 dL的溶解Buffer 和约100 dL三氯乙酸〔TCA〕试剂, 混匀后置冰上20〜30 min后,13 000rpm ,离心15 min ,尽可能除去上清；2、沉淀参加1mL丙酮,室温静置10min后,13 000rpm离心15 min；3、弃上清,沉淀真空旋干或置冰上枯燥约10 min 〔敞开离心管盖〕,参加适当体积的LoadingBuffer 〔使用前每100 ^L Loading Buffer参加2〜5dL疏基乙醇〕溶解,彻底分散〔枪头反复吹吸或剧烈涡旋〕；【注：参加Loading Buffer后如有局部难溶物,可取上清继续上样；如参加Loading Buffer 后澳酚蓝转呈黄色,此为少量TCA残留所致,不影响电泳结果.请参照Marker标准.】4、上样进行SDS PAGE电泳.五、考前须知：1、所有的试剂及器具均需预冷后使用.细胞或组织量需到达要求.2、抽提Buffer 4 C时,为混悬状态,请于此温度下混匀后吸取参加粗提物中.3、室温25c〜37c时,抽提Buffer需静置30分钟以上可看到分上下两层,其中约9/10 至4/5为上层水相,下层只占1/10至1/5为有机相.4、因产品采用不透明的包装瓶,因此无法观察到上述分层现象,可将该BUFFER倒入玻璃烧杯或试管中静置30分钟〜1小时可见分层.5、TCA试剂具强腐蚀性,操作时请带适宜的手套并注意防护.六、储存蛋白酶抑制剂-200C, Loading Buffer室温保存,其余40C,保存一年。

Western Blotting(半干转) 超级详细步骤

Western Blotting Analysis Guide（半干转）Western blotting (半干转)可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A．总蛋白提取1. 将收集的细胞或组织(约0.1 g)从-80°C冰箱取出，按1:10 (w:v)加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA)；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2. 用Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3. 冰上静置20 min 后，12000 rpm 离心，4 °C，15 min，取上清。

B．核蛋白提取1. 称取100 mg 肝脏冰冻组织置于Dounce 手动匀浆器，加入1 mL 冰浴的核蛋白裂解液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2. 将匀浆液倒入1.5 mL 离心管，瞬时离心30 s3. 上清倒入另一1.5 mL 离心管，冰浴5 min4. 3000 rpm 离心，4 °C，10 min，上清倒入另一1.5 mL 离心管收集（此为胞浆蛋白）5. 沉淀加入50 μL 核蛋白裂解液B 吹打，冰浴20 min6. 12000 rpm 离心，4 °C，20 min，将上清吸入0.5 mL 离心管收集（此为核蛋白）。

二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

1．BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10 μL原标准品+ 40 μL PBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL的标准品：取5 μL上述1mg/mL的标准品+ 15 μL PBS缓冲液混匀，浓度为0.25 mg/mL样品用水以1– 5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。

跨膜蛋白的合成过程

跨膜蛋白的合成过程跨膜蛋白是一类具有重要生物学功能的蛋白质，它们存在于细胞膜上并负责许多重要的生理过程。

跨膜蛋白的合成过程是一个复杂而精密的过程，需要多种细胞器和分子的协同作用。

首先，跨膜蛋白的合成起始于细胞核。

在细胞核内，mRNA会被翻译成为蛋白质，这一过程称为蛋白质合成。

在蛋白质合成的过程中，mRNA上的密码子会被tRNA识别，并带来相应的氨基酸，从而将氨基酸依次连接成多肽链。

这个多肽链会不断延伸，直到达到特定的终止密码子。

在这个过程中，许多辅助蛋白和因子参与其中，确保蛋白质的正确合成。

随后，经过合成的多肽链会通过内质网膜上的核糖体复合体，进入内质网腔。

在内质网的腔内，多肽链将经历一系列后续修饰，包括糖基化、折叠和修正。

这些修饰过程可以确保蛋白质的正确折叠和功能性。

在一些情况下，蛋白质需要形成二聚体或多聚体结构，以发挥其功能。

接下来，已经修饰完成的跨膜蛋白将通过囊泡运输体系，被输送到细胞膜的特定区域。

在这一过程中，囊泡将蛋白质封装在囊泡膜内，并通过微管运输系统在细胞质中移动。

一旦囊泡到达细胞膜，它会与细胞膜融合，释放出跨膜蛋白到细胞膜上。

最终，跨膜蛋白会在细胞膜上形成特定的结构和功能。

一些跨膜蛋白可以作为受体，与外界信号分子结合并传递信号；一些跨膜蛋白则可以形成离子通道，调控离子的进出；还有一些跨膜蛋白参与细胞间的黏附和识别。

总的来说，跨膜蛋白的合成过程是一个复杂而精密的过程，需要多种细胞器和分子的协同作用。

只有当每一个步骤都正确进行，跨膜蛋白才能准确地合成并发挥其功能。

这一过程不仅揭示了细胞内蛋白质合成的机制，也为我们理解跨膜蛋白的生物学功能提供了重要线索。

细胞质膜蛋白提取方法

细胞质膜蛋白提取试剂盒
产品组成：
产品编号规格试剂 A 试剂 B 试剂 C
蛋白酶抑制剂混合物
BB-31161-1 50T 25ml 250ul 10ml 100ul
BB-31161-2 100T 50ml 500ul 20ml 200μl
产品简介：贝博质膜蛋白提取试剂盒提供配套试剂，适用于从细胞和动物组织提取细胞质膜蛋
BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3105 BB-3702
BCA 蛋白定量试剂盒蛋白 Marker 细菌膜蛋白提取试剂盒植物总蛋白提取试剂盒植物膜蛋白提取试剂盒蛋白酶抑制剂混合物磷酸酶抑制剂混合物 SDS-PAGE 上样 Buffer
白。提取过程简单方便，可在 1 小时内完成。
使用方法：
A．细胞质膜蛋白提取 1. 取 5-10×106 个以上细胞①，在 4℃，500g 条件下离心 2-3 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3. 细胞样品中加入 500μl 冷的试剂 A，5ul 试剂 B 和 2ul 蛋白酶抑制剂混合物，高
白约为 20-50μl。 6. 吸取上层部分留作备用分析③。 7. 用 50-200μl 冷的试剂 C 溶解下层膜蛋白部分，即得细胞质膜蛋白。 8. 将上述蛋白提取物定量④后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验⑤。
B．组织样本质膜蛋白提取 1. 取适量组织样本剪碎，加冷 PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置 5 分钟，小心将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。 2. 在 4℃，500g 条件下离心 2-3 分钟，弃上清。 3. 按照细胞质膜蛋白的提取方法的第 3 步骤往下操作即可。