细胞组织裂解(提蛋白)方法
蛋白质提取操作流程(细胞裂解)
蛋白质提取操作流程(细胞裂解)蛋白质提取操作流程（细胞裂解）
概述
细胞裂解是一种常用的方法，用于从生物样本中提取蛋白质。本文档介绍了蛋白质提取的操作流程。
材料
- 细胞样品
- 细胞裂解缓冲液
- 蛋白酶抑制剂
- 蛋白质稳定剂
- 超声波处理设备
- 冷冻离心机
步骤
1. 将冷冻的细胞样品取出并迅速转移到冰上。
2. 加入适量的细胞裂解缓冲液，并配制成细胞样品的适当浓度。
3. 加入蛋白酶抑制剂和蛋白质稳定剂，以保护蛋白质的完整性
和稳定性。
4. 将样品放入超声波处理设备中，进行超声波处理，用于破碎
细胞并释放蛋白质。
5. 将超声波处理后的样品置于冷冻离心机中，以去除细胞碎片
和残余的细胞组分。
6. 将离心后的上清液收集，并继续进行后续的蛋白质提取实验。
7. 根据实验需要可以进一步对蛋白质进行纯化、浓缩和分析等
处理。
注意事项
- 在细胞裂解过程中，应确保样品保持在低温环境下，以避免
蛋白质的降解和失活。
- 在超声波处理过程中，应注意操作时间和功率，以免对蛋白
质造成过度破坏。
- 细胞裂解缓冲液的选择应根据实验需求和细胞类型进行优化。
- 在蛋白质提取过程中，应避免受到外部污染和杂质的影响，
以保证提取到高质量的蛋白质样品。
总结
本文档介绍了蛋白质提取的操作流程，包括细胞裂解、超声波
处理和离心等步骤。正确的操作方法和注意事项对于获得高质量的
蛋白质样品至关重要。
蛋白提取步骤
提蛋白及WB的步骤
整个过程细胞或蛋白都必须放冰上
准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、
当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、
开低温高速离心机
细胞裂解液配制：
1ml cell lysis
10ul NP-40（离心机后）
25ul 焦磷酸钠
40ul NaF
1ul β-甘油磷酸
2 ul Na3VO4
1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱）
10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒）
细胞裂解和收集
1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左
右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。
2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。
3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往
上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。
细胞破碎
4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不
要碰到离心管的壁和底部）
超声波设置：
工作功率5% 工作时间3min
开机时间15s，关机时间30s
温度0度，
报警温度1度
5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，）
蛋白保存
6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度
组织蛋白提取步骤
组织蛋白提取步骤
概述
组织蛋白提取是一种重要的实验操作，用于研究生物体中的蛋白质组成和功能。在这篇文章中，我们将深入探讨组织蛋白提取的步骤和方法。
准备工作
在进行组织蛋白提取之前，需要进行一些准备工作，以确保实验的顺利进行。
1. 选择合适的组织样本
选择合适的组织样本非常重要。样本的选择应基于研究的目的和问题。常用的组织样本包括肝脏、肾脏、心脏等。
2. 通过冰冻保存样本
在进行组织蛋白提取之前，将组织样本冰冻以保持其蛋白质的完整性和稳定性。样本应在-80°C的低温下保存。
3. 研磨组织样本
在进行提取之前，将组织样本研磨以释放蛋白质。可以使用试管中的研磨棒、液氮或机械研磨仪等方法进行研磨。
组织蛋白提取步骤
下面将详细介绍组织蛋白提取的具体步骤。
1. 组织样本溶解
首先，将冷冻的组织样本迅速解冻放入冷蛋白提取缓冲液中。缓冲液的选择应根据研究的目的而定。可以选择含有各种缓冲剂（如Tris-HCl和EDTA）和蛋白酶抑制剂的缓冲液。
2. 组织样本裂解
接下来，需要将组织样本裂解，以使细胞膜破裂并释放细胞内容物。可以通过以下方法进行组织样本的裂解： - 超声波裂解：使用超声波处理器将样本暴露在高频
超声波中，以破裂细胞膜。 - 高压裂解：使用高压细胞破碎机将样本加压，使其
破裂。 - 液氮冻融：将样本在液氮中冷冻并迅速解冻，通过重复操作破裂细胞膜。
3. 蛋白质提取
在组织样本裂解后，可以使用离心等方法将细胞碎片与蛋白质分离。主要的提取方法包括： - 离心：将组织样本在高速离心中离心，并采集上清液中的蛋白质。 - 柱层析：利用蛋白质的性质，将蛋白质从样本中提取出来。 - 倒置电泳：利用电
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：
1、细胞总蛋白提取
A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:
a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：
A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
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4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：
1、细胞总蛋白提取
A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:
a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：
A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:
1、细胞总蛋白提取
A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高
蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：
a用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：
A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加
入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
蛋白提取步骤
蛋白提取步骤
准备裂解液、蛋白酶抑制剂。
1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制剂）
2、取0.1g组织，充分剪碎后加入研磨器中，加入适量液氮，将组织研成粉末状。
3、将研磨后的组织转至加有裂解液的2mlEP管中。
4、冰上超声（超声3s，停6s）共计20个循环，30%能量。
5、冰上静置30min，每10min震荡1次。
6、12000rpm，4℃离心30min。
7、收集上清，测浓度后-70℃保存。
8、煮蛋白时加5微升上样缓冲液。
2．培养的细胞（定量）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。3．组织：
⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
western蛋白提取步骤
蛋白提取方法
一、对于培养细胞样品：
1.融解 Western 及 IP 细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在
使用前数分钟内加入 PMSF，使 PMSF的最终浓度为 1mM。
2.对于贴壁细胞：去除培养液，用 PBS、生理盐水或无血清培养液
洗一遍 ( 如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗 ) 。按照 6 孔板每孔加
入100-200 微升（6cm培养皿 200-300ul ）裂解液的比例加入裂解液。
用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2
秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6 孔板每孔细胞加入 100-200 微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100 万细胞/ 管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
3.在冰上充分裂解20-30min 后， 10000-14000g 离心 3-5 分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操
作。
裂解液用量说明：通常 6 孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150 微升或 200微升。
二、对于组织样品：
1.把组织剪切成细小的碎片。
2.融解 Western 及 IP 细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 PMSF，使 PMSF的最终浓度为 1mM。
裂解液提蛋白说明书
RIPA裂解液(强)提蛋白(2007-07-18 11:31:26)
转载▼
对于培养细胞样品：
1. 融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每
孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞
就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用
手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
3. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
注：裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微
升或250微升。
对于组织样品：
1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度
的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
ripa蛋白提取方法
ripa蛋白提取方法
RIPA蛋白提取方法
引言
蛋白质是细胞中重要的分子组成部分，它们在细胞的结构和功能中发挥着关键作用。为了研究蛋白质的功能和相互作用，科学家们经常需要从细胞中提取蛋白质。RIPA（Radioimmunoprecipitation Assay）蛋白提取方法是一种常用的提取方法，本文将详细介绍该方法的步骤和注意事项。
材料和试剂
1. RIPA缓冲液：包含盐、洗涤剂和缓冲剂，用于细胞裂解和蛋白质溶解。
2. 蛋白酶抑制剂：用于保护蛋白质免受降解。
3. 磷酸盐缓冲液：用于洗涤和溶解蛋白质。
4. 加热样品缓冲液：用于处理蛋白质样品。
步骤
1. 收集细胞：将需要提取蛋白质的细胞收集到离心管中，可以通过离心将细胞沉淀下来。
2. 细胞裂解：向细胞中加入适量的RIPA缓冲液，使用离心机将细胞裂解开。
3. 离心：将裂解后的细胞上清液离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
4. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是含有
蛋白质的部分。
5. 添加蛋白酶抑制剂：在上清液中添加适量的蛋白酶抑制剂，以避免蛋白质的降解。
6. 震荡和冷藏：将上清液和蛋白酶抑制剂混合均匀，并在4摄氏度下冷藏片刻。
7. 离心：将上清液离心，以去除任何未溶解的细胞碎片或沉淀。
8. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是蛋白质的最终提取物。
9. 加热样品：将提取的蛋白质样品加入加热样品缓冲液中，进行蛋白质的加热处理。
注意事项
1. 所有的操作应该在冷藏条件下进行，以避免蛋白质的降解。
2. 所有使用的器皿和工具都应该事先冷藏，以保持低温状态。
5.提蛋白(胞浆蛋白)步骤
1、准备工作：照台子、预冷台面、预冷离心机，准备好PBS、细胞裂解液、PMSF，
准备好1.5EP管、离心管、离心管盖。
2、换好实验服，喷酒精，从培养箱中取出培养瓶（细胞量为1200万，共10ml），
观察长势，放入台子中。
3、轻轻晃动培养瓶（不要碰到其他壁面，因淋巴细胞培养的时候可能会还有其
他杂细胞，其他细胞可能会贴壁生长），用1000的枪吸取培养瓶内液体至离心管中。
4、离心（1500r/min，10min）分离细胞与培养液
5、弃上清，用1000ul的PBS洗沉淀，转移至1.5EP中
6、高速低温离心机，离心（600g，5min，4℃）洗净细胞
同时：将PMSF按终浓度为1mM加入到细胞裂解液中（1000ul的裂解液加10ul 的PMSF）
7、慢弃上清，按照比例加入含有PMSF的细胞裂解液（本次实验为1200万细胞
加500ul液体），轻弹使细胞充分裂解（无明显沉淀）
8、高速低温离心机离心分离，离心（12000g，5min，4℃）
9、吸取上清，即为所提取的蛋白，备用。
保存条件：-80℃
蛋白提取步骤
提蛋白及WB得步骤
整个过程细胞或蛋白都必须放冰上
准备工作：前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、
当天准备:洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记1、5ｍl 离心管及0、6ml离心
管、细胞刮板、开低温高速离心机
细胞裂解液配制:
1ml cｅll lysｉs
10ul NP-40（离心机后)
25uｌ焦磷酸钠
４0uｌNaF
１ul β-甘油磷酸
2 ul Na3VO4
1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱)
１0ul PＭSF(最后加，随加随用,有毒）
细胞裂解与收集
1.观察细胞状态,并准备提蛋白：吸走培养基、用ＰＢS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBＳ，左
右轻轻摇)，倾斜贴壁吸走ＰＢS。
2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐:一般1０6加0、1mｌ），冰上静置1-2
ｍｉn。
3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从
上往下全面刮，(刮得时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管.
细胞破碎
4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要
碰到离心管得壁与底部）
超声波设置:
工作功率5％工作时间3min
开机时间15ｓ,关机时间３０s
温度０度,
报警温度1度
5.４℃、1300０ｒ／ｍin,离心15min。(离心机用后一直保持打开得状态,）
蛋白保存
6.蛋白保存及分装:吸上清液至０、6ml离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。—80℃
保存。
注意事项：PＭSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30ｍin内就会降解一半.样品处理超过1ｈ，补加一次。
wb细胞蛋白提取步骤
wb细胞蛋白提取步骤
WB细胞蛋白提取步骤
引言：
WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，通过该技术可以检测特定蛋白质的存在与表达水平。而WB细胞蛋白提取是进行WB实验的关键步骤之一，本文将详细介绍WB细胞蛋白提取的步骤。
步骤一：细胞收集
需要从培养皿中收集目标细胞。将细胞培养液倒入50 mL离心管中，离心5分钟（1000 rpm），将上清液去除，留下沉淀的细胞。
步骤二：洗涤细胞
将细胞沉淀用无菌PBS洗涤3次，每次洗涤后离心5分钟（1000 rpm），去除上清液。
步骤三：细胞裂解
将洗涤后的细胞沉淀加入适量的细胞裂解液（如RIPA缓冲液），并加入蛋白酶抑制剂。用移液管反复吸取和排放细胞裂解液，使细胞完全裂解。将细胞裂解液放置在冰上浸泡20分钟，促使细胞内蛋白质释放。
步骤四：离心细胞裂解液
将细胞裂解液离心10分钟（12000 rpm），将上清液转移到新的离心管中，以避免沉淀物对后续实验的干扰。
步骤五：测定蛋白浓度
采用BCA方法或其他合适的蛋白浓度测定方法，测定细胞裂解液中的蛋白质浓度。
步骤六：蛋白样品制备
将细胞裂解液中的蛋白质与蛋白加载缓冲液按照一定比例混合，加入适量的蛋白酶抑制剂，并进行煮沸处理。煮沸处理的目的是使蛋白质变性，并使其在WB实验中得到更好的分离和检测。
步骤七：SDS-PAGE电泳
将蛋白样品加载到SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。可以根据需要选择合适的凝胶浓度和电泳条件，以获得最佳的蛋白分离效果。
步骤八：蛋白转膜
将电泳分离后的蛋白转移到聚合物膜（如PVDF膜）或硝酸纤维素膜上，可以使用湿法或半湿法转膜方法。转膜后，可以用荧光素或染色剂对膜进行染色，以观察蛋白质的迁移情况。
sdt裂解法
sdt裂解法
SDT裂解法是一种常用的细胞裂解方法，其主要步骤包括：
1. 取一定量的动物组织或细胞，加入适量的PBS溶液中，进行初步匀浆。
2. 加入SDT裂解液，将组织或细胞进一步裂解。
3. 将上一步中加入SDT裂解液的组织或细胞于4℃进行匀浆（60 Hz，20s）。
4. 进行低速短暂离心，将管壁液体离下。
5. 将离心后的管置于沸水浴（或100℃）中加热3min。
6. 再次使用探头超声：40-50W 超声5s，间隔5s，一共进行6个循环。SDT裂解法的优点在于操作简便，可以快速地获得高纯度的核酸或蛋白质。
细胞组织裂解（提蛋白）方法
细胞组织裂解（提蛋⽩）⽅法
第⼀种⽅法
蛋⽩匀浆缓冲液：
50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl
5 mM EDTA
1 % NP-40 1 mM PMSF
操作步骤
直接⽤这个进⾏组织匀浆
然后于10000 rpm 离⼼20分钟收集上清
作SDS－PAGE电泳从染⾊的情况来看所得到的总蛋⽩纯度都不错条带⽐较清晰。我是作的⼩⿏⼋种常规组织也包括肾脏在内。
将抽提好的蛋⽩分装后直接放在负⼋⼗保存。上样⼤概3~8ul每孔都可以的具体看个⼈需要。70v浓缩，150v分离
第⼆种⽅法
裂解液配⽅：
尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ ⽔操作步骤：
取300mg样品在液氮环境下研磨，
加⼊1ml裂解液混匀，
室温静置1⼩时（实验证明改为匀浆更好，蛋⽩降解轻），
15000g离⼼1⼩时，
取上清测定蛋⽩质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作⽤:1,增强蛋⽩质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋⽩质的难溶程度）。IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外⼀个作⽤是促进蛋⽩质溶解的,所以IEF前⼀定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？
（可以的，最后上胶条的时候可以再加）
不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离⼼⼀下，把⼀些结缔组织给离⼼掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋⽩的浓度。⽤这个⽅法最好经丙酮沉淀⼀次⽐较好）
细胞蛋白提取步骤
细胞蛋白提取步骤
细胞蛋白提取是为了获取细胞中的可溶性蛋白质，以进行后续的分析和研究。以下是一般的细胞蛋白提取步骤：
1. 细胞采集：选择需要提取蛋白的细胞种类，并通过离心等方法将细胞收集。
2. 细胞裂解：将细胞使用裂解缓冲液裂解，以释放细胞内的蛋白质。常见的裂解缓冲液包括RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
3. 超声处理：将细胞裂解液进行超声处理，以进一步破碎细胞结构，释放蛋白质。超声处理可以通过超声波清洗机或超声波细胞破碎仪进行。
4. 离心：将超声处理后的细胞裂解液进行离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
5. 收集上清液：将离心后的上清液转移至新的离心管中，作为细胞蛋白提取的样品。
6. 蛋白含量测定：使用蛋白含量测定方法（如BCA、Lowry 等）测定提取的蛋白质浓度，以便后续实验设计的参考。
细胞蛋白提取步骤可能因实验目的或细胞种类的不同而有所差异。在进行细胞蛋白提取之前，可以参考相关文献或实验方案，选择适合自己研究的步骤和试剂。
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第一种方法
蛋白匀浆缓冲液：
50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl
5 mM EDTA
1 % NP-40 1 mM PMSF
操作步骤
直接用这个进行组织匀浆
然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清
作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。
将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩，150v分离
第二种方法
裂解液配方：
尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤：
取300mg样品在液氮环境下研磨，
加入1ml裂解液混匀，
室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），
15000g离心1小时，
取上清测定蛋白质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以
除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？
（可以的，最后上胶条的时候可以再加）
不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）
第三种方法
建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热
做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul
测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。
培养细胞
细胞培养于100 mL/L FCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫
脲，40 g/LCHAPS，65 mmol/L DTT)，同时加入 1 mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsufosyl，PMSF)，旋涡振荡，反复液氮快速冻融4次，加DnaseⅠ50 mg/L和Rnase A 25 mg/L室温作用15 min，4°C 15 000 g离心1 h，收集上清液-80°C冻存备用，Bradford法测定蛋白浓度[17]．
第四种方法
哺乳动物组织一般采用机械分散法：
1 取脑组织称重，研钵预冷，边加液氮边研磨，至非常细小的干粉。
2 0℃PBS洗剂组织碎片，4℃3000g离心5分钟，估算离心管底部沉淀物的体积。
3 在5倍组织体积预冷的悬浮缓冲液中迅速用镊子分开或用剪刀剪碎组织碎片（最好加用蛋白酶抑制剂），大多数哺乳动物组织可以在悬浮缓冲液液面之下迅速用剪子分开或用用剪刀剪碎.
悬浮缓冲液：
0.1mol/L NaCl
0.01mol/L Tris Cl (PH 7.6)
0.001mol/L EDTA (PH8.0)
1ηg/ml Aprotinin
100ηg/ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）
4 尽快加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液。
5 样品置于沸水浴中加热10分钟。
6 采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切。以最大功率处理0.5—2分钟一般能有效将裂解液粘度降至可控水平。
7 室温10,000g将样品离心10分钟，取上清。
8 计算使用Western法检测靶蛋白所需样品量。在细胞总提取液中加入已知量的靶蛋白同时进行Western blotting检测，可为分析未知样品提供阳性对照，并可精确估计采用所选抗体时该法的灵敏度。
可否换成DNase 1 和RNase A? 可省去超声操作
我也是一名初学者，我将要做的是大鼠脑膜蛋白的抽提。我拿到的裂解液的配方如下:
1% SDS
40 mM Tris
65 mM DTT(现加）
ddH2O
而且在匀浆后，似乎还需要加入50ug/ml RNase和200ug/ml DNase,在4℃放置15min;1 5000离心1h.取上清。
我想请诸位高手指点一下，上面的配方和步骤中有无欠妥之处。谢谢！
你的配方较适合水溶性蛋白的提取。8M尿素的加入能使膜蛋白更多地溶解，现在很多文献提倡用7M尿素，2M硫脲提取膜蛋白。另外CHAPS、TritonX100、NP40等去垢剂的使用是否也要考虑？
还有提取蛋白以后的下一步将做什么也很重要，如果是做IEF则最好不要用SDS，这会影响等电点，如果还要做DIGE的话，在标记荧光以前不能加DTT，标好后可以加
1．IPG buffer是载体两性电解质
2．WB时loading buffer 里DTT和巯基乙醇的作用？
都是还原剂，防止二硫键形成
3．PAGE 上样buffer中为什么要加DTT？作用是什么？？
DTT能增加杂质的溶解，最主要的是DTT起还原剂的作用，用来打开肽内或肽间的二硫键，促进蛋白的完全溶解。还是加的好。
加入DTT可打开二硫键，基本成线性结构；非还原状态下，二硫键未被破坏，蛋白中由二硫键形成的双体（如抗体的轻重链）或二级结构不能打开，有时样品会出现沉淀现象。在进行WESTERN BLOT实验时，有的抗体识别非还原状态的条带，但不识别还原态下的蛋白条带，就是由于非还原状态下还保持了一定的空间表位，这在有些抗体的WB鉴定中很重要。所以你的SDS－PAGE是否加DTT还是取决于你实验的目的。
4．做SDS-PAGE 电泳前,一定要把原核表达后的蛋白煮沸几分钟吗
煮蛋白的作用是让蛋白充分变性，这样才能使蛋白在SDS-PAGE中完全靠分子量分离，测定的分子量准确性才高。
5. 怎样去除蛋白里的核酸？
去除核酸可以用酶法（DNase，RNase）、超声，建议使用超声。做WB什么的，抽提出的蛋白很粘稠就是因为有核酸，超声把核酸降解了就可以了。