动物固体组织蛋白提取-Protocol
蛋白质的十种提取方法
蛋白质的十种提取方法.txt大人物的悲哀在于他们需要不停地做出选择；而小人物的悲哀在于他们从来没有选择的机会。男人因沧桑而成熟，女人因成熟而沧桑。男人有了烟，有了酒，也就有了故事；女人有了钱，有了资色，也就有了悲剧。蛋白质提取方法-------列举10种方法
[ 来源：绿谷生物网点击数： 4587 更新时间： 2008年05月30日 ][ 收藏本文 ] 一、
植物组织蛋白质提取方法（summer）
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清夜，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
二、
植物组织蛋白质提取方法 (summer)
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空
干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小
生物化学实验 实验八 动物组织中DNA的提取
四、实验操作
动物生物化学实验
实验八 动物组织中DNA的提取
一、实验目的
1.学习从动物组织细胞中提取DNA的基Βιβλιοθήκη Baidu原理。 2. 掌握提取DNA的基本方法。
二、实验原理
细胞中的DNA和RNA通常和蛋白质结合
成脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白而存在。这
两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中，有不同 的溶解度。在稀盐溶液（0.15mol/L）中， 核糖核蛋白溶解度大，脱氧核糖核蛋白溶解 度小；而在高盐溶液中（ 1mol/L）中，脱氧 核糖核蛋白溶解度大，核糖核蛋白溶解度小。 利用此差异，可见两种核蛋白彼此分开。
分离到的脱氧核糖核蛋白，用十二 烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，让 DNA游离出来，再用氯仿-异戊醇混和 试剂沉淀除去变性的蛋白质。然后加入 95%乙醇，可将DNA沉淀析出。
为了防止DNA酶解，在提取过程中加柠 檬酸盐、EDTA盐并要求在40C以下进行，以 抑制DNA酶的活性。
三、实验试剂及器材
五、实验结果及分析
1. 将抽提的DNA交老师检查 2. 利用实验原理，说明提取过程中各步骤的目的
WB实验组织总蛋白提取方法
WB实验组织总蛋白提取方法
总蛋白提取是生物学实验中常用的一种方法，主要用于从细胞或组织
中提取所有蛋白质。提取总蛋白的目的是为了进一步分析蛋白质的功能和
结构，例如Western blot分析等。下面是一种常用的总蛋白提取方法。
实验材料和试剂：
1.已培养的细胞或组织样品
2. RIPA裂解液：含有非离子界面活性剂（Tween-20或Triton X-100）、蛋白酶抑制剂（如苯甲砜）和磷酸酯酶抑制剂（如磷酸酯酶）
3.低温高速离心管
4.超声波细胞破碎仪或机械研磨器
5.10%SDS-凝胶电泳试剂
6.蛋白加载缓冲液
7.高压电泳设备
实验步骤：
1.将细胞样品从培养皿中用PBS缓冲液洗涤一次，用PBS轻轻冲洗组
织样品。
2.吸去PBS缓冲液，加入足够的RIPA裂解液使细胞或组织完全浸没。注意：RIPA裂解液的加入量需根据样品的大小进行调整。
3.将细胞或组织样品转移到低温高速离心管中。
4.使用超声波仪器或机械研磨器对样品进行破碎。这一步旨在使细胞
或组织的细胞膜破裂，释放出胞浆中的蛋白质。
5.离心样品以除去细胞碎片和细胞核等大颗粒。将离心管置于低温离
心机中进行离心，离心条件需根据实验需要进行调整。
6. 将上清液转移至新的离心管中，得到总蛋白提取物。可以根据需
要进行蛋白质浓度的测定，常用的方法有BCA法、Lowry法等。
7.将总蛋白提取物加入相应的蛋白加载缓冲液，并在沸水中加热变性。
8.蛋白质经过热变性后，将其进行SDS-凝胶电泳分离。
9. 将凝胶中的蛋白质转移到PVDF或NC膜上，通过Western blot分
从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶的技术路线
从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶的技术路线
因为此酶含亚基，所以为蛋白质，故采用分离纯化蛋白质的方法进行操作
一、材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。
二、材料的预处理
1、细胞破碎
●机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。
➢使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或
研磨器械捣碎分散。
➢研磨法常用于微生物和植物组织细胞的破碎故本实验不采用。
●物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均可。
➢使用冻融法应注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的
变性失活。
➢使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行，或将样品置
于冰浴中，并采用问歇操作，如破碎30～60 s，间歇1 min，
如此反复进行。
●化学破碎法：常用的化学试剂有：①有机试剂（甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）；
②表面活性剂（Tween、特里顿（Triton）等）；③螯合剂（EDTA：乙二胺
四乙酸）等。他们都可以增加细胞膜的通透性，是酶容易释放。
●酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。
2、防止蛋白酶的水解作用：
●预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟
（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四
乙酸）
3、除核酸：
●一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，
沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、
溶菌酶等。
由此便制的酶制剂，可以进行提取、分离
三、酶的提取
提蛋白流程
提蛋白流程
提蛋白流程：
预处理：首先，根据实验需要，可能需要对细胞或组织进行清洗和破碎。
配制裂解液
裂解：将配制好的裂解液加入到细胞或组织样本中，轻轻摇动使裂解液与样本充分接触。然后，将样本在冰上进行裂解，时间根据具体情况而定。期间，可能需要用细胞刮铲和移液器将裂解产物与细胞碎片一起转移至离心管中，并定时震荡以充分裂解。
离心：裂解完成后，需要进行离心处理。
纯化与储存：根据实验需求，可能还需要对上清液进行进一步处理，如多次离心以去除杂质。最后，使用适当的方法（如BCA法）测定提取的蛋白浓度，并进行分装和储存。
全蛋白提取试剂盒
全蛋白提取试剂盒
Tissue or Cell Total Protein Extraction Kit
产品编号：C510003 包装规格：50 Assays 产品简介
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白，用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer 匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效,可以提取出培养细胞或动物组织中的决大多数蛋白质。获得的全蛋白可
用于Western Blot 、免疫共沉淀，酶活性分析，Pull down 和EMSA 等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀
的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂，可以每次从107
个培养细胞或200 mg 动物组织提取蛋白质，本试剂盒可以
使用50次。
产品特点 1. 提取的蛋白质包括膜,核,核基质和胞质蛋白,而且最大限度保持蛋白质活性 2. 整个操作过程只需要30分钟左右
3. 即可以用于培养细胞（50x107
个），有可以用于动物组织（50x200 mg ）蛋白质的提取 4. 避免蛋白酶和磷酸酶对蛋白质的降解，保持蛋白质的完整性和天然活性 5.
不需要超速度离心，可以同时处理多个样品
运输和保存条件
常温运输，收到后请将磷酸酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和PMSF 于 -20℃保存，其余2-8℃保存，保质期一年。 试剂盒组成 成分 C510003 Lysis buffer 50 mL 蛋白酶抑制剂 50 μL 磷酸酶抑制剂 250 μL PMSF
500 μL
操作步骤
A. 实体组织蛋白的提取 1. 在每1 mL 预冷的Lysis Buffer 加入5 μL 磷酸酶抑制剂,1 μL 蛋白酶抑制剂和10 μL PMSF 混匀。冰上保存数分钟待用。 2.
蛋白冻干粉的制备
蛋白冻干粉的制备
随着医学和生物技术的迅速发展，蛋白质制品在生产和研发中扮演
着越来越重要的角色。蛋白冻干粉是其中一种重要的蛋白质制品，可
以为各个领域的研究和应用提供有效的支持。蛋白冻干粉制备的过程
涉及到多个环节，由此可以分为以下几部分：
一、蛋白质提取
蛋白质提取是蛋白质冻干粉制备的首要环节。蛋白质的来源可以是动
物组织、植物组织或微生物等。其中，动物组织蛋白的提取主要经过
以下步骤：组织细胞破碎，去除细胞壁和细胞膜，沉淀蛋白质并进行
粗提，通过酸碱或趋近电泳等方法进行纯化。对于植物工程和微生物
工程等领域的蛋白质提取过程，也会有相应的差异。
二、溶解和稳定剂添加
蛋白质粗提后，需要进行溶解和稳定剂添加的工艺处理。通常情况下，蛋白溶液需要加入一定浓度的缓冲液，以稳定蛋白质的三维结构，并
防止蛋白质的降解、氧化和变性。此外，还需要加入一定浓度的凝聚
抑制剂和表面活性剂等，以帮助蛋白质在制备过程中不发生聚集、析
出或降解等现象。
三、通量和冷冻干燥
通量和冷冻干燥是蛋白冻干粉制备过程中的关键环节。干燥的速度必
须控制良好，以防止高热对蛋白质结构的损伤。因此，在干燥的过程中，需要对各个阶段的温度、压力、通量和速度等参数进行严密的控
制和监测，以确保最终的蛋白冻干粉质量。
四、粉末包装和储存
蛋白冻干粉需要通过特定的包装方式和方法进行储存，以确保其质量和稳定性。包装通常采用保护性包装材料，如铝袋、塑料容器或玻璃瓶。包装完成后，蛋白冻干粉需要在特定的环境下存放，包括在真空下、低温、干燥或无菌环境下存放，以确保蛋白冻干粉的长期储存和使用安全。
细胞和动物组织核蛋白的提取方法
细胞和动物组织核蛋白的提取方法
产品组成 310001 310002
规格 50 assays 100 assays
Buffer A (Cytoplasmic Extraction Reagent) 10ml 20ml
Buffer B (Nuclear Extraction Reagent) 10ml 20ml
蛋白酶抑制剂混合物 250ul 500ul
使用方法：
A．细胞蛋白提取
1. 取5-10×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 每20ul细胞压积中加入200μl冷的Buffer A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10分钟。
4. 再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，16000×g条件下离心5分钟。
5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
6. 在沉淀中加入200μl冷的Buffer B，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒。
7. 置冰上40分钟，每隔10分钟高速涡旋振荡15秒。
8. 在4℃，16000×g条件下离心10分钟。
9. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。B．组织蛋白提取
1. 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
2. 在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，弃上清。
实验三、动物组织DNA的提取
三．实验器材与试剂 1. 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L 柠檬酸钠溶液（ PH7.0 ） : 称取 8.77g 氯化 钠、4.41g柠檬酸钠，用蒸馏水溶解，调节pH值至7.0稀释至100ml。 2. 0.15mol/LNaCl-0.1mol/LEDTA-Na2 溶液（ PH8.0 ） : 称取 8.77g 氯化钠、 37.2g EDTA-Na2 溶于 800ml 蒸馏水中，以 0.1mol/L 氢氧化钠调至 PH8.0 ， 最后定容至1000ml。 3. 5mol/L 氯化钠：称取 292.2gNaCl 溶于 800ml 蒸馏水中，最后定容至 1000ml。 4. 5%SDS溶液：称取5gSDS，溶至100ml的45%乙醇中。 5. 氯仿-异戊醇溶液：按氯仿︓异戊醇=24︓1（V/V）配制。 6. 95%乙醇，75%乙醇。 7. 组织捣碎机（或玻璃匀浆器），移液管，离心机，锥形瓶，天平，容 量瓶，剪刀。
动物生物化学实验报告
——动物组
织DNA的提取Βιβλιοθήκη Baidu
班级：动科1143 姓名：李胜浩 学号：201411331312
一．实验目的 掌握从动物组织中分离DNA的基本原理和方法。 二．基本原理 DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白，能溶解在纯水或1mol/L 的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。2.在0.1mol/LNaCl溶液 中，DNA核蛋白的溶解度最小，仅为在纯水中的1%左右，而 RNA核蛋白的溶解度最大；但在1mol/LNaCl溶液中，DNA核蛋 白的溶解度却增大，至少是在纯水中的两倍，而RNA核蛋白 的溶解度却明显下降。3.分离得到DNA核蛋白后，应进一步 十二烷基硫酸钠使蛋白质变性，用含有异戊醇的氯仿除去变 性的蛋白质，以得到游离的DNA。4.DNA分子大而长，其水溶 液呈粘稠状，可用玻璃棒搅缠起来。为了获得大的DNA分子， 在试验中应尽量避免剧烈震荡、用力过猛。
动物组织块DNA的提取
【实验目的】
（1）学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
（2）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA样品。
【实验原理】
DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。
【仪器、材料、试剂】
（一）仪器
1．高速离心机
2．烘箱
3．冰箱
4．水浴锅
5．微量移液器
6．高压灭菌锅
（二）材料
1．生理盐水
2．十二烷基硫酸钠（SDS）
3．三羟甲基氨基甲烷（Tris）
4．乙二胺四乙酸（EDTA）
5．饱和酚
6．氯仿
7．异戊醇
8．无水乙醇
9．75%乙醇
10．蛋白酶K
11．RNase酶
12．手术剪刀、镊子、吸水纸
13．微量取液器
14．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔
（三）试剂配制
1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml
配制方法：
40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml 容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。
2．生理盐水: 0.85%NaCL 100ml
配制方法：
在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。
3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml
动物固体组织蛋白提取-Protocol
动物固体组织蛋白提取-Protocol
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动物固体组织蛋白提取 Protocol
1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也
可放入烤箱中，速度较快。
2、裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入4℃冰
上。
3、抽蛋白（应冰上进行）：
a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。
b、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力
动物固体组织蛋白提取_Protocol
动物固体组织蛋白提取 Protocol
1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也
可放入烤箱中，速度较快。
2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。置入4℃冰
上。
3、抽蛋白（应冰上进行）：
a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10ml 管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。
b 、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min 上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 c 、将组织匀浆转入1.5ml 的EP 管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心15min 。 d 、离心后EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP 管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。
wb组织蛋白提取方法
wb组织蛋白提取方法
WB组织蛋白提取方法
引言：
WB（Western Blotting）是一种常用的蛋白质检测方法，通过将待检测的蛋白质进行电泳分离，然后转移到膜上，再用特异性抗体进行检测。WB组织蛋白提取是进行WB实验的重要前提，正确的提取方法能够保证蛋白质的完整性和浓度，从而获得准确可靠的实验结果。
一、准备工作
1. 材料准备：组织样本、液氮、无菌离心管、摇床、离心机、清洗液（PBS）、RIPA裂解液、丙酮、蛋白酶抑制剂等。
2. 工具准备：离心管架、离心管盒、离心管架盖、冰桶、温度计等。
二、组织样本的采集和处理
1. 组织样本的采集：将所需的组织样本取出并迅速置于液氮中，确保样本冷冻速度快，避免蛋白质降解。
2. 组织样本的处理：将组织样本放入无菌离心管中，加入适量的PBS缓冲液，用摇床低速摇动几分钟使组织均匀悬浮。
三、组织样本的裂解和离心
1. 组织样本的裂解：将PBS悬浮液倒入离心管中，加入适量的RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，充分混合后放置冰上浸泡30分钟至1
小时，使细胞完全裂解释放蛋白质。
2. 组织样本的离心：将裂解液离心10分钟，离心速度为12000rpm，将上清液转移到新的离心管中，避免沉淀物的污染。
四、蛋白质的沉淀和洗涤
1. 蛋白质的沉淀：向上清液中加入4倍体积的丙酮，充分混合后放置-20℃冰箱中沉淀过夜，使蛋白质充分沉淀。
2. 蛋白质的洗涤：将离心管取出，离心10分钟，离心速度为12000rpm，将上清液倒掉，加入无菌PBS缓冲液洗涤2次，以去除丙酮等残留物。
五、蛋白质的溶解和浓度的测定
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法
一、原料选择和前处理
（一）原料的选择
早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理
1.细胞的破碎
材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
总蛋白提取方法(双向电泳用)
总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）
产品组成：
产品组成 BB-3181-1 BB-3181-2
规格 50 assays 100 assays
总蛋白提取液（2D） 25ml 50ml
蛋白酶抑制剂混合物 100ul 200ul
磷酸酶抑制剂混合物 100ul 200ul
使用说明书 1 1
储存条件：
蛋白酶抑制剂-20℃保存；
磷酸酶抑制剂2-8℃保存；
蛋白提取液室温保存。
有效期：
一年。
产品简介：
贝博总蛋白提取试剂盒（2D电泳用）适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取总蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒含有的独特配方能够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白直接用于双向电泳。
使用方法：
细胞总蛋白提取：
1.提取液制备：每500ul的总蛋白提取液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul
磷酸酶抑制剂混合物，混匀后备用。
2.取5-10×106个细胞①，在4℃，2500g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，
尽可能吸干，收集细胞。
3.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4.每5×106个细胞中加入500ul的总蛋白提取液，混匀后，振荡15-20分钟。
5.在14000g条件下离心15分钟。
6.将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
7.将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
蛋白质提取方法
蛋白质提取方法---- 列举10 种方法
一、植物组织蛋白质提取方法（summer ）
1、根据样品重量（1g 样品加入 3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4 C或11100rpm20min4 °C
4、提取上清夜，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl （PH8）45ml
2、甘油（Glycerol ）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone ）6g 这种方法针对SDS-PAGE ，垂直板电泳！
二、植物组织蛋白质提取方法（summer）
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20C的条件下过夜，然后离心（4C8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的3■巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15C 8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4C待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80 C备用。药品：
提取液：含10%TCA 和0.07%的3-巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,使用前再加入1M 的
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震荡 30S
6.停止震荡，在 37 度孵育样品 30min
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7.在酶标仪中测量 562nm 时的吸光值。
8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的
蛋白浓度。
三、实验结果
1 2 34 5 6 7
Com
msie 0.5 0.5 0.4 0.2 0.10.04 0.0
法吸 3 22 31 62 18 1 01
Commassie 法（Bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 G-250 结合，颜色从棕色变为蓝色，在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出 待测蛋白的浓度。 BCA 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 Cu++还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂形成紫色络合物，测定 其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比， 即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103） M231 BCA 蛋白定量试剂盒（AR0146）
最终蛋白浓度为：10*Y（ug/ul、 mg/ml） g、蛋白样本放-80℃冻存。
大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在 典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶 液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或
酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比 较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种 都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同 时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一 种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的 化学组成和检测的蛋白量。
d、离心后 EP 管中液体分三层，提取中间无色 液相，移入新的 EP 管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。 a、配工作液：溶液 A：溶液 B=50：1（200ul： 4ul）。
需测试复孔。标本 X，则需 A 量=2*（X+1+1） *200；B=2*（X+1+1）*4。
WT LOS T
c、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54ulH2O，混匀。即 10 倍稀释。 d、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平 底板内，再加入 200ulAB 工作液，混匀振荡后， 37℃ incubate 30min。 注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加 蛋白后需换 tip，再加入工作液即起反应，应缩 短时间。 e、酶标仪检测 562nm 吸光度。Program f、计算蛋白浓度。 根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中 Y： 蛋白浓度；X：吸光度。
Commassie 改良增强型蛋白质定量试剂盒 （AR0145）
二、操作步骤： Commassie 法： 1.将 BSA 冻干标准品（10mg/支）用生理盐水 或 PBS 稀释成 2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。 2.M231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。 3.各取 20ul 蛋白标准品和待测 M231 样品至 相应标记的微孔板中。 4.滴加 200ul 考马斯增强型试剂（溶液 A）至 每孔混匀并充分震荡 30S 5.停止震荡，在室温孵育样品 10min 6.在酶标仪中测量 595nm 时的吸光值。 7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的 蛋白浓度。 BCA 法： 1.按 50 体积 BCA 试剂 A 加入 1 倍体积 BCA 试剂 B 配置适量 BCA 工作液，充分混匀。 2.将 BSA 冻干标准品（10mg/支）用生理盐 水或 PBS 稀释成 2000ug/ml，1000 ug/ml,500
动物固体组织蛋白提取 -Protocol
动物固体组织蛋白提取 Protocol
1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75%乙醇中 浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也 可放入烤箱中，速度较快。
2、 裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配 现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入 4℃冰 上。
ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25
ug/ml,15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。
3.M231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
4.各取 20ul 蛋白标准品和待测 M231 样品至
相应标记的微孔板中。
5.滴加 200ulBCA 工作液至每孔混匀并充分
匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒， 连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织 等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超 声处理 30 秒使细胞破碎，也可用国产超声波发 生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～ 5 次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方 法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加 适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶 解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部 分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入 1.5ml 的 EP 管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心 15min。
3、抽蛋白（应冰上进行）： a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状） 加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒 磁 珠 、 100mg 组 织 、 1mlRIPA+10ulPMSF 、 1 tablet Cocktail。 b、匀浆。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再 将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在 烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆， 左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器 皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研 磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆 化。 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上 下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织