17动物组织蛋白提取
蛋白的分离提纯工艺
课程设计说明书课程名称：生物分离工程设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺院系：环境与化学工程学院学生姓名：***学号：41004020111专业班级：10级生物工程01班指导教师：***2013年6月20日目录1.设计任务书 (1)2.设计背景 (1)2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1)2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1)3.设计原理 (2)4.设计工艺流程及设计方案说明 (2)4.1对原材料的粗分级分离 (3)4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3)4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3)4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3)4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3)5.操作过程 (4)5.1蛋白质分离的准备阶段 (4)5.2细分级分离设备的设计 (4)5.3蛋白质的纯度鉴定 (8)6.参考文献 (8)7.课程设计心得 (9)1.设计任务书现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。
2.设计背景2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。
因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。
机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。
人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。
蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。
蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。
软骨蛋白提取步骤
软骨蛋白提取步骤软骨蛋白提取是一种常用的实验方法，用于从软骨中提取蛋白质。
软骨是一种坚韧的结缔组织，主要由软骨细胞和软骨基质组成。
软骨蛋白是软骨基质中的主要成分，具有重要的生物学功能。
本文将详细介绍软骨蛋白提取的步骤及相关实验注意事项。
实验材料准备在进行软骨蛋白提取实验之前，需要准备以下实验材料：1.软骨样本：可以使用动物软骨（如小鼠、大鼠等）或人类软骨（如关节软骨、鼻软骨等）作为实验样本。
软骨样本应新鲜，保存在-80摄氏度的冰箱中。
2.细胞裂解缓冲液：根据实验需要选择合适的细胞裂解缓冲液，常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液（PBS）、甘氨酸盐缓冲液（Tris-HCl）等。
3.细胞裂解酶：根据实验需要选择适合的细胞裂解酶，常用的酶有蛋白酶、核酸酶等。
4.蛋白质抽提试剂盒：根据实验需要选择适合的蛋白质抽提试剂盒，常用的试剂盒有RIPA缓冲液、细胞裂解液等。
5.离心管、离心机：用于离心样本以分离蛋白质。
6.电泳试剂：进行蛋白质分析时需要准备电泳试剂，包括凝胶、缓冲液、染色剂等。
实验步骤软骨蛋白提取的步骤主要包括软骨样本的处理、细胞裂解、蛋白质抽提和蛋白质分析等。
下面将详细介绍每个步骤的操作方法。
1.软骨样本的处理–将冰冻的软骨样本取出，放置在冰盒中解冻。
–使用去离子水或PBS缓冲液清洗软骨样本，去除表面的杂质。
–将软骨样本切割成小块，使其容易裂解和抽提蛋白质。
2.细胞裂解–将切割好的软骨样本置于细胞裂解缓冲液中，加入适量的细胞裂解酶。
–使用超声波仪器或研钵和研针进行细胞裂解，直至软骨样本完全裂解。
–将裂解后的混合液放置在冰上，以保持低温。
3.蛋白质抽提–使用离心机将裂解后的混合液进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等固体颗粒。
–取出上清液，加入蛋白质抽提试剂盒中提供的试剂，按照试剂盒说明书进行蛋白质抽提。
–使用离心机将抽提后的蛋白质样品进行离心，以去除残留的固体颗粒。
4.蛋白质分析–取出蛋白质样品，使用比色法或Western blot等方法进行蛋白质浓度的测定。
肝脏蛋白的提取和浓度测定.
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
为准
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法 BCA法 紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。
1.肝脏组织的提取
组织取材
操作 步骤
超声匀浆 冰上放置 4度离心
吸取上清
1.肝脏组织的提取
（1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取
（2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次管号 空白管标准管
试剂(ml)
0
1 234 5
1mg/mL牛血清
白蛋白溶液
蒸馏水 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
待测样品 – –
–
–––
考马斯亮蓝 5
5 5 55
5
G250
测定管 6
0 0 1 5
2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管
调零，测定各管吸光度值。
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常用培养基配方范文
常用培养基配方范文培养基（Culture medium）是一种用于细菌、真菌、植物细胞、动物细胞和其他微生物的繁殖和生长的营养物质。
常用的培养基可分为发酵培养基、微生物培养基和细胞培养基。
下面列举了一些常用的培养基配方。
1. LB培养基（Luria-Bertani medium）成分：-牛肉提取物：10克-酵母提取物：5克-热可溶性淀粉：10克-氯化钠：10克-水：1升2. NB培养基（Nutrient broth）成分：-牛肉提取物或肉蔻精：8克-酵母提取物：4克-葡萄糖：4克-水：1升3. MacConkey培养基成分：-水解动物蛋白：17克-中和胆盐：1.5克-中性红：0.03克-水：1升4. TSB培养基（Tryptic soy broth）成分：-大豆胨：17克-酵母提取物：3克-水：1升5. BHIA培养基（Brain Heart Infusion Agar）成分：-脑心汤固体：37克-水：1升6.R2A培养基成分：-水解酵母提取物：0.5克-蛋白胨：0.5克-葡萄糖：0.5克-脱脂乳粉：0.5克-黄豆粉：0.5克-高氯酸钠：0.3克-多聚体1466：0.05克-水：1000毫升7.比尔斯氏培养基（BHI培养基）成分：-大豆胨：37克-脑心汤固体：2克-水：1升8. 培养基199（Medium 199）成分：-高锰酸钾：0.015克-硫酸：1.55克-磷酸一氢钠：0.184克-高氯酸钠：8.0克-溴酚蓝：0.4克-d-葡萄糖：5.55克-l-谷氨酸：40.525克-苏打粉：0.84克-水：1升9. DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）成分：-苔藓胶原酸：1克-乳糖：1克- 谷氨酸：584mg- 水：1000ml这只是一小部分常见的培养基配方，实际上有很多种不同的培养基，它们根据不同的生物特性和培养需求来设计。
不同的培养基可以提供细菌、真菌、细胞等微生物生长需要的各种营养物质。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离与纯化蛋白质分离纯化的基本流程选择材料和预处理细胞的破碎及细胞器的分离蛋白质的抽提蛋白质的纯化浓缩浓缩、、干燥和保存一、材料的选择和预处理微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和脂肪组织。
对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
二、细胞的破碎（一）机械方法机械方法：：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
高速组织捣碎机高速组织捣碎机（（转速可达10000rpm ，具高速转动的锋利的刀片的刀片），），），适用于动物内脏组织的破碎适用于动物内脏组织的破碎适用于动物内脏组织的破碎。
玻璃匀浆器玻璃匀浆器（（用两个磨砂面相互摩擦用两个磨砂面相互摩擦，，将细胞磨碎将细胞磨碎），），），适适用于少量材料用于少量材料；；也可用不锈钢或硬质塑料等也可用不锈钢或硬质塑料等，，两面间隔只有十分之几毫米有十分之几毫米，，对细胞破碎程度比高速捣碎机高对细胞破碎程度比高速捣碎机高，，机械切力对分子破坏较小切力对分子破坏较小。
小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细石英砂及玻璃粉磨细。
（二）物理方法物理方法：：主要通过各种物理因素的作用主要通过各种物理因素的作用，，使组织细胞破碎。
反复冻融法反复冻融法：：将细胞在-20度以下冰冻度以下冰冻，，室温融解室温融解，，反复几次几次，，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀起溶胀，，使细胞结构破碎使细胞结构破碎。
超声波法超声波法：：用一定功率的超声波处理细胞悬液用一定功率的超声波处理细胞悬液，，使细胞急剧震荡破裂剧震荡破裂，，此法多适用于微生物材料此法多适用于微生物材料；；只要有设备只要有设备，，该法方便且效果也好法方便且效果也好，，但一次处理量较小但一次处理量较小。
蛋白质分离技术全
.
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几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
•
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4
95.3
103
Na2SO4 4.9 18.9
43.3
42.2
NaH2PO4 1.6
加入大量中性盐后夺走了水分子破坏了水加入大量中性盐后夺走了水分子破坏了水化膜暴露出疏水区域同时又中和了电荷化膜暴露出疏水区域同时又中和了电荷破坏了亲水溶胶蛋白质分子即聚集而形成沉破坏了亲水溶胶蛋白质分子即聚集而形成沉盐浓度saltingoutsaltingin等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质亲水胶体亲水胶体带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质亲水胶体亲水胶体脱水脱水脱水带负电荷蛋白质疏水胶体不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阳离子蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质亲水胶体亲水胶体水化膜带正电荷蛋白质疏水胶体水化膜中性盐的选择中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是常用的中性盐中最重要的是nhnh4422soso44为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或
SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞
膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
.
例如，胰岛素。
.
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4. 膜蛋白的提取
• 膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜 非常重要的生物学功能。
• 根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为 两大类型：外周膜蛋白和内在膜蛋白。 (1) 外周膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表 面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚 至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。 (2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂 (detergent)使膜溶解后才可分离出来。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
必刷17 动物生理实验的补充与完善-2023年高考生物总复习高频考点+常考题型必刷题(解析版)
必刷17 动物生理实验的补充与完善1．（2022·全国乙卷·高考真题）甲状腺激素在促进机体新陈代谢和生长发育过程中发挥重要作用。
为了研究动物体内甲状腺激素的合成和调节机制，某研究小组进行了下列相关实验。
实验一：将一定量的放射性碘溶液经腹腔注射到家兔体内，一定时间后测定家兔甲状腺的放射性强度。
实验二：给甲、乙、丙三组家兔分别经静脉注射一定量的生理盐水、甲状腺激素溶液、促甲状腺激素溶液。
一定时间后分别测定三组家兔血中甲状腺激素的含量，发现注射的甲状腺激素和促甲状腺激素都起到了相应的调节作用。
回答下列问题。
(1)实验一中，家兔甲状腺中检测到碘的放射性，出现这一现象的原因是______。
(2)根据实验二推测，丙组甲状腺激素的合成量______（填“大于”或“小于”）甲组。
乙组和丙组甲状腺激素的合成量______（填“相同”或“不相同”），原因是______。
【答案】(1)甲状腺吸收碘合成甲状腺激素(2)大于不相同乙组注射外源甲状腺激素，使甲状腺激素合成减少，丙组注射促甲状腺激素会促进甲状腺激素的合成【解析】下丘脑通过释放促甲状腺激素释放激素（TRH），来促进垂体合成和分泌促甲状腺激素（TSH），TSH可以促进甲状腺合成和释放甲状腺激素；当甲状腺激素达到一定浓度后，又会反馈给下丘脑和垂体，从而抑制两者的活动。
(1)碘是合成甲状腺激素的原料，将放射性碘溶液注射到兔体内，碘首先进入组织液，后进入血浆或淋巴运输到甲状腺滤泡上皮细胞被吸收，参与甲状腺激素的合成。
(2)甲组注射生理盐水，对甲状腺的活动没有明显的影响，甲状腺激素的合成与释放维持原来的水平；乙组注射外源甲状腺激素，使机体甲状腺激素含量超过正常水平，会反馈给下丘脑和垂体，从而抑制两者的活动，使机体甲状腺激素合成减少；丙组注射促甲状腺激素，可以促进甲状腺合成和分泌甲状腺激素，导致甲状腺激素合成增加，故三种情况下，丙组甲状腺激素的合成量大于甲组，乙组和丙组甲状腺激素的合成量不相同。
蛋白纯化技术路线
蛋白纯化技术路线
1.寻找来源：确定需要纯化的蛋白质所在的生物样品，可以是细胞提取物、细菌发酵液、动物组织等。
2.预处理：对样品进行预处理来去除非目标蛋白质和杂质，使目标蛋白更容易纯化。
常见的预处理方法包括超声破碎、离心、滤过等。
3.亲和层析：使用亲和层析柱选择性地结合目标蛋白质。
亲和层析柱可以根据目标蛋白质的性质选择，例如亲和剂可以是金属离子、抗体、某种结构域等。
目标蛋白质被结合到柱子上后，其他非目标蛋白质可以通过洗脱步骤洗脱下来。
4.尺寸排阻层析：利用蛋白质的分子量差异进行分离。
此步骤常用于去除亲和层析步骤中残留的杂质和非目标蛋白质。
5.离子交换层析：利用蛋白质在不同离子浓度条件下的电荷差异来实现分离。
在正负电荷基质之间的交换，可以根据蛋白质的电荷特性进行选择性结合和洗脱。
6.亲水性层析：利用蛋白质的亲水性差异进行分离。
亲水性层析可以通过调整盐浓度和pH值来选择性结合和洗脱目标蛋白质。
7.透析：用于去除层析步骤中使用的缓冲剂、杂质与目标蛋白之间的物质交换。
8.浓缩：用于将目标蛋白溶液浓缩至适当的浓度，以便于后续的研究操作。
9.纯化效果验证：使用蛋白质分析方法（如SDSPAGE、Westernblot等）来验证纯化的效果和目标蛋白质的纯度。
蛋白质分离策略
蛋白质分离方法摘要：本文介绍了蛋白质分离的一系列方法。
浸提，超声波破碎，研磨等原料预处理方法。
蛋白质粗提纯中的盐析，透析，超滤等方法。
层析法中的离子交换层析，凝胶层析，亲和层析用于蛋白质初提纯。
精提纯主要是使用电泳技术，如等电聚焦，DSD-PAGE，毛细管电泳，以及高效液相色谱法。
一、原料的预处理在对蛋白质分离前，首先要对所要分离的原料进行分析。
要根据分离纯化原料不同而采取不同的预处理方法。
如果是富蛋白，或者液体原料，如血清，蛋清，蛇毒，蝎毒等，无需进行原料预处理，直接进行蛋白质的粗提取和富集；如果是动物材料，如肉，表皮等，要去掉结缔和脂肪组织；对于植物组织和细菌要将细胞壁进行破壁处理。
对原料的预处理不仅要把蛋白质从原来组织中释放出来，而且要保持蛋白质原有的天然状态。
为了防止蛋白质变性，溶解蛋白质的溶液一般为蛋白质缓冲溶液，缓冲溶液主要有，NaAc-HAc[1]溶液，PBS-NaCl[2][3]，NaH2PO4-Na2HPO4[4]缓冲溶液，Tris-HCI缓冲溶液[5]，缓冲溶液不仅可以保持蛋白质活性，还可以作为浸提液提取蛋白质。
预处理的主要方法有浸提法，超声破碎法、研磨法、高压挤压法以及酶处理法[6]。
1.1浸提法浸提是最常用的一种溶解蛋白质的方法，主要原理是利用蛋白质在溶液中具有一定溶解度，溶解于溶液中，达到蛋白质与原料（通常是固体）的分离。
浸提液主要有，水，去离子水或超纯水，提取水溶性蛋白质；盐，一般是NaCl，提取盐溶性蛋白质：醇，如乙酸[7]，正丙醇，提取醇溶蛋白；弱酸，如乙酸[8]，弱酸性缓冲溶液，如PH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液，提取弱酸溶性蛋白质；弱碱，主要是碱NaOH[9]或弱碱性缓冲溶液，如PH8.5KH2PO4-Na2HPO4[10]，缓冲溶液，提取弱碱溶性蛋白质。
其他浸提液，如1.0mol/L盐酸胍与含有0.02%EDTA的MES溶液浸提鲨鱼软骨[11]。
新人教版 新高考 蛋白质练习
重温高考真题演练1．(2021·辽宁，1)蛋白质是生命活动的主要承担者。
下列有关叙述错误的是()A．叶绿体中存在催化ATP合成的蛋白质B．胰岛B细胞能分泌调节血糖的蛋白质C．唾液腺细胞能分泌水解淀粉的蛋白质D．线粒体膜上存在运输葡萄糖的蛋白质答案 D解析叶绿体类囊体薄膜是进行光合作用的场所，能合成ATP，则存在催化ATP合成的酶，其化学本质是蛋白质，A 正确；胰岛B细胞能分泌胰岛素，降低血糖，胰岛素的化学本质是蛋白质，B正确；唾液腺细胞能分泌唾液淀粉酶，唾液淀粉酶属于分泌蛋白，能水解淀粉，C正确；葡萄糖分解的场所在细胞质基质，线粒体膜上不存在运输葡萄糖的蛋白质，D错误。
2．(2018·江苏，5)哺乳动物的催产素具有催产和排乳的作用，加压素具有升高血压和减少排尿的作用。
两者结构简式如下图，各氨基酸残基用3个字母缩写表示。
下列叙述正确的是()A．两种激素都是由八肽环和三肽侧链构成的多肽类化合物B．氨基酸之间脱水缩合形成的水分子中氢全部来自氨基C．肽链中游离氨基的数目与参与构成肽链的氨基酸种类无关D．两种激素间因2个氨基酸种类不同导致生理功能不同答案 D解析分析题中激素的结构简式可知，激素中的环状肽都是由6个氨基酸构成的，故为六肽环，A错误；氨基酸脱水缩合形成的水分子中的氢分别来自氨基和羧基，B错误；肽链中游离氨基的数目与构成肽链的氨基酸R基上的氨基数目有关，C错误；分析题中激素的结构简式可知，两种激素间有2个氨基酸种类不同，故这两种激素生理功能不同是由这2个氨基酸种类不同导致的，D正确。
3．(2018·全国Ⅱ，1)下列关于人体中蛋白质功能的叙述，错误的是()A．浆细胞产生的抗体可结合相应的病毒抗原B．肌细胞中的某些蛋白质参与肌肉收缩的过程C．蛋白质结合Mg2＋形成的血红蛋白参与O2运输D．细胞核中某些蛋白质是染色体的重要组成成分答案 C解析浆细胞产生的抗体能与相应的抗原(如病毒抗原)发生特异性结合，A项正确；肌细胞中的肌动蛋白和肌球蛋白等参与肌肉收缩的过程，B项正确；Fe2＋参与构成血红蛋白，血红蛋白具有运输O2的功能，C项错误；细胞核中染色体的主要组成成分是蛋白质和DNA，D项正确。
细胞组织裂解（提蛋白）方法
细胞组织裂解（提蛋⽩）⽅法第⼀种⽅法蛋⽩匀浆缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl5 mM EDTA1 % NP-40 1 mM PMSF操作步骤直接⽤这个进⾏组织匀浆然后于10000 rpm 离⼼20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染⾊的情况来看所得到的总蛋⽩纯度都不错条带⽐较清晰。
我是作的⼩⿏⼋种常规组织也包括肾脏在内。
将抽提好的蛋⽩分装后直接放在负⼋⼗保存。
上样⼤概3~8ul每孔都可以的具体看个⼈需要。
70v浓缩，150v分离第⼆种⽅法裂解液配⽅：尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ ⽔操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加⼊1ml裂解液混匀，室温静置1⼩时（实验证明改为匀浆更好，蛋⽩降解轻），15000g离⼼1⼩时，取上清测定蛋⽩质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作⽤:1,增强蛋⽩质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。
建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋⽩质的难溶程度）。
IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外⼀个作⽤是促进蛋⽩质溶解的,所以IEF前⼀定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离⼼⼀下，把⼀些结缔组织给离⼼掉（150g既可）然后再加裂解液。
裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋⽩的浓度。
⽤这个⽅法最好经丙酮沉淀⼀次⽐较好）第三种⽅法建议最好加完裂解液后再⽤超声波破碎，我做肝脏蛋⽩提取时⼀般采取400W⼯作10秒，间歇10秒，次数15次，⼀次结束后⼤约30分钟再重复上述步骤⼀次（因为不同的样品⽤⼀根超声柱⼦，可能会导致污染，所以⼀定要⽤双蒸⽔冲洗⼲净，再⽤70%⼄醇洗⼀下，再⽤⽔洗⼀次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热做过的是⽤10ml蛋⽩裂解液来匀浆3克的组织，最终⽤考马斯亮兰染⾊法测得的蛋⽩浓度⼤概为30~50 ug/ul测595 OD值时，设定⼀个只⽤⽔的空⽩，把所有测得的值都减去这个空⽩。
基于IL-17
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2024.01.013·论著/中医中药与免疫·基于IL-17/NF-κB信号通路探讨敦煌医方大补脾汤联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠炎症免疫的影响曾元丁苏韫龚红霞牛世伟张晗（甘肃中医药大学基础医学院，甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，兰州 730000）中图分类号R285.5 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2024）01-0092-05［摘要］目的：研究敦煌医方大补脾汤对胃癌荷瘤小鼠的抑瘤作用以及基于IL-17/NF-κB信号通路探讨大补脾汤联合奥沙利铂对胃癌荷瘤小鼠炎症免疫的影响。
方法：建立MFC胃癌皮下荷瘤小鼠模型，随机分为模型组、奥沙利铂组、大补脾汤高、中、低剂量联合奥沙利铂组［21.58、10.79、5.40 g/（kg·d）］，每组10只，雌雄分笼饲养，接种8 d后开始给药，连续给药14 d；末次给药后次日眼球取血，处死小鼠，摘取肿瘤组织称重，计算抑瘤率；ELISA检测小鼠血清IL-17和IL-6含量，免疫组化（IHC）、RT-qPCR和Western blot分别检测小鼠肿瘤组织IL-17、IL-6、NF-κB和pNF-κB mRNA和蛋白表达。
结果：奥沙利铂组、大补脾汤高、中、低剂量联合奥沙利铂组抑瘤率分别为33.02%、52.92%、46.33%和39.52%，各给药组肿瘤质量均较模型组显著降低（P<0.01），大补脾汤高、中、低剂量联合奥沙利铂组显著高于奥沙利铂组（P<0.01）；与模型组相比，各给药组血清IL-17和IL-6含量、肿瘤组织IL-17、IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65 mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.01，P<0.05）；与奥沙利铂组相比，大补脾汤高、中剂量联合奥沙利铂组血清IL-17和IL-6含量、肿瘤组织IL-17、IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65 mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.01，P<0.05）。
蛋白制剂工艺研究报告
蛋白制剂工艺研究报告
蛋白制剂工艺是指将蛋白质从其天然来源提取、纯化、稳定并制备成药物形式的一系列过程。
蛋白制剂工艺的研究是为了提高蛋白质药物的纯度、活性和稳定性，以确保其安全有效地应用于临床。
首先，蛋白制剂工艺研究的第一步是蛋白质的提取。
蛋白质可以从天然来源如动物骨骼、细胞培养物和微生物培养物中提取。
其中，动物来源的蛋白质提取需要经过酸碱处理、离心、过滤和浓缩等步骤，而微生物来源的蛋白质提取则需要经过发酵和细胞培养等步骤。
通过提取步骤可以获得高纯度的蛋白质溶液。
其次，蛋白制剂工艺研究的第二步是蛋白质的纯化。
蛋白质溶液中常常含有其他杂质如核酸、脂质和碳水化合物等，这些杂质会影响蛋白质的活性和稳定性。
因此，需要通过离子交换、凝胶过滤和亲和层析等技术来去除杂质，并得到高纯度的蛋白质。
然后，蛋白制剂工艺研究的第三步是蛋白质的稳定性研究。
蛋白质在制剂过程中常常容易发生聚集、失活和降解等问题，从而影响其药效。
因此，需要进行各种条件下的稳定性研究，探索蛋白质的稳定性机制，并采取相应的措施来提高蛋白质的稳定性。
最后，蛋白制剂工艺研究的第四步是蛋白质的制备。
通过将蛋白质溶液进行冷冻干燥或喷雾干燥等技术，得到固体制剂或液体制剂。
这些制剂需要经过包装、标签和灭菌等步骤，以确保
其质量和安全性。
综上所述，蛋白制剂工艺的研究涉及提取、纯化、稳定和制备等多个环节。
通过对这些环节的研究，可以优化蛋白制剂工艺，提高蛋白质药物的质量和效果，为临床应用提供可靠的保障。
【国家自然科学基金】_总蛋白提取_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
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胆结石 1 胆汁 1 肾小球系膜细胞 1 肺肿瘤 1 肺 1 股骨头坏死 1 肝风内动证 1 肝炎病毒 1 肝炎,丙型 1 肛门,畸形 1 结肠肿瘤 1 细胞增殖 1 细胞培养 1 细胞周期 1 突变体 1 硫氧环蛋白过氧化物酶(tpx) 1 硒蛋白 1 破骨细胞 1 矿化 1 睾丸 1 直肠,畸形 1 瘦素 1 烧伤 1 炎症 1 滋养细胞疾病 1 氨基酸 1 氡 1 毛乳头细胞 1 板栗疫病菌 1 晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病 1 日本血吸虫 1 旋覆花内酯 1 整合素类 1 放射治疗 1 提取工艺 1 成骨细胞 1 成纤维生长因子受体 1 感觉神经 1 富硒绿茶 1 定点突变 1 增殖 1 基质辅助激光解吸飞行时间质谱法1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 1 基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱 1 基因表达 1 基因,调节 1 基因,ndrg2 1 基因 1 坐骨神经 1 地中海贫血 1 吸烟 1 吡喹酮 1 受体,表皮生长因子 1 发动蛋白 1
科研热词 双向电泳 蛋白质组 蛋白质组学 大鼠 凋亡 表达 脓毒症 细粒棘球绦虫 电泳,凝胶,双向 烧伤 淋巴细胞 成纤维样滑膜细胞 增殖 基因克隆 叶片 原核表达 黄鳝 骨髓间充质干细胞 骨质疏松/免疫学 骨组织 骨形态发生蛋白 香蕉 雪旺细胞 间质干细胞 铜绿假单胞菌 钙结合蛋白 钉螺 重组质粒pgex-eg95-ega31 重组质粒pgex-eg95 酵母双杂交 酚抽法 逆转录聚合酶链反应 转染 质谱鉴定 质膜蛋白质组 评价研究 角质形成细胞 西维来司钠 表面加强激光解析电离飞行时间质谱 血红素氧化酶-1 血管内皮生长因子 蛋白酶体 蛋白质组分 蛋白质提取 蛋白质 蛋白提取 蛋白印迹法 葡萄球菌,金黄色 花蕾 花药 芜菁 自噬
提取物 标准
提取物标准提取物是指从天然植物、动物或微生物中提取出的具有生物活性、药理活性或化学活性的物质。
在医药、食品、化妆品等领域，提取物被广泛应用于药物研发、保健品生产、化妆品配方等方面。
为了确保提取物的质量和安全性，制定了一系列的提取物标准，以规范提取物的生产和使用，保障人们的健康和安全。
一、提取物的来源。
提取物的来源多种多样，可以来自于植物、动物或微生物。
植物提取物主要通过水蒸馏、溶剂提取、超临界流体萃取等方法获取，如中草药提取物、植物精油等；动物提取物则包括动物组织提取、动物器官提取、动物细胞提取等，如动物肝提取物、鱼胶原蛋白提取物等；微生物提取物则是从微生物发酵产物中提取得到，如酵母提取物、微生物菌种提取物等。
二、提取物标准的制定。
针对不同类型的提取物，制定了相应的提取物标准，以确保提取物的质量和安全性。
提取物标准主要包括以下几个方面：1. 成分含量标准，规定了提取物中各种活性成分的含量范围，以保证提取物的药理活性或化学活性。
2. 检测方法标准，规定了提取物中各种成分的检测方法和检测指标，以确保提取物的成分含量符合标准要求。
3. 重金属和有害物质限量标准，规定了提取物中重金属、农药残留、微生物污染等有害物质的限量标准，以保证提取物的安全性。
4. 生产工艺标准，规定了提取物的生产工艺，包括提取方法、提取温度、提取时间等，以确保提取物的质量稳定性。
5. 储存和包装标准，规定了提取物的储存条件和包装要求，以确保提取物在储存和运输过程中不受污染和变质。
三、提取物标准的意义。
提取物标准的制定和执行对于保障人们的健康和安全具有重要意义：1. 保证提取物的质量，通过制定严格的成分含量标准和检测方法标准，可以保证提取物的质量稳定，有效成分含量符合标准要求。
2. 保障提取物的安全性，通过限制重金属和有害物质的含量，可以保证提取物的安全性，避免对人体造成不良影响。
3. 规范提取物生产和使用，通过规定生产工艺标准、储存和包装标准，可以规范提取物的生产和使用，减少质量问题和安全隐患。
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1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。
2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。
3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。
1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。
2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。
3、10,000×g 离心15分钟。
4、收集上清，进行下一步的实验。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。
①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。
洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer
中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。
混匀后冰上保存数分钟待用。
③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。
200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。
④4℃摇床，温和振摇15分钟。
⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。
⑥BCA法测蛋白浓度。
蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。
细胞提取步骤
1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。
2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。
3. 4℃摇床，温和振摇30min。
4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物
5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
注意：提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。