动物组织蛋白质提纯方法的研究进展
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
小肽在畜禽中的应用研究进展
小肽在畜禽中的应用研究进展许多研究表明，蛋白质在肠道中并非全部水解为游离氨基酸，有很大一部分分解为小肽(一般认为是二肽、三肽)，大部分二肽，少量三肽原样转运进入细胞，而大部分三肽，几乎全部三肽以上的寡肽经小肠粘膜刷状缘肽酶水解后，以自由氨基酸的形式吸收和转运。
Newwy等(1960)首先为小肽能被完整地吸收提供了证据；Hara等(1984)在小肠粘膜上发现了小肽载体。
之后，小肽的I型载体(Fei等，1994)和H型载体(Adibi，1996)分别被克隆。
至今，小肽能被完整吸收的观点才为人们所接受。
小肽(二肽、三肽)作为蛋白质的主要消化产物，在氨基酸消化、吸收和代谢中起着重要作用。
1小肽的营养作用1．1提高蛋白质合成试验证明，循环中的小肽能直接参与组织蛋白质的合成。
大鼠肌细胞、牛乳腺表皮细胞(Pan等，1996)以及羊肌源性卫星细胞(Pan等，1998)均能有效利用含蛋氨酸的小肽作为氨基酸的来源，用于合成蛋白质和细胞增殖。
此外，肝脏、肾脏、皮肤和其他组织也能完整地利用小肽(Backwell等， 1996； Hubl等， 1994；Pierzvnowski等，1997)，其中肾脏是消化循环肽和再捕获氨基酸的主要场所(Adibi，1997)o很多试验表明，以小肽形式提供部分或全部氮源时，蛋白质沉积效率高于相应的合成氨基酸日粮与完整蛋白质日粮(Boza等，1995；Backwell， 1994； Monch和Rerat， 1993；Layante，1992； Infante， 1992；Zaloga， 1991； RuUain，1989)。
乐国伟(1996)观察到，雏鸡在灌注酪蛋白水解产物小肽后，组织蛋白质合成率显著高于相应游离氨基酸混合组。
肌肉蛋白质的合成率与其动静脉氨基酸差存在相关性(Boisclair，1993)。
在吸收状态下，动静脉差值越大，蛋白质的合成率越高。
由于小肽吸收迅速、吸收峰高的原因，能快速提高动静脉的氨基酸差值，从而提高整个蛋白质的合成。
蛋白质提取与纯化技术
蛋⽩质提取与纯化技术蛋⽩质提取与纯化技术选择材料及预处理以蛋⽩质和结构与功能为基础，从分⼦⽔平上认识⽣命现象，已经成为现代⽣物学发展的主要⽅向，研究蛋⽩质，⾸先要得到⾼度纯化并具有⽣物活性的⽬的物质。
蛋⽩质的制备⼯作涉及物理、化学和⽣物等各⽅⾯知识，但基本原理不外乎两⽅⾯。
⼀是得⽤混合物中⼏个组分分配率的差别，把它们分配到可⽤机械⽅法分离的两个或⼏个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；⼆是将混合物置于单⼀物相中，通过物理⼒场的作⽤使各组分分配于来同区域⽽达到分离⽬的，如电泳，超速离⼼，超滤等。
在所有这些⽅法的应⽤中必须注意保存⽣物⼤分⼦的完整性，防⽌酸、硷、⾼温，剧烈机械作⽤⽽导致所提物质⽣物活性的丧失。
蛋⽩质的制备⼀般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、⼲燥和保存。
微⽣物、植物和动物都可做为制备蛋⽩质的原材料，所选⽤的材料主要依据实验⽬的来确定。
对于微⽣物，应注意它的⽣长期，在微⽣物的对数⽣长期，酶和核酸的含量较⾼，可以获得⾼产量，以微⽣物为材料时有两种情况：（1）得⽤微⽣物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利⽤菌体含有的⽣化物质，如蛋⽩质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和⽣长发育状况不同，其中所含⽣物⼤分⼦的量变化很⼤，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进⾏绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不⽴即进⾏实验，应冷冻保存，对于易分解的⽣物⼤分⼦应选⽤新鲜材料制备。
蛋⽩质的分离纯化⼀，蛋⽩质（包括酶）的提取⼤部分蛋⽩质都可溶于⽔、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋⽩质则溶于⼄醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采⽤不同溶剂提取分离和纯化蛋⽩质及酶。
（⼀）⽔溶液提取法稀盐和缓冲系统的⽔溶液对蛋⽩质稳定性好、溶解度⼤、是提取蛋⽩质最常⽤的溶剂，通常⽤量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋⽩质的溶解。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离与纯化蛋白质分离纯化的基本流程选择材料和预处理细胞的破碎及细胞器的分离蛋白质的抽提蛋白质的纯化浓缩浓缩、、干燥和保存一、材料的选择和预处理微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和脂肪组织。
对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
二、细胞的破碎（一）机械方法机械方法：：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
高速组织捣碎机高速组织捣碎机（（转速可达10000rpm ，具高速转动的锋利的刀片的刀片），），），适用于动物内脏组织的破碎适用于动物内脏组织的破碎适用于动物内脏组织的破碎。
玻璃匀浆器玻璃匀浆器（（用两个磨砂面相互摩擦用两个磨砂面相互摩擦，，将细胞磨碎将细胞磨碎），），），适适用于少量材料用于少量材料；；也可用不锈钢或硬质塑料等也可用不锈钢或硬质塑料等，，两面间隔只有十分之几毫米有十分之几毫米，，对细胞破碎程度比高速捣碎机高对细胞破碎程度比高速捣碎机高，，机械切力对分子破坏较小切力对分子破坏较小。
小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细石英砂及玻璃粉磨细。
（二）物理方法物理方法：：主要通过各种物理因素的作用主要通过各种物理因素的作用，，使组织细胞破碎。
反复冻融法反复冻融法：：将细胞在-20度以下冰冻度以下冰冻，，室温融解室温融解，，反复几次几次，，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀起溶胀，，使细胞结构破碎使细胞结构破碎。
超声波法超声波法：：用一定功率的超声波处理细胞悬液用一定功率的超声波处理细胞悬液，，使细胞急剧震荡破裂剧震荡破裂，，此法多适用于微生物材料此法多适用于微生物材料；；只要有设备只要有设备，，该法方便且效果也好法方便且效果也好，，但一次处理量较小但一次处理量较小。
微生物发酵生产蛋白质与多肽的研究进展
微生物发酵生产蛋白质与多肽的研究进展摘要:微生物发酵、基因工程等相关技术的发展，激发了科研机构和个人对蛋白质和多肽的研究。
微生物发酵工艺在生产取得惊人的效益。
本文对近年来微生物发酵生产蛋白质和多肽，原料资源的开发与应用、生产技术和微生态制剂等产品研究成果及发展进行总结与分析。
关键词：微生物、发酵、多肽、蛋白质前景：随着技术的发展和社会需求的增长,近代生物工业已由糖分解生产简单化合物转入复合化合物的生物合成阶段.近代人生物工业发展规模的日益扩大,面临自然资源的匮乏问题,迫切需要开辟原料新资源,利用纤维、石油甚至空气等资源代粮发酵生产各种产品取得了成功。
这一研究进展改变了发酵工艺对原料依赖。
而且，微生物发酵技术生产的啤酒、酱油、酒精、青霉素、蛋白酶、干扰素、白介素、单细胞蛋白等产品已经深入到国民经济各个部门。
随着对纤维素水解研究的深入，人们发现取之不尽的纤维素资源代替粮食发酵生产各种产品和能源物质取得了成功。
研究表明，有些细菌可以固定大气中的氮、碳、空气来生产来生产蛋白质。
这些研究对于开辟人类未来粮食新资源有重要意义。
可以说，，微生物发酵技术有着广阔的发展前景，是具有生命力的既古老而又年轻的工艺。
1 微生物发酵生产多肽及蛋白质的获取微生物发酵生产多肽及蛋白质是利用微生物的生化代谢反应将植物体或动物组织中的大分子蛋白转化成小分子蛋白活性肽或小分子蛋白质，并通过微生物的代谢和发酵条件生产各种氨基酸排序和分子质量大小不同的生物活性肽及蛋白质。
2 微生物发酵生产多肽及蛋白质的应用多肽现已广泛应用于医药、化妆品、食品等行业。
2.1 微生物发酵生产蛋白质的应用通过发酵可获得大量的微生物菌体──单细胞蛋白。
单细胞蛋白食品具有高蛋白、低脂肪等优点。
功能肽除了具有一般蛋白质的营养作用外，对人体还具有非常重要的不可替代的调节作用，这种作用几乎涉及到人体的所有生理活动。
研究发现，一些调节人体生理机能肽的缺乏，会导致人体机能的转变。
畜禽类骨胶原蛋白及其肽的研究进展
2.1化学水解法
化学水解法主要是酸法和碱法。其原理是加入 适当浓度的强酸或强碱溶液破坏蛋白质的肽键，在 水浴条件下反应一定时间后终止反应，分离纯化后 可得机构较为完整的胶原蛋白。化学水解法操作简 单,成本低，同时亦有如水解程度不好控制、容易损
刘丽莉⑴］(2017)等将前期分离纯化得到的具有特 异性降解牛骨胶原蛋白的胶原蛋白酶作用于牛骨胶
原蛋白，最佳酶解工艺得到的水解度为34. 98% ；酶 解法还可使用多种不同的酶对畜禽类骨头进行复合
水解，以获得更好的提取效果。王锤慧［141 (2016)等 利用复合蛋白酶和风味蛋白酶双酶以同步水解和顺 序水解的方式水解羊骨粉，发现2种酶的同步水解 效果好于顺序水解，双酶同步的水解度可达
膜电位,降低骨细胞凋亡率，抵抗cd-诱发的骨质疏 松症，作为预防骨质疏松症的功能性食品具有一定 的应用潜力。
此外，有不少研究通过去卵巢大鼠模型研究胶 原肽的骨质改善功能,发现服用畜禽骨胶原肽大鼠 的骨密度、骨微结构和骨代谢水平均有一定改善,抑 制骨矿物质和骨有机质的丢失，说明畜禽骨胶原蛋 白肽能够有效改善去卵巢大鼠骨质疏松症状⑶皿］。
Key words livestock and poultry； bone； collagen peptide
1概述
胶原蛋白是一种纤维蛋白，是大部分动物体内 含量最丰富、分布最广的功能性蛋白,也是细胞外基 质的主要结构蛋白，主要存在于动物的骨、皮、血管、 角膜等其中，是人体中结缔组织最主要的构成物 质⑴。胶原蛋白的生理功能和生物活性十分丰富, 其含量和质量对人的身体健康状况影响极大。通过 适宜的条件对大分子的胶原蛋白进行水解，生成小 分子的肽，其既含有胶原蛋白全部的氨基酸，又具有 比胶原蛋白更好的吸收性和加工特性，更容易被人 体吸收利用。近年来，从胶原肽中分离鉴定出多种 具有调节生理功能作用的生物活性肽⑵，如抗氧化
胶原蛋白的提取、性质及其应用的研究进展
doi:10.16736/41-1434/ts.2021.16.012
胶原蛋白的提取、性质及其应用的研究进展
Research Progress in Extraction, Properties and Application of Collagen
关键词：胶原蛋白；提取工艺；性质；应用 Abstract：In recent years, the demand for collagen in the food and biopharmaceutical industries has continued to grow, and its research and application have attracted widespread attention. The main sources of collagen include mammals and aquatic animals. However, there are differences in the preparation of collagen from different sources, which in turn affects the properties of collagen, and ultimately leads to different application fields of collagen. This article summarizes the factors affecting the extraction, properties and applications of collagen, in order to have a more comprehensive and in-depth understanding of collagen, and explore the wider application of collagen in the future. Keywords：collagen; extraction process; properties; application 中图分类号：TQ936.2
鱼鳞胶原蛋白提取工艺的研究现状及应用
鱼鳞胶原蛋白提取工艺的研究现状及应用摘要：简述了胶原蛋白的作用，提取鱼鳞胶原蛋白的重要性，结合鱼鳞胶原蛋白研发的相关背景和现状,列举了鱼鳞胶原蛋白的多种提取方法，简述鱼鳞胶原蛋白的应用。
关键词：鱼鳞；胶原蛋白；提取方法；应用1 前言胶原蛋白在鱼类的真皮、骨、键、鳞等处含量丰富。
通常胶原由三条多肽链构成三股螺旋结构，分子量约30万道尔顿，主要组成氨基酸为脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸，而且脯氨酸为其特征氨基酸。
胶原蛋白一级结构的特征是含有甘氨酸的三联体（Gly-X-Y）重复排列着，其中，X，Y经常为亚氨基酸的脯氨酸和羟脯氨酸。
胶原蛋白(Collagen)是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质，为重要的功能性蛋白质，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。
由于胶原蛋白的特殊功能，其提取物已被广泛应用于医药、食品、日用化工、生物合成等工业领域，如医用胶囊、外科手术材料、食用明胶、化妆品等。
鱼鳞中含有丰富的胶原蛋白，占20%~ 40%，这对提取鱼鳞胶十分有利。
海水鱼鳞中含有较为丰富的磷脂，占7%左右，具有提高机体免疫力、延缓衰老、增强骨细胞和神经细胞功能的作用，还与机体的生殖生理和激素的代谢密切相关。
鱼鳞灰分含量高，约占30%，主要成分是羟基磷灰石，绝大部分集中在骨质层；脂质含量少，相对目前生产胶原蛋白的主要原料猪皮和牛皮而言，这更有利于胶原的提取和纯化。
2 本课题研究的目的和意义近年来，随着养殖规模的日益扩大和养殖技术的不断完善，养殖鱼类的产量提高很快。
中国的水产品产量一直保持着高速增长势头，水产品产量2011年已经达到5611万t，占世界水产品产量35%，位居世界第一位。
随着我国水产业的发展，水产加工也越来越受到人们的重视，加工的同时产生出大量下脚料，占鱼体总重的30%～50％，其中约5％是鱼鳞。
然而，这些鱼鳞没有被充分利用，大部分作为废弃物丢弃了。
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展，蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。
本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术，以及它们的新进展与应用前景。
一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中，使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。
由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性，越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。
二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中，在其形成菌落的过程中进行表达。
该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。
但同时，由于原核表达与真核细胞中的表达相比，它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差，不利于蛋白的正确折叠，因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。
2. 原核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统更接近真实情况中的表达方式，对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。
在真核表达系统中，常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。
其中，哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达，因此被广泛应用于蛋白质制备。
三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。
该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。
在该技术中，目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合，非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。
2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来，采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。
其中，在采用可溶性分离的方式时，常用的方法有两相法、分配层析等。
四、新兴技术及应用前景近年来，3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域，并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。
钙调蛋白的分离提纯
1、钙调蛋白 2、酸性蛋白质 3、加热变性沉淀法 4、SDS阴离子表面活性剂
02 细胞破碎
04 精细纯化
01
材料的选择 和预处理
03
目标物的提取 与分离（粗提
05
检测鉴定
取）
01 材料的选择和预处理
一、 材料的选择和预处理
材料的选择 大鼠脑组织
预处理
将切取的组织用4℃ 预冷的0.01mol/l的 PBS漂洗去血渍，再 用滤纸吸干残留的 PBS（磷酸盐缓冲液）
亲和色谱的洗脱
05 检测鉴定
五、 检测鉴定
定性分析
（1）分子量 : 电泳、质谱 (可同时鉴定分子量和纯度) （2）活性 : 根据蛋白质的功能选用不同的活性检测方法
定量分析
（1）紫外检测法：简单快速、不破坏样品、准确度低 （2）考马斯亮蓝染色法（Bradford法）：简单迅速、干扰少、灵敏度高(1g) （3）Folin-酚试剂法（Lowry法）： 灵敏度高、是常用的方法
➢ 加热变性沉淀法
加热变性沉淀法：将蛋白质溶于少量缓冲液（20mM Tris-HCl，pH=7.0, 1mM咪唑，1 mMMgAC2,10uM CaCl2)中，加入少量蛋白酶抑制剂配成溶液，调pH=8.0，置于90℃水浴中 煮沸3—4分钟，冰水浴冷却后离心，获取上清液。
04 精细纯化
四、 精细纯化
➢透析：
方法：将上清液在纤维素透析袋中透析。 原理是：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机 盐、单糖等分开。 目的：去除蛋白液中的配体离子。
➢离子交换层析：
前提：钙调蛋白是一种强酸性蛋白因而在中性或微碱性pH条件下带有大量净负电荷。 原理：在低离子强度条件下，钙调蛋白会与带正电荷的树脂结合，而许多等电点较高 的蛋白质则不结合。然后，改变条件将结合的蛋白质分别洗脱下来。
水产动物源胶原蛋白的提取及应用研究进展
2、水产动物胶原蛋白的分布和 含量
2、水产动物胶原蛋白的分布和含量
水产动物胶原蛋白主要分布在皮肤、肌肉和骨骼等部位。不同水产动物的胶 原蛋白含量和分布也存在差异。例如，鱼类胶原蛋白主要分布在皮肤和肌肉中， 而贝类则主要分布在壳和软组织中。
3、水产动物胶原蛋白的研究方 法
3、水产动物胶原蛋白的研究方法
基本内容
3、实验结果大量研究表明，水产动物源胶原蛋白具有良好的生物学功能和生 物相容性。在细胞培养实验中，水产动物源胶原蛋白可以促进细胞粘附、增殖和 分化，提高细胞活性。在动物模型实验中，水产动物源胶原蛋白可以促进创伤愈 合、改善皮肤质量、增强骨密度等。此外，水产动物源胶原蛋白还具有抗炎、抗 氧化、抗疲劳和抗衰老等作用。
二、胶原蛋白肽的应用
3、美容领域：胶原蛋白肽因其具有保湿、抗衰老等作用，因此在美容领域的 应用也非常广泛。例如，添加胶原蛋白肽的护肤品可以改善皮肤的水分保持能力， 减少细纹和皱纹的出现，提高皮肤的弹性和光泽度。
三、结论
三、结论
胶原蛋白肽的提取及应用研究已经取得了显著的进展。随着技术的不断进步 和新材料的发展，胶原蛋白肽的应用前景将更加广阔。在未来，我们相信胶原蛋 白肽将会在更多领域得到应用，为人类的生活和健康带来更多的益处。
基本内容
2、研究进展自20世纪90年代以来，人们开始水产动物源胶原蛋白的研究。随 着生物技术的不断发展，胶原蛋白的提取工艺也在不断改进。其中，常见的提取 方法包括酸提取法、碱提取法、酶解法等。这些方法的主要区别在于提取过程中 使用的溶剂和温度条件不同，从而影响提取效率和胶原蛋白的生物活性。
基本内容
二、动物蛋白源的种类与特点
3、微生物蛋白：微生物蛋白具有蛋白质含量高、氨基酸组成平衡、繁殖快等 优点。常用的微生物蛋白源包括酵母、细菌等。然而，微生物蛋白的生产成本较 高，限制了其广泛应用。
Mx蛋白研究进展_闫若潜
动物医学进展,2004,25(6):52-55Progress in Veterinary MedicineM x蛋白研究进展闫若潜1,吴文学2,夏 春1*,李新生1(1.中国农业大学动物医学院,北京100094;2.中国农业大学,北京100094)中图分类号:Q511文献标识码:A文章编号:1007-5038(2004)06-0052-04摘要:M x蛋白是干扰素诱导表达的抗病毒蛋白家族中的成员之一。
人、哺乳动物、鱼类、家禽体内都有M x蛋白。
M x蛋白具有GT P酶活性,在其肽链氨基端均包含一个氨基酸序列高度保守的的三联GTP结合区域,羧基端存在有亮氨酸拉链区域。
人和鼠的M x蛋白有抗病毒活性。
家禽中鸭的M x蛋白无抗病毒活性;鸡的M x蛋白的抗病毒活性受631位氨基酸的影响,当631位氨基酸为天冬酰胺时有抗病毒活性,为丝氨酸时则无抗病毒活性。
文章最后对禽类M x蛋白的应用和展望进行了探讨。
关键词:禽类;Mx蛋白;抗病毒蛋白;抗病毒活性M x蛋白是由I型干扰素(IFN / )诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白中的一种,具有广泛的抗病毒作用。
IFN系统是机体对病毒感染的重要防御系统,但其自身无直接杀灭病毒作用,而是通过诱导宿主细胞合成抗病毒蛋白来发挥其生物学效应。
这些蛋白主要包括2,5寡腺苷酸合成酶、P68蛋白激酶以及M x蛋白等。
M x蛋白具有GT P酶(GTPase)活性,在哺乳类有抗多种负链RNA病毒的活性[1]。
禽类也存在M x蛋白[2-3],本文将对哺乳动物Mx蛋白的分类、Mx蛋白的结构、功能、作用机制及禽类Mx蛋白研究进展作综述报道。
1 M x蛋白的发现及不同动物的M x蛋白1962年,Lindenmann发现有一近交小鼠品系A2G 小鼠能耐受对其它随机交配小白鼠致死剂量的流感病毒感染,这种特性受16号染色体上的一个显性基因M x(myxovirus resistant)控制,因能抵抗粘液病毒(流感)而命名为Mx基因[4]。
蛋白质检测方法
紫外吸收法
✓ 理论基础：蛋白质分子中的酪氨酸、苯 丙氨酸和色氨酸残基使其在 280 nm 处具有 紫外吸收， 其吸光度与蛋白质含量成正比。 此外，蛋白质溶液在 238 nm 的吸光度值与 肽键含量成正比。 利用一定波长下蛋白质 溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系 可以测定蛋白质含量。
✓小分子无荧光,在蛋白质溶液中加入小分子
✓基于蛋白质疏水作用：
✓ 在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向 于把疏水性残基包埋在分子内部而形成疏 水空腔。疏水作用及亲水和疏水平衡在蛋 白质结构与功能方面起着关键作用。
✓ 利用极性敏感有机小分子荧光探针与蛋 白质结合前后基于其疏水空腔提供了一个 非极性环境从而导致探针荧光性质的改变
Palapuravan Anees, et al. J. Am. Chem. Soc.
✓比色/比率型荧光探针检测蛋白质 利用催化消除氨基甲酸酯保护基团合成了
反应型探针，BSA的存在使得氨基萘二甲酰 亚胺的绿色荧光增强，根据溶液颜色变化和 荧光强度比值识别并定量检测。
X. Zhang. et al. Analyst,
免疫印迹 法检测样 品中特异 蛋白质的 基本流程
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
酶联免疫吸附试验
✓ 原理：酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）是一种固相免疫测定技术，先将已知的抗原 或抗体包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定 时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表 面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物， 根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小 进行定性或定量分析。 ✓ 优点：灵敏度高；特异性好；简便；重复性好。
生物活性物质的发现和开发
生物活性物质的发现和开发在科学研究和医药领域中，生物活性物质被广泛应用于新药品的开发和治疗疾病。
生物活性物质指的是能产生生物学效应的化学物质，例如蛋白质、多肽、糖、生物碱等。
这些物质常常存在于自然界中的植物、微生物和动物组织中，是新药品的重要来源。
本文将探讨生物活性物质的发现和开发的重要性及其实践应用。
一、生物活性物质的发现自然界中的生物活性物质是医药领域的重要研究对象。
在新药品的开发过程中，从自然界中发现并提取出具有生物活性的物质，是一种主要的策略。
例如，青霉素可以从霉菌中提取得到，而多西环素则可以从土壤中的放线菌中得到。
不同类型的生物活性物质，其发现与提取的方法也不同。
1. 植物中的生物活性物质植物是自然界中最常见、最广泛的生物之一，以植物作为新药开发的来源也是常见的方法。
例如，目前就有超过25%的处方药品源于植物。
在植物中，生物活性物质通常分布在各个部位中，包括根、茎、叶和果实等。
根据需要获取的物质种类不同，提取方法也有所不同。
例如，可以通过水、酒精、醋酸酯、醚等方法，对植物进行提取。
一些生物活性物质例如丹参素可以从丹参中提取得到，紫锥菊素也可以从紫锥花中提取得到。
2. 微生物中的生物活性物质微生物是一类单细胞生物，在自然界中分布广泛。
由于其生长周期短，菌落容易观察，且易于处理，因此常常用于生物活性物质的发现和开发。
例如，链霉菌可用于生产链霉素，而葡萄球菌可用于生产青霉素。
微生物中的生物活性物质通常是通过发酵过程获得的。
在微生物菌株中培养过程中，产生的代谢产物可以作为新药开发的候选物质。
国际上一些典型的新药，如庆大霉素和克林霉素，其基础就是来自于微生物的代谢物。
3. 动物成分中的生物活性物质动物组织本身就是生物活性物质的重要来源。
例如，蛇毒中有很多具有生物学效应的成分，医学研究中广泛应用。
在动物组织中，生物活性物质主要通过分离提纯的手段进行提取。
例如，可以通过硫酸还原酶、酸性水解酶等手段，对动物组织中的生物活性物质进行提取。
胶原蛋白的提取性质及其应用的研究进展
胶原蛋白的提取性质及其应用的研究进展胶原蛋白是一种结构特殊的蛋白质，存在于人体、动物体内和其他生物体的结缔组织中。
在近年来的研究中，胶原蛋白的提取、性质及其应用得到了广泛关注。
本文将从胶原蛋白的提取方法、性质及其应用三个方面对其研究进展进行探讨。
在胶原蛋白的提取方法方面，主要有化学溶解法、酶解法和生物发酵法等多种方法。
化学溶解法利用酸、碱等化学试剂进行溶解，然后通过沉淀、过滤等步骤进行提纯。
酶解法则是利用胶原蛋白本身的酶降解特性，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等酶的作用来提取。
生物发酵法则是通过利用专门的发酵微生物，如大肠杆菌、酵母菌等基因重组技术产生胶原蛋白。
这些方法各有优缺点，目前化学溶解法和酶解法是应用较为广泛的提取方法。
胶原蛋白的性质决定了其在医学、食品、化妆品等领域的应用。
胶原蛋白具有良好的生物相容性和生物降解性，能够促进创口愈合、增强细胞活性，并且有良好的保湿、抗衰老、抗氧化等功能。
此外，胶原蛋白还具有较好的机械性能，如强度、韧性和延展性等，可以用于制备组织工程支架和生物材料。
因此，胶原蛋白被广泛应用于医学领域，如创伤修复、骨组织工程、血管替代等；同时，在食品、化妆品等领域也有广泛应用，如保健品、护肤品、胶囊等。
胶原蛋白的应用前景十分广阔。
目前，研究人员通过改性和复合，进一步提升胶原蛋白的性能和应用。
例如，将胶原蛋白与其他材料进行复合，如聚乳酸、明胶、凝胶等，可以获得具有特定功能和性能的复合材料，如修复骨组织的生物材料、修复软骨的材料等。
此外，通过基因工程技术也可以产生具有特定结构和性质的胶原蛋白。
未来，还可以通过纳米技术、微流控技术等手段对胶原蛋白进行精细调控，进一步提升其应用性能。
总之，胶原蛋白的提取、性质及其应用具有广泛的研究进展。
随着材料科学和生物技术的进步，胶原蛋白的应用前景将会更加广阔，对于人体健康和生物医学领域的发展也将产生重要影响。
植物蛋白质分离纯化的研究进展
植物蛋白质分离纯化的研究进展植物蛋白质在现代人类生活中发挥着日益重要的作用，其分离纯化已成为蛋白质研究的重要课题之一。
本文在概述了植物蛋白质预处理方法的基础上，对植物蛋白质分离纯化技术如膜分离技术、离心分离技术、凝胶层析技术、盐析法、等电沉淀法、电泳、离子交换层析、等进行了综述，并对植物蛋白分离纯化的发展进行了展望。
标签：植物蛋白质；提取；分离纯化Abstract：Plant protein plays an increasingly important role in modern life，and the isolation and purification of target protein from plant has become one of the hot topics in protein research. In this paper，based on introducing pretreatment methods of plant samples，the protein isolation techniques such as membrane separation，centrifugation，gel chromatography，salting out，isoelectric precipitation，electrophoresis，ion exchange chromatography，are reviewed，and the development or the protein purification plant is prospected.Key words：plant protein；extraction；isolation and purification蛋白質是生命活动的物质承担者，存在于所有生物中。
蛋白质参与生物形态结构的建成，基因表达的调节，生物信息传递，生物分子催化、代谢以及学习、防御等多种生命活动过程。
高级动物生物化学
高级动物生化试题一、名词解释1、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）：指的是与生物氧化作用相伴而生的磷酸化作用，是将生物氧化过程中释放的自由能用以使ADP和无机磷酸生成高能ATP的作用。
2、别构效应（allosteric effect）：是指某种不直接涉及蛋白质活性的物质，结合于蛋白质活性部位以外的其他部位（别构部位），引起蛋白质分子的构象变化，而导致蛋白质活性改变的现象。
3、糖异生（gluconeogenesis）：指的是非糖化合物（乳糖、甘油、生糖氨基酸等）转变为葡萄糖和糖原的过程。
4、β-氧化（β-oxidation）：是指脂肪酸氧化生成乙酰—CoA的途径。
脂肪酸活化成脂酰—CoA后，逐步氧化脱下乙酰—CoA。
每次氧化从β碳原子开始，故称为β-氧化。
5、冈崎片段（Okazaki fragment）：是指在DNA不连续复制过程中，沿着后随链的模板链合成的新DNA片段。
6、分子病（molecular disease）：是指由于基因或DNA分子的缺陷，致使细胞内RNA及蛋白质合成出现异常、人体结构与功能随之发生变异的疾病。
7、乳糖操纵子（lac operon）：是指大肠杆菌中控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。
包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因LacZ(编码半乳糖苷酶)、LacY(编码通透酶)和LacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。
二、问答题：1、试述miRNA的结构特点及其功能miRNA 的结构特点：①广泛存在于真核生物中,，是一组不编码蛋白质的短序列RNA ,，它本身不具有开放阅读框架(ORF) ；②通常的长度为20～24nt，但在3′端可以有1～2个碱基的长度变化；③熟的miRNA5′端有一磷酸基团，3′端为羟基, 这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；④数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。
miRNA的功能：目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。
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中图分类号：Ｒ ２ ８ ２
文献标识码：Ａ
文章编号：１ ６ ７ ２ － ９ ７ ９ Ｘ （ ２ ０ ０ ９ ） ０ ５ － ０ ０ ５ ３ － ０ ３
Progress on Extract and Purificationion of Animal Tissue Protein
ＭＥＮＧ Ｌｉｎ， ＴＩＡＮ Ｊｉｎｇ－ｚｈｅｎ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎｇａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｊｉｎａｎ ２５０３５５， Ｃｈｉｎａ） Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ， ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｋ ｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ ：ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
非机械方法通过各种物理因素破碎组织细胞， 常用的有冻融法和超声波法等。李敏康等［２］根据纤维 蛋白原在低温下可形成絮状沉淀的性质，用冻融法 从猪血中提取纤维蛋白原。以纤维蛋白原中可凝固 纤维蛋白含量及纤维蛋白原得率为指标，考察了冷 冻、解冻等因素对提取纤维蛋白原的影响，确定最 佳提取条件为：抗凝血浆－ ２０ ℃冷冻 １２ ｈ，经 ４ ℃ 解冻后低温离心收集纤维蛋白原样品。超声波破碎 在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简 便，液量损失少。但超声波产生的化学自由基团能 使某些敏感活性物质变性失活［３］，处理一些超声波敏 感的蛋白酶时宜慎重。张富新［４］应用超声波提取羔羊 凝乳酶，大大缩短了提取时间，且对羔羊凝乳酶有 一定的激活作用。 １ ． １ ． ２ 化学方法 有机溶媒法是将材料置于低温下， 加入适量的有机溶剂迅速搅拌破碎细胞膜，破坏蛋白质 与脂质的结合。自溶法是在适当 ｐＨ 和温度下，利用自 身的蛋白酶破坏细胞，使细胞内含物释放。但自溶时 间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。 １ ． １ ． ３ 生物化学方法 酶解法操作条件温和，专一 性强，收率高，选择合适的酶和反应条件，即可有 效地提取蛋白质，在食品工业、海洋生物制药和药 物有效部位提取方面已显示出较好的应用前景。钱 曼等［５］用酶解法从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白，以鱼鳞 胶原蛋白水解度为考察指标，确定的最佳提取工艺 为：加酶量 ０．１４ ｍＬ，６０ ℃水解 ４ ｈ，料液比 １∶ ２０，胶原蛋白的水解度为 ６．４３ ％。经比较认为酶解 法提取的胶原蛋白的黏度、吸水性和起泡性大于热 力法提取的，但保水性、乳化能力和乳化稳定性及 泡沫稳定性小于热力法。 １ ． ２ 动物组织蛋白质的溶剂提取
［１１］ 金大地，孙炜，王吉兴，等． 一氧化氮合酶抑制剂对骨 关节炎的潜在治疗意义［ Ｊ ］ ． 中华骨科学杂志，２００２，２２
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因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易 变性的优点。鲁晓翔等［６］用单因素试验法，研究了 用低盐溶液提取蚂蚁蛋白的条件。缓冲液常用０．０２～ ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ 磷酸、碳酸以及 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 等。刘高强等［７］ 用缓冲液法研究了马尾松毛虫幼虫中蛋白质的提取， 认为用方法可行且提取效果优于稀碱法，总氮提取 率更高，实验确定的最佳条件为：缓冲液为 Ｎａ２ Ｈ Ｐ Ｏ ４ － Ｎ ａ Ｏ Ｈ（ｐ Ｈ ９ ． ５ ），料液比 １ ∶１ ５ （ｍ ／ ｖ）， 原料粗细度为 ４０ 目虫粉，抽提时间 ５ ｈ，抽提温度 ４０ ℃，沉淀 ｐＨ ５．０， 沉淀温度 ５ ℃，沉淀时间 １ ｈ。 此 条 件 下 所 得 蛋 白 质 产 品 的 粗 蛋 白 含 量 为 （ ７ １ ． １ ２ ± ０．１６） ％， 总氮提取率为（６０．３６ ± １．２５）％。蛋白 质是具有等电点的两性电解质，提取液的 ｐＨ 值应偏 离等电点。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性提取液， 酸性蛋白质用偏碱性提取液。陈申如等［８］用酸法溶解 提取鲢鱼中鱼肉蛋白质，蛋白质产率达 ９０ ％ 左右。 １ ． ２ ． ２ 有机溶剂提取法 一些蛋白质和酶与脂质结合 比较牢固或分子中非极性侧链较多，不溶于水、稀 盐、稀酸或稀碱溶液，可用乙醇、丙酮和丁醇等有 机溶剂提取。它们具有一定的亲水性和较强的亲脂 性，是理想的提取脂蛋白质的溶剂，但必须低温操 作。李万忠等［９］用乙醇回流提取法提取全蝎、蜈蚣 蛋白质，以醇浸膏得率及总氮含量为检测指标，优 化醇提工艺条件为：４ 倍量、３ 倍量 ６０ ％ 乙醇回流 提取 ２ 次，时间分别为 １． ０，０． ５ ｈ。
５４
食品与药品 Food and Drug ２００９ 年第 １１ 卷第 ０５ 期
１ ． １ ． １ 物理方法 分为机械与非机械方法。 机械方法主要通过机械切力破坏组织细胞，常
用的有高速珠磨法和匀浆法。朱彬等［１］在提取心肌肌 球蛋白的研究中，以成年白兔心脏为原料，用匀浆 法破碎去除了脂肪及结缔组织的兔左心室细胞，制 得的匀浆液经磁力搅拌、离心等步骤得到心肌肌球 蛋白粗品。提取的肌球蛋白产率和纯度均较高。
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有时单纯用一种溶剂很难全面地提取材料中的蛋 白质，可采用几种溶剂依次提取，从而得到不同类 型的蛋白质。李爽等［１０］分别用磷酸缓冲液、醋酸溶 液、氢氧化钠溶液、乙醇溶液提取蜂王幼虫的蛋白 质，并优化了提取工艺。 ２ 动物组织蛋白质的分离纯化 ２ ． １ 根据溶解度不同分离纯化
大部分动物组织蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸 或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙 醇、丙酮及丁醇等有机溶剂。 １ ． ２ ． １ 水溶液提取法 提取动物组织蛋白质一般采用 各种水溶液。稀盐和缓冲体系的水溶液对蛋白质稳 定性好、溶解度大，是最常用的溶剂。稀盐溶液 （一般用 ＮａＣｌ 溶液）可促进动物蛋白质溶解，同时
［１６］ Ｄｉａｚ－ｇａｌｌｅｇｏ Ｌ， Ｐｒｉｅｔｏ Ｊ， Ｃｏｒｏｎｅｌ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ａｆｔｅｒ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ， ２００５， ２３（６）： １３７０ －１３７６．
１ 动物组织蛋白质的提取 提取动物组织蛋白质要先经过清洗、烘干、粉
碎等处理。为了尽可能地提取完全，常需破碎动物组 织的细胞，释放蛋白质进入提取溶剂中。为避免活性 蛋白变性失活，在细胞破碎过程中应注意控制条件。 １ ． １ 动物组织的细胞破碎
实验室内常用的细胞破碎方法有物理、化学及 生物化学方法。
收稿日期：２ ０ ０ ９ － ０ １ － ０ ５ 作者简介：孟琳（１ ９ ８ ４ － ），女，硕士研究生，中药药剂学专业 ＊ 通讯作者：田景振，男，教授，博士生导师，从事中药新剂型与新技术研究
［１４］ 孙炜，王吉兴，金大地，等． 软骨修复组织蛋白多糖代 谢与一氧化氮合酶抑制剂的影响［Ｊ］． 中国组织工程研究与临 床 康 复 ，２００７，１１（４５）：９０６３－９０６６．
［１５］ Ｍｃｃａｒｔｎｅｙ－ｆｒａｎｃｉｓ Ｎ Ｌ， Ｓｏｎｇ Ｘ， Ｍｉｚｅｌ Ｄ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ ｅｒｏ－ ｓｉｖｅ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ［Ｊ］． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００１， １６６（４）： ２７３４－２７４０