脂肪组织蛋白的提取方法.doc
检测生物组织中糖类脂肪和蛋白质的方法
检测生物组织中糖类脂肪和蛋白质的方法糖类的检测方法：1.放射免疫法：利用放射性同位素标记的抗体或反应物与目标糖类结合，通过测量放射同位素的放射性强度来定量糖类。
2.高效液相色谱法：利用高效液相色谱仪将样品中的糖类分离，并通过检测器测定糖类的浓度。
3.还原糖法：通过还原糖的特性，将还原糖与试剂反应生成有色化合物，通过测量其吸光度来定量糖类的浓度。
4.酶法：利用具有特异性的酶针对特定的糖类进行酶解反应，生成可测定的产物，通过检测产物的浓度来定量糖类。
脂肪的检测方法：1.水解法：将样品中的脂肪水解为脂肪酸和甘油，再通过酶法或化学法测定脂肪酸或甘油的浓度。
2.胆固醇氧化酶法：利用脂肪样品中的胆固醇通过酶催化反应生成可测定的产物，通过测量产物的浓度来定量脂肪。
3.紫外吸收法：利用脂肪样品中的化学结构特性，通过紫外光谱测量脂肪的吸光度来定量脂肪的含量。
4.气相色谱法：通过气相色谱仪将样品中的脂肪分离，并通过检测器测定脂肪的浓度。
蛋白质的检测方法：1.低里氏法：利用低里氏试剂与蛋白质发生反应，形成可测定的复合物，通过测量复合物的吸光度来定量蛋白质的浓度。
2.高效液相色谱法：利用高效液相色谱仪将样品中的蛋白质分离，并通过检测器测定蛋白质的浓度。
3.毛细管电泳法：将样品中的蛋白质在电场作用下在毛细管中分离，根据蛋白质的电荷、大小和形状的差异来测定蛋白质的浓度。
4.射流显色法：利用射流试剂将蛋白质样品中的蛋白胺基酸与试剂反应生成有色产物，通过测量产物的吸光度来定量蛋白质的浓度。
需要注意的是，以上方法中的每一种都有其适用范围和局限性，具体选择方法时需根据实验要求、样本特性和实验设备等因素进行合理选择。
此外，还可结合多种方法进行确认和校准以提高检测结果的准确性和可靠性。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，- 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
2、前处理a、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法一、原料选择和前处理（一）原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理1.细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
重点实验课检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质
二、高考命题角度预测 (1)若以血液为材料检测血浆中是否含有还原糖和蛋 白质，对实验材料应如何处理？请分析原因。 提示：对血液进行离心后取上清液(血清)进行检测。 因血液为红色，会干扰实验结果。离心后去除血细胞，可 排除干扰。
(2)种子萌发过程中，蛋白质含量会发生变化。现有萌 发两天和四天的大豆种子，请设计实验，探究大豆种子萌 发时蛋白质含量是增加还是减少。(简要说明原理即可)
为什么？_________________________________________。 (3)已知生长素含量增加能提高细胞内乙烯的含量。如果对青柿 子喷洒一定浓度的生长素，则青柿子继续成熟时曲线②将呈现出 ________趋势，曲线①将呈现出________趋势。
[解析] (1)柿子在成熟过程中由苦涩变甘甜与淀粉的转化 有关，淀粉逐渐转化为具有甜味的还原糖，因此，青柿子中淀 粉含量高、还原糖含量少，黄柿子中淀粉含量少、还原糖含量 高；曲线②所示物质随时间变化含量逐渐减少，因此表示淀粉 含量的变化，曲线①表示还原糖含量的变化。(2)检测还原糖时， 斐林试剂的甲液、乙液要等量混合均匀后，再加入待测溶液中， 并要水浴加热。(3)根据题意可知，对青柿子喷洒一定浓度的生 长素后，青柿子细胞内乙烯的含量将增加。乙烯促进果实成熟， 因此淀粉的分解速度将加快，即曲线②加速下降，相应地，还 原糖的生成也将加快，即曲线①加速上升。
比较 项目
斐林试剂
双缩脲试剂
甲液 成分 0.1 g/mL
NaOH溶液
乙液
0. 05 g/mL CuSO4溶液
A液
B液
0.1 g/mL 0.01 g/mL NaOH溶液 CuSO4溶液
比较项目
斐林试剂
双缩脲试剂
反应原理 添加顺序
检测生物组织中的糖类脂肪和蛋白质
检测生物组织中的糖类脂肪和蛋白质
要检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质，可以使用以下
几种常见的实验方法：
1. 糖类检测：
- 阳离子交换色谱法（Ion exchange chromatography）：根据糖类的荷电性质，在具有阳离子交换基团的色谱柱上
进行分离和测定。
- 蒽酮法（Anthrone method）：利用蒽酮与糖类形成彩
色产物，测定其吸光度，从而定量分析糖类含量。
2. 脂肪检测：
- 总脂肪测定法（Total lipid assay）：通过提取组织样品
中的脂肪，使用溶剂进行提取，然后通过酶解、酶判定、
光度法或色谱法测定脂肪含量。
- 中性脂肪测定法（Neutral lipid assay）：使用溶剂提取组织中的中性脂肪，然后使用酶判定、高效液相色谱法等进行测定。
3. 蛋白质检测：
- 比色法：如布拉德福酮碱试剂法（Bradford assay）、双酮化合物法（Biuret method）等，根据蛋白质与特定试剂形成复合物，通过光吸收法或比色法测定颜色变化，从而定量分析蛋白质含量。
- 生物素-链霉亲和素（Biotin-streptavidin assay）：通过生物素与链霉亲和素的特异性结合，配合荧光标记物或酶标记物，测定蛋白质含量。
总的来说，具体的方法选择要根据实验目的、仪器设备和实验条件来决定。
另外，还可以结合一些生物学技术，如免疫印迹法、质谱分析和核磁共振等，对糖类、脂肪和蛋白质进行定量和定性分析。
脂肪组织蛋白的提取方法
产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3127 BB-3311 BB-3703 BB-3182 BB-3185 BB-3191
1. 提取液制备：每 500ul 蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置 冰上备用。
2. 取 100mg 组织样本剪碎，加入蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼 可见固体①。
3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在 4℃，10000rpm 条件下离心 5 分钟。 4. 将含有脂肪的上清吸入蛋白离心管中，套上液体收集管，在 4℃，12000rpm 条
产品简介： 贝博脂肪组织蛋白提取试剂盒适用于从各种脂肪含量高的实体组织和细胞，如脂肪细
胞、脂肪肝细胞、脑、脂肪、脂肪肝脏、结缔组织、胸腺组织等动物组织中提取总蛋白。提 取过程简单方便，可在 1 小时内完成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶 对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒含有的独特配方能够溶解细胞膜 包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等
BB-3181 的试剂盒。
产品特点： 1、 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。 2、 将蛋白提取的时间缩短至 30 分钟-1 小时。 3、 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。 4、 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。 5、 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包 含 7 种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。 该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白 酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
实验一：检测生物组织中的糖类-脂肪-蛋白质
实验检测生物组织中还原糖、脂肪和蛋白质一、实验原理:某些化学试剂能使生物组织中的有关有机化合物，产生特定的颜色反应.注意事项：还原糖的检测和观察:①还原糖有葡萄糖，果糖,麦芽糖；②甲乙液必须等量混合均匀后再加入样液中，现配现用；③必须用水浴加热脂肪的鉴定：①切片要薄，如厚薄不均就会导致观察时有的地方清晰，有的地方模糊.②酒精的作用是:洗去浮色③需使用显微镜观察④使用不同的染色剂染色时间不同蛋白质的鉴定：①先加A液1ml,再加B液4滴②鉴定前，留出一部分组织样液，以便对比资料一：生物组织中普遍存在的可溶性糖类较多，有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖。
前三种糖的分子内都含有游离的具还原性的半缩醛羟基，因此叫做还原糖；蔗糖分子内没有,为非还原糖. 可溶性还原糖（如葡萄糖、果糖、麦芽糖）与斐林试剂发生作用,可生成砖红色的Cu 2O沉淀。
如：加热葡萄糖+ 2Cu2+ + 4OH—葡萄糖酸+ Cu 2O↓(砖红色)+ H 2O 即Cu 2+被还原成Cu 2O，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸。
用斐林试剂鉴定还原糖时,溶液变化过程为:浅蓝色→棕色→砖红色沉淀淀粉遇碘变蓝色（直链）或紫（红）色（支链）。
资料二:脂肪和类脂(磷脂、糖脂、固醇脂等）统称为脂类。
它是构成人体组织的正常成分，脂类的主要功能是氧化供能。
脂肪主要存积于脂肪组织中，并以油滴状的微粒存在脂肪细胞内。
苏丹三染液其实是苏丹三固体颗粒溶于高浓度乙醇（70%-95％,多用95％）配制而成的，而脂肪同样较易溶于高浓度乙醇,所以染色时间长了就会让样品中的脂肪溶解,洗浮色的时候被洗掉，就观察不到了。
在病理检验中，脂类染色法最常用以证明脂肪变性，脂肪栓子以及肿瘤的鉴别.脂类染色使用最广泛的染料是苏丹染料,最常用的有苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑及油红O等。
脂肪被染色，实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。
临床上常对组织切片进行染色观察.资料三：蛋白质与双缩脲试剂发生作用,产生紫色反应。
脂肪组织提取蛋白质的原理
脂肪组织提取蛋白质的原理脂肪组织提取蛋白质的原理涉及到脂肪组织结构、蛋白质溶解和分离的过程。
蛋白质是细胞内重要的分子，参与细胞的结构和功能，提取脂肪组织中的蛋白质可以用于生物学研究、药物研发等领域。
首先，了解脂肪组织结构对蛋白质的提取至关重要。
脂肪组织主要由脂肪细胞和血管组成，脂肪细胞内含有大量的脂肪颗粒，而蛋白质则分布在细胞质和细胞核中。
因此，要提取脂肪组织中的蛋白质，首先需要破碎脂肪细胞，释放蛋白质。
其次，脂肪组织中的蛋白质通常被分为可溶和不可溶两部分。
可溶蛋白质主要存在于细胞质中，包括酶、结构蛋白、转运蛋白等；而不可溶蛋白质则主要存在于脂肪颗粒中，包括脂肪结合蛋白、脂肪酸结合蛋白等。
因此，提取脂肪组织中的蛋白质需要先将细胞破碎，将可溶蛋白质溶解并分离出来，然后通过其他方法提取不可溶蛋白质。
在实际操作中，提取脂肪组织中的蛋白质通常分为以下几个步骤：第一步是脂肪组织的破碎和细胞裂解。
通常采用机械破碎、超声波破碎或化学裂解等方法，将脂肪细胞破碎并释放蛋白质。
第二步是蛋白质的提取和溶解。
蛋白质通常需要在一定的缓冲液中溶解，使其保持其天然构象和功能。
常用的缓冲液包括Tris缓冲液、PBS缓冲液等，通常需添加蛋白酶抑制剂和变性剂以保护蛋白质不被降解。
第三步是蛋白质的分离和纯化。
分离蛋白质通常采用离心、蛋白质层析、电泳等方法，将目标蛋白质从其他杂质中分离出来。
层析法通常包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等，能够根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性进行分离。
电泳法则是根据蛋白质的分子量和电荷进行分离。
最后，提取的蛋白质需要经过纯化和鉴定的过程，以确保提取的蛋白质的纯度和活性。
纯化通常采用各种蛋白质分离技术，如超滤、氨基酸层析、亲和层析等，以提高蛋白质的纯度。
鉴定则包括蛋白质质谱、Western blot、酶联免疫吸附等方法，用于确定蛋白质的组成和特性。
综上所述，脂肪组织提取蛋白质的原理是通过破碎细胞、溶解和分离蛋白质的过程，实现蛋白质的提取和纯化。
分离组织膜蛋白的方法
分离组织膜蛋白的方法：1）取组织适量，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2）1000g下4℃离心10min，取上清液转入另一离心管中。
3）105000g，4℃离心1 hr。
弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4）收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M surcose，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，1％(W/V)SDS ,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
2、分离膜蛋白的方法（操作）1）分离细胞膜蛋白的方法：1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTAbuffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2）分离细胞膜蛋白的方法：1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。
(完整word版)膜蛋白提取
1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3、100000g，4℃离心1hr。
弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
2取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。
样品蛋白含量测定采用酚试剂法。
3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。
将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。
2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。
组蛋白提取方法
2012
（IF=3.322）
● Pin Huan et al.
Comparative proteomic analysis of challenged Zhikong scallop (Chlamys
farreri): A new insight into the anti-Vibrio immune response of marine bivalves
pregnancy villous EVT's invasion function
Virology Journal
2011, 8:114
（IF=2.55）
● Weiwei Jianga, Bin Lia et al.
Artesunate in combination with oxacillin protect sepsis model mice challenged with lethal live
提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电泳、组蛋白修饰实验比如乙酰化、甲 基化、sumoylation 试剂和仪器
● 移液器、吸头
● 离心机及离心管
● 涡旋振荡器
● 冰箱，冰盒
使用方法：
细胞总蛋白提取： 1. 提取液制备：每 500ul 冷的总蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物和 2ul 磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。 2. 取 5-10×106 个细胞①，在 4℃，1000rpm 条件下离心 5-10 分钟，小心吸取培养 基，尽可能吸干，收集细胞。 3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 每 5×106 个细胞中加入 500ul 冷的总蛋白提取液，混匀后，在 4℃条件下振荡 15-20 分钟。 5. 在 4℃，14000rpm 条件下离心 15 分钟。
检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质
约2min50~65℃水浴加热三、检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质1.实验原理：某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机化合物产生特定的颜色反应。
①还原糖+斐林试剂———————>砖红色沉淀②淀粉+碘液→蓝色③脂肪+苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ）→橘黄色（或红色） ④蛋白质+双缩脲试剂→紫色2.实验步骤及实验现象：①还原性糖鉴定：取材→制备组织样液→加斐林试剂1ml →水浴加热煮沸→显色（浅蓝色→棕色→砖红色沉淀） ②淀粉鉴定：取材→制备组织样液（马铃薯匀浆）→滴加碘液→摇匀后变成蓝色③脂肪鉴定：方法一：取材与制备组织样液（花生种子匀浆）→滴加苏丹Ⅲ（苏丹Ⅳ）→摇匀后变成橘黄色（红色） 方法二：取材、切片、制片：花生种子浸泡，将子叶切成薄片→滴加苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ）→用50%酒精洗去浮色→镜检（看到橘黄色或红色的脂肪颗粒）④蛋白质鉴定：取材→制备组织样液（豆浆或蛋清稀释液）→加双缩脲试剂A 液1ml →摇匀→加双缩脲试剂B 液4滴→观察颜色（紫色）3.实验注意事项：（1）从植物器官中提取糖类、脂肪、蛋白质的方法：设法使细胞破碎（如研磨、挤压或切割等），再将这些物质提取出来。
（2）禾谷类的果实、种子中含淀粉较多；甘蔗的茎和甜菜的根含蔗糖较多；花生、芝麻的种子中含脂质较多；大豆种子中含蛋白质较多。
（3）显色反应材料选择时要注意：①材料本身应浅色，以免对实验结果的观察产生干扰； ②材料应含有丰富的相关物质，使现象更显著。
（4）还原性糖鉴定①常见的还原糖有葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、乳糖等。
②实验材料要选含还原性糖量高，白色或近于白色的组织，如苹果和梨的匀浆。
③不能选用甜菜、甘蔗，因为它们所含的蔗糖属于非还原性糖。
④马铃薯含淀粉较多，也不能作为该实验材料。
⑤西瓜、血液、绿色叶片等材料本身的颜色会对实验结果造成干扰，也不能作为该实验材料。
⑥斐林试剂实际上是Cu(OH)2的悬液，不稳定，如果长时间放置，Cu(OH)2悬液会变成Cu(OH)2沉淀，不易和还原糖发生反应。
检测生物组织中的糖类、脂肪、蛋白质(教案)
检测生物组织中的糖类、脂肪、蛋白质(教案)第一章：生物组织中糖类的检测1.1 教学目标：了解糖类在生物组织中的存在形式和功能。
学会使用费林试剂和本-珀林试剂检测生物组织中的糖类。
1.2 教学内容：糖类的分类和功能。
费林试剂和本-珀林试剂的使用方法。
实验操作步骤和注意事项。
1.3 教学活动：讲授糖类的相关知识。
演示费林试剂和本-珀林试剂的使用方法。
学生分组进行实验操作，检测生物组织中的糖类。
1.4 教学评价：学生能准确描述糖类的存在形式和功能。
学生能正确使用费林试剂和本-珀林试剂进行实验操作。
第二章：生物组织中脂肪的检测2.1 教学目标：了解脂肪在生物组织中的存在形式和功能。
学会使用苏丹Ⅲ染液和苏丹Ⅳ染液检测生物组织中的脂肪。
2.2 教学内容：脂肪的分类和功能。
苏丹Ⅲ染液和苏丹Ⅳ染液的使用方法。
实验操作步骤和注意事项。
2.3 教学活动：讲授脂肪的相关知识。
演示苏丹Ⅲ染液和苏丹Ⅳ染液的使用方法。
学生分组进行实验操作，检测生物组织中的脂肪。
2.4 教学评价：学生能准确描述脂肪的分类和功能。
学生能正确使用苏丹Ⅲ染液和苏丹Ⅳ染液进行实验操作。
第三章：生物组织中蛋白质的检测3.1 教学目标：了解蛋白质在生物组织中的存在形式和功能。
学会使用双缩脲试剂检测生物组织中的蛋白质。
3.2 教学内容：蛋白质的分类和功能。
双缩脲试剂的使用方法。
实验操作步骤和注意事项。
3.3 教学活动：讲授蛋白质的相关知识。
演示双缩脲试剂的使用方法。
学生分组进行实验操作，检测生物组织中的蛋白质。
3.4 教学评价：学生能准确描述蛋白质的分类和功能。
学生能正确使用双缩脲试剂进行实验操作。
第四章：生物组织中糖类、脂肪、蛋白质的综合检测4.1 教学目标：能够综合运用所学知识，检测生物组织中的糖类、脂肪、蛋白质。
学会使用多种试剂进行生物组织成分的鉴定。
4.2 教学内容：糖类、脂肪、蛋白质的检测方法的综合运用。
实验操作步骤和注意事项。
4.3 教学活动：讲授糖类、脂肪、蛋白质的检测方法的综合运用。
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。
但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。
因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。
蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。
故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。
温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。
提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。
将细胞内蛋白质提取出来。
并与其它不需要的物质分开。
但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。
蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。
这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。
水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。
如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。
如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。
其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。
蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。
真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。
拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。
脂肪组织 外泌体提取方法
脂肪组织外泌体提取方法1、差速离心差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。
该方法包括几个步骤，包括1）低速离心去除细胞和凋亡碎片，2）更高速离心以消除更大的囊泡，最后，3）高速离心沉淀外泌体：不过需要注意的是，样本的粘度与分离的外泌体纯度有显著的相关性，因此，具有高粘度的生物样品（例如血浆和血清样本）需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。
步骤：以300×g离心10分钟，取上清。
以2000×g离心10分钟，取上清。
10,000×g离心30分钟，取上清。
100,000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100,000×g离心90分钟。
2、密度梯度离心该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。
因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。
但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。
2018年Li K等人改良了此方案，回收率更高、纯度更高，并且结构和功能保持更好。
3、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。
该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。
尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。
此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。
与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。
目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。
不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。
4、过滤超滤膜也可用于分离外泌体。
根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。
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