膜蛋白提取

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植物膜蛋白提取方法

植物膜蛋白提取方法说实话植物膜蛋白提取这事，我一开始也是瞎摸索。

我试过超声破碎法来提取。

就像敲鸡蛋，想把里头的东西弄出来那种感觉。

把植物组织放在缓冲液里，然后用超声仪来破碎细胞。

可是我发现这种法子很容易把膜也给弄破喽，得到的膜蛋白纯度不咋高，好多其他乱七八糟的东西都混进去了。

这就好比炒菜的时候把不该放的调料都倒进去了，最后味道全乱套了。

后来呢，我又尝试了差速离心法。

这就像挑豆子，把大的小的分开那样。

先把植物组织破碎后，通过不同的离心速度把细胞器啊什么的和膜蛋白分离开。

开始的时候我老是掌握不好离心速度和时间，要么离心速度不够，那些东西分不开，要么就是离心太久了，把想要的膜蛋白都给弄丢了一部分。

经过好多次的尝试，我才慢慢摸准了一点规律。

比如说，先低速度短时间离心去掉那些大的残渣，然后再逐步提高离心速度和延长时间来纯化膜蛋白。

我有段时间还听别人说密度梯度离心法好使。

这方法有点像从水里分层捞东西。

就是用不同浓度的溶液形成一个密度梯度，然后离心，让膜蛋白在适合它密度的那个层面停下来，这样和其他物质分离开。

但是这个方法操作起来比较麻烦，各种溶液的配制就要很精确，我就老在这上面出错，溶液配不对后续根本得不到像样的结果。

还有就是用化学试剂来提取。

比如说表面活性剂。

这就跟用清洁剂去油污有点像，表面活性剂能把膜蛋白从细胞膜上给“扒拉”下来。

不过这化学试剂的种类和浓度可得选好了，选错了就像洗衣粉放太多把衣服都洗坏了似的，膜蛋白的活性啥的就全没了。

我就在选择表面活性剂的种类和浓度上栽过跟头，试了好多种，结果都不理想，不是蛋白没有提取出来就是提取出来的蛋白变性了失去活性了。

如果是新手上路的话，我觉得差速离心法可以先试试，毕竟相对来说比较直白一点，虽然可能会碰到不少问题，但是在调整离心速度和时间的过程中可以慢慢学习。

可千万别像我刚开始的时候，只知道按照书上的数值来，实际情况和书上可能有差别，要多做尝试才行。

在操作的全过程里，实验设备的清洁也很重要。

细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取1. 引言细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质，它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。

细胞膜蛋白具有多种功能，包括细胞识别、信号转导、运输和通道形成等。

为了研究细胞膜蛋白的结构和功能，科学家需要从细胞中提取这些蛋白质。

本文将介绍细胞膜蛋白的提取方法和步骤。

2. 细胞膜蛋白的提取方法2.1 细胞膜蛋白的提取原理细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质，与细胞膜紧密结合。

因此，提取细胞膜蛋白需要破坏细胞膜，并保持蛋白质的完整性。

常用的细胞膜蛋白提取方法包括机械破碎法、化学溶解法和超声波法等。

2.2 机械破碎法机械破碎法是一种常用的细胞膜蛋白提取方法。

其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。

2.破碎细胞：将细胞悬浮液置于低温条件下，加入适量的缓冲液，然后用高速搅拌器或超声波破碎仪破碎细胞，使细胞膜破裂。

3.离心：将破碎后的细胞悬浮液进行离心，分离出上清液和沉淀。

4.收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，这个上清液中含有细胞膜蛋白。

2.3 化学溶解法化学溶解法是另一种常用的细胞膜蛋白提取方法。

其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。

2.加入溶解剂：向细胞悬浮液中加入适量的溶解剂，如磷酸盐缓冲液或甘油，使细胞膜破裂。

3.搅拌：将细胞悬浮液与溶解剂充分混合，并用搅拌器搅拌一定时间，使细胞膜蛋白溶解在溶液中。

4.离心：将溶解后的细胞悬浮液进行离心，分离出上清液和沉淀。

5.收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，这个上清液中含有细胞膜蛋白。

2.4 超声波法超声波法是一种快速、高效的细胞膜蛋白提取方法。

其步骤如下：1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。

2.加入超声波溶解剂：向细胞悬浮液中加入适量的超声波溶解剂，如磷酸盐缓冲液，使细胞膜破裂。

3.超声波处理：将细胞悬浮液置于超声波处理器中，进行超声波处理，使细胞膜破裂。

提取膜蛋白的方法

提取膜蛋白的方法提取膜蛋白是一项关键的实验步骤，用于研究膜蛋白的结构和功能。

本文将介绍几种常用的膜蛋白提取方法。

1. 浸泡法浸泡法是一种简单的膜蛋白提取方法。

将细胞或组织样品置于适当的缓冲液中，如磷酸盐缓冲液或生理盐水中，并加入一些溶解剂（如阴离子洗涤剂）以破坏膜结构。

浸泡一段时间后，离心以分离出溶液中的膜蛋白。

2. 磷脂双层溶液法磷脂双层溶液法利用磷脂双层膜的特性来提取膜蛋白。

首先，将细胞或组织样品放入含有磷脂双层的液体中。

磷脂双层膜与细胞膜相似，可吸附并保持膜蛋白的结构和功能。

然后，用洗涤液洗涤磷脂双层，使膜蛋白释放到洗涤液中。

3. 超声法超声法是一种物理方法，通过超声波的能量来提取膜蛋白。

将细胞或组织样品置于含有缓冲液的管中，并使用超声波处理。

超声波的能量可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到缓冲液中。

然后，对溶液进行离心，将膜蛋白分离出来。

4. 酸碱提取法酸碱提取法利用pH的变化来提取膜蛋白。

首先，将细胞或组织样品放入酸性或碱性溶液中，并搅拌。

酸性或碱性环境可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到溶液中。

然后，通过调整pH值，使膜蛋白沉淀，进一步提纯。

5. 亲水基质法亲水基质法是一种通过亲水基质与疏水膜蛋白的选择性结合来提取膜蛋白的方法。

细胞或组织样品与亲水基质接触，亲水基质与细胞膜的亲水区域结合，使膜蛋白释放到溶液中。

然后，通过离心和洗涤步骤来分离和纯化膜蛋白。

这些方法在膜蛋白的研究中应用广泛，但根据具体的实验目的和样品特性，可以选择适合的方法进行膜蛋白提取。

实验中还应注意选择合适的缓冲液、溶液浓度和温度，并结合离心、洗涤等步骤进行蛋白的纯化和分离。

此外，需要根据实验目的选择合适的检测方法，如SDS-PAGE、Western blot等来确定提取的膜蛋白的质量和纯度。

总之，膜蛋白提取是膜生物学研究的重要一环，不同方法适用于不同的样品和实验要求。

正确选择和操作提取方法可以高效地提取膜蛋白，并为后续研究提供可靠的样品。

膜蛋白的提取与分离

膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介：1细胞质膜资料1895年,0verton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。

1925年Gorter&Grendel: 用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。

1935年Danielli&Davson ：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。

1959年Robertson: 用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+( 亮)+2 (暗) =细胞质膜的主要功能概括如下：(1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2) 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。

(1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。

(2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。

获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。

附注：使用分级抽提方法获得的膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用2—D技术也好，ICAT乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。

组织膜蛋白的提取方法

组织膜蛋白的提取方法
5、取沉淀,(即提取组织胞浆蛋白最后一步离心取上清后的沉淀）加入1mL冷的抽提Buffer，涡旋振荡混匀后，4℃放置10～15min；
【注：因抽提Buffer在室温时会分层，请务必于4℃混匀后加入】
6、4℃, 3000rpm 离心5min，取上清转移至新管（注意勿将沉淀带入上清），进行下步提取；
7、置于37℃水浴10min；
8、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管，可见下层为含膜蛋白的有机相。

上下两层因均为透明，只在交界处有一折光线，需仔细观察才可见到。

或室温静置30分钟～1小时亦可见分层。

以下亦同。

】
9、取下层，加入500μL冰冷灭菌水，4℃放置5min；
10、置于37℃水浴10min；
11、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
12、取下层，加入500μL冰冷灭菌水，4℃放置5min；
13、置于37℃水浴10min；
14、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物，BCA法测定蛋白含量（因残留有机相可能影响测定结果，此含量为相对参考值），分装冷冻保存。

膜蛋白抽提[5篇模版]

膜蛋白抽提[5篇模版]第一篇：膜蛋白抽提二、蛋白抽提谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。

由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取.但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。

膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS(一种离子去污剂），Emulgen和Lubrol等表面活性剂。

1、分离膜蛋白的方法（原则性）：4)顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。

用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。

5)centrifugal protein extraction原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心评价：尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。

（codegreen）6)detergent-based：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器(ER)，然后分级抽提方法。

例如，去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。

膜蛋白的提取方法

膜蛋白的提取方法
膜蛋白的提取方法通常包括以下几个步骤：
1. 细胞裂解：将包含膜蛋白的细胞或组织用不同的方式进行裂解，例如超声波处理、酸碱处理、高压处理等。

2. 膜蛋白分离：通过离心、过滤等方法将膜蛋白分离出来。

3. 纯化：采用膜层联萃取、柱层析、电泳等方法对膜蛋白进行纯化。

4. 确认：通过蛋白质定量、SDS-PAGE、Western blot等方法验证膜蛋白的存在和纯度。

常见的膜蛋白提取方法有：
1. 酸性洗涤法：利用低pH值时，膜蛋白和膜脂亲性增强的特性，将细胞裂解物在酸性条件下洗涤获得膜蛋白。

2. 有机溶剂提取法：利用膜蛋白亲性较强的有机溶剂，如丙酮、甲醇等，将膜蛋白从细胞裂解物中提取出来。

3. 离心法：通过离心分离膜细胞，从而获得膜蛋白。

4. 免疫亲和层析法：利用特异性抗体将目标膜蛋白从混合蛋白中分离纯化。

以上方法的选择需根据具体情况来定，不同的细胞类型或膜蛋白性质有着不同的最佳提取方法。

(完整word版)膜蛋白提取

1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。

弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

2取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。

样品蛋白含量测定采用酚试剂法。

3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。

将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。

2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。

鉴定膜蛋白的实验方法及步骤

鉴定膜蛋白的实验方法及步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：膜蛋白是位于生物膜上的一种蛋白质，它在细胞内外沟通信息，调节物质的运输和细胞的形态结构等功能。

鉴定膜蛋白的方法和步骤对于研究细胞生物学和生物化学具有重要意义。

下面将介绍一种常用的鉴定膜蛋白的实验方法及步骤。

实验方法：1. 细胞培养和膜蛋白提取：需要将感兴趣的细胞株培养至对数生长期，然后采用适当的方法将细胞破碎并获得含有膜蛋白的细胞膜。

2. SDS-PAGE分析：将膜蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白分离出来。

3. 免疫印迹分析：将膜蛋白从SDS-PAGE凝胶上转移到聚丙烯酰胺膜上，然后用特异性的抗体探测膜蛋白。

4. Western blot分析：用二抗结合辅助探测靶蛋白。

5. 膜蛋白鉴定：根据Western blot结果，确定膜蛋白的存在与否，并分析其表达水平。

实验步骤：1. 提取膜蛋白：将细胞经过适当处理（如超声波破碎、离心等）后，得到含有膜蛋白的细胞膜，采用适当的方法（如亚硝酸铝沉淀法）沉淀膜蛋白。

2. 蛋白定量：用BCA或Bradford方法测定蛋白浓度。

3. SDS-PAGE电泳：将膜蛋白样品加入含有SDS的样品缓冲液中，加热变性，然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。

4. Western blot：将凝胶电泳后的蛋白转移到PVDF或nitrocellulose膜上，用特异性抗体探测膜蛋白的存在。

5. 二抗结合：将与特异性抗体结合的二抗与酶标记共同作用于蛋白，然后用化学发光或显色底物观察膜蛋白。

通过上述实验方法及步骤，可以较为准确地鉴定膜蛋白的存在与表达水平，为深入研究膜蛋白的生物学功能和调控机制提供重要的实验数据。

希望以上内容对您有所帮助。

第二篇示例：膜蛋白是生物体中存在的一种具有重要功能的蛋白质，它主要存在于细胞膜中，起着传递信号、运输物质等重要作用。

鉴定膜蛋白的实验方法和步骤对于研究膜蛋白的功能和结构具有重要意义。

下面将介绍一种常用的鉴定膜蛋白的实验方法及步骤。

细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取
细胞膜蛋白的提取可以通过以下步骤进行：
1. 细胞收集：从所需的细胞类型中收集足够数量的细胞。

可以使用细胞培养方法培养细胞，或者从活体组织中分离细胞。

2. 细胞破碎：将细胞用适当的方法破碎，以释放细胞内的蛋白。

可以使用机械方法（如超声波破碎器或高压细胞击碎器）或化学方法（如洗涤液或界面活性剂）来破碎细胞。

3. 蛋白质提取：使用适当的缓冲液或溶液将细胞破碎物悬浮并离心，以去除细胞碎片和细胞核。

随后，可以使用不同的方法来提取膜蛋白，例如溶解细胞膜并提取蛋白。

4. 蛋白质纯化：使用不同的技术来纯化细胞膜蛋白。

这包括以蛋白质的特定性质为基础的方法，例如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。

5. 蛋白质浓缩：将纯化的细胞膜蛋白浓缩到所需的浓度。

可以使用蛋白质浓缩技术，例如氨基酸纤维柱、浓缩管或旋转蒸发器等。

6. 蛋白质鉴定：利用蛋白质检测方法，如SDS-PAGE、Western blotting或质谱分析等，确定提取的蛋白质的纯度和数量。

细胞膜蛋白的提取过程需根据实验目的和具体需求来选择和优化各个步骤。

膜蛋白的分离方法

膜蛋白的分离方法
膜蛋白是一类位于细胞膜上的蛋白质，它们在细胞的代谢、信号传递、物质运输等方面起着重要作用。

以下是一些常见的膜蛋白分离方法：
1.超速离心法：利用超速离心机产生的强大离心力，将细胞膜和膜蛋白分离开来。

这种方法常用于制备纯净的细胞膜和膜蛋白。

2.电泳法：通过电泳技术，可以根据膜蛋白的电荷性质和分子量大小，将其分离开来。

电泳法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等。

3.层析法：层析法是一种基于膜蛋白物理化学性质差异的分离方法。

常用的层析技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。

4.浮选分离法：利用浮力密度的差异，通过离心使不同密度的膜蛋白在溶液中分层，从而实现分离。

5.免疫沉淀法：基于抗体与抗原的特异性结合，使用特异性抗体将目标膜蛋白从混合物中沉淀出来。

6.密度梯度离心法：根据膜蛋白的密度差异，将其在密
度梯度介质中进行离心分离。

7.膜蛋白提取试剂盒：市面上有一些商业化的膜蛋白提取试剂盒，它们通常结合了多种分离技术，简化了膜蛋白的提取过程。

需要根据具体的实验需求和膜蛋白的特性选择合适的分离方法。

在膜蛋白分离过程中，需要注意保持膜蛋白的活性和稳定性，避免蛋白质的变性和降解。

膜蛋白纯化方法范文

膜蛋白纯化方法范文膜蛋白是一类存在于细胞膜上的重要蛋白质，起着许多重要的生物学功能。

为了研究膜蛋白的结构和功能，需要对其进行纯化。

然而，膜蛋白的纯化相对困难，主要是由于其高度疏水的性质和复杂的表达、折叠和定位过程。

本文将介绍几种常用的膜蛋白纯化方法。

1.高速离心：高速离心是最常用的初步膜蛋白纯化方法之一、该方法利用差速离心将细胞破碎，得到胞浆和质膜颗粒的混合物。

然后通过多次离心，逐步提高离心速度，最终得到膜蛋白的富集颗粒。

2.界面活性剂提取法：界面活性剂提取法是一种广泛应用于膜蛋白纯化的方法。

该方法通过在非离子型或阳离子型界面活性剂存在下将膜蛋白从膜上溶解转移到溶液中。

通常选用的界面活性剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠和短链磷脂。

4.高效液相色谱：高效液相色谱是一种常用于膜蛋白纯化的分离技术。

该方法利用柱上填充的固定相，通过控制溶液中的成分在固定相和流动相之间的分配，实现膜蛋白的分离纯化。

常用的高效液相色谱包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、逆流色谱等。

5.电泳分离：电泳是一种通过电场作用将膜蛋白根据其大小和电荷分离的方法。

电泳可以分为凝胶电泳和非凝胶电泳两种。

凝胶电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-等。

非凝胶电泳主要包括等电聚焦电泳和二维电泳。

除了这些传统的膜蛋白纯化方法之外，还有一些新的技术在膜蛋白纯化中得到了应用，例如固相提取、膜抓捕技术、质谱分析等。

这些新技术的应用，为膜蛋白纯化带来了更高的效率和准确性。

总结起来，膜蛋白的纯化方法有很多，每种方法都有其适用的场景和特定的优缺点。

研究人员可以根据具体的实验需求和条件选择合适的纯化方法，以获得高质量的膜蛋白样品。

细菌总蛋白的提取方法

细菌总蛋白和膜蛋白提取方法一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。

该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。

每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。

最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。

5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g 离心10min去除不溶物。

sgu蔗糖梯度密度离心提取膜蛋白

sgu蔗糖梯度密度离心提取膜蛋白磷脂双分子层是细胞膜的基本结构单位，负责细胞内外环境的分隔与传递信息。

膜蛋白则扮演着细胞膜的主要功能执行者，参与了多种细胞活动过程。

因此，研究膜蛋白的特性和功能对于理解细胞的生理和病理过程具有重要意义。

然而，膜蛋白的提取和纯化一直是一个具有挑战性的课题。

在过去的几十年里，许多提取和纯化方法被开发出来，并得到广泛应用。

本文将重点介绍一种被称为“sgu蔗糖梯度密度离心提取膜蛋白”的方法。

该方法结合了蔗糖梯度离心和密度梯度的概念，通过分离膜蛋白和其他细胞组分，以获取高纯度的膜蛋白样品。

第一步：制备细胞裂解物首先，需要准备待提取的膜蛋白的细胞样品。

这可以是从细胞培养物中收集到的细胞，也可以是从组织样本中提取的细胞。

细胞裂解是获得细胞内组分的第一步。

一种常用的方法是通过超声波破碎法，将待提取的细胞悬浮于缓冲液中，并使用超声波将细胞破碎成裂解液。

这个过程将释放出细胞内的膜蛋白和其他溶液中组分。

第二步：制备含有膜蛋白的提取物接下来，需要将裂解液中的膜蛋白分离出来。

一种常用的方法是利用差速离心进行分离。

差速离心是利用离心力使颗粒在管中分离的物理方法。

在本方法中，我们将使用蔗糖梯度离心来分离膜蛋白。

首先，将蔗糖溶液制备成不同密度的梯度。

为此，我们可以将蔗糖加入一个满足实验要求的缓冲液中，并通过离心使蔗糖在离心管中形成密度梯度。

通常，该梯度可以在10％到60％（w/v）蔗糖范围内制备。

然后，我们将制备的细胞裂解物缓慢地加入蔗糖梯度上层。

接着，使用超速离心设备进行离心，以便于不同密度的膜蛋白沉积到特定密度的梯度层中。

第三步：分离和收集膜蛋白通过离心，在蔗糖梯度中，膜蛋白根据密度分布的不同，可以得到分离。

通常，较轻的膜蛋白位于梯度的上层，而较重的膜蛋白则位于梯度的底层。

在分离后，可以通过梯度的倾泻或倒置等方法将膜蛋白从梯度中取出。

此时，我们需要注意膜蛋白的稳定性以及梯度的不同浓度区域可能包含的其他细胞组分。

中药膜蛋白质提取

中药膜蛋白质提取中药是中华文化的重要组成部分，也是我们传统的医学瑰宝。

中药中的有效成分是非常复杂的，其中不乏具有药用价值的蛋白质。

通过提取中药中的蛋白质，可以广泛应用于医学、保健品等多个领域。

中药膜蛋白质提取是提取中药中蛋白质的一种方法，下面我们就来详细介绍一下此方法的步骤。

一、中药材处理中药膜蛋白质提取过程中，中药材的处理非常重要。

首先，选用新鲜的中药材进行提取。

其次，需要对中药材进行研磨，制成适合操作的形态。

最后，将中药材用水或其他溶剂进行浸泡，使药材中的蛋白质在溶液中充分溶解。

二、蛋白质提取将浸泡好的中药材经过过滤、离心、超滤等一系列步骤，得到中药膜蛋白质的提取液。

一般情况下，膜过滤是最重要的步骤之一。

利用分子筛分离出分子较小的蛋白质，大分子多糖、脂质等杂质将无法通过膜孔，从而得到纯净的膜蛋白质提取物。

三、蛋白质分离、纯化通过电泳、色谱等方法对蛋白质进行分离和纯化。

电泳技术可以根据蛋白质的电性和分子大小等特性，将其分离出来；而色谱技术则是利用不同物质在固定相和流动相之间的亲和性和分子大小等特性来进行分离和纯化。

在这些步骤中，选择适当的分离和纯化方法对于提取纯净蛋白质非常重要。

四、蛋白质鉴定、分析对分离纯化得到的蛋白质进行结构、功能鉴定，确定蛋白质的主要作用。

通过质谱、圆二色谱、红外光谱等技术手段，确定蛋白质的分子量、构型、生物活性等参数，为进一步研究和开发提供依据。

综上所述，中药膜蛋白质提取是一个复杂、多步骤的过程。

这个过程需要科学严谨的操作，才能确保提取到纯净、高效的膜蛋白质。

中药膜蛋白质提取为中药材的深度开发和应用提供了强有力的支持，也使我们更好地保护和传承中华传统医药文化。

完整版膜蛋白提取

1别离组织膜蛋白的方法1、取组织,参加10ml Buffer A 于冰上充分匀浆.2、J6-HC离心机800rpm , 4 c离心10min后,所得上清液转入超速离心管.3、100000g , 4c离心1hr.弃去上清,沉淀用适量的Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装至EP 管, Eppendorf 台式离心机10000rpm , 4 c离心30min.4、收集所得上清液即为膜组份.Buffer A : 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl (PH 7.5), 120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B : 20mM HEPES (PH 7.5 ) , 10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.2取约0.1g肝组织,参加2ml粉碎缓冲液,冰浴中超声粉碎,每次20秒,间隔30秒,共3 次,4° c 105xg条件下离心2小时,上清液为胞浆蛋白,沉淀局部参加1ml胞膜蛋白提取液,超声粉碎,4.c 105xg条件下离心2小时,上清液为胞膜蛋白.样品蛋白含量测定采用酚试剂法.3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1.将细胞种于T75或T175的培养瓶中培养数天,细胞铺满瓶底后,吸去培养液.将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%) 参加量以覆盖细胞为止,置于培养箱或在超净台内消化3〜5分钟,如仍未脱落瓶底,用吸管吹打,使细胞完全脱落.2.收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中,1000rpm离心10分钟,去上清液.3. 按2.5毫升(T75 ) /每瓶或5毫升(T175/每瓶参加冰冷的匀浆液(HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM )于离心管中,将溶液和沉淀转移到匀浆器中,匀浆.4.将匀浆液转入离心管中, 参加适量的Tris - HCl (50mM, PH7.4)4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟.在沉淀中参加同前量的匀浆液,再匀浆,匀浆后参加适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心,共离心三次.5.在最后一次离心彳#到沉淀中按250微升每瓶(T75)或500微升每瓶(T175)参加tris-HClbuffer,匀浆,取50微升匀浆液测量蛋白浓度.6.按实验要求,将匀浆分装于1毫升的Eppendoff管中,其于-80oC冰箱中待用.主要基于膜蛋白分子量较大,在40000g时易沉降来别离.做膜蛋白的免疫荧光, 可以用荧光抗体染色, 然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察,具体的protocol可以找到,就不多说了.需要注意的是,要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域,如果是胞外,可以直接染色；如果在胞内,那么需要用无水甲醇在-20度处理10min,使细胞膜通透,然后再用抗体孵育,这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合. 一般对膜蛋白的提取都是采用梯度离心或者高速离心的方法别离,可是我们现有的离心机都无法到达所需要的转速,所以我们试着采用分布溶解分布沉淀的方法.1)预冷的pbs洗去组织血液,除去结缔组织、脂肪.2) 4 C剪碎,加bufferA玻璃匀浆器匀浆至无大块状物,10 C超声波10min ,重悬,再破碎5—10min.3)12000rpm 离心10min,沉淀用bufferB 重悬,20 C超声波10min.4)12000rpm 离心10min,沉淀用bufferC 抽提.5)12000rpm离心10min,所得上清含有9%的膜蛋白.6)12000rpm离心10min,沉淀加bufferD沸水煮5min , 12000rpm离心10min,上清含有1%的膜蛋白. bufferA: 40mM Tris basebufferB: 8M urea ,100mM DTT, 40mM Tris basebufferC: 6-7M urea, 0.2mmol/L PMSF,40mM Tris basebufferD: 1% SDS, 50mM DTT,25%Glycerol,in 0.4M Tris-HCl pH8.8我们做的是动物组织的膜蛋白,提出来电泳条带还可以,只是我们没有专一膜蛋白抗体来检测提出来的是否是膜蛋白.但是这个方法是可行的5三、蛋白提取操作步骤I实体组织蛋白的提取1、组织样本(200〜300mg)尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎；2、组织样本中参加1mL Lysis Buffer (注：使用前,每mL Lysis Buffer参加1科L蛋白酶抑制剂和1科L 1M DTT ),置玻璃均浆器冰上均质30〜50次(或超声破碎细胞, 每次30 S ,3〜4次,每次间隔1 min),置于冰上冷却.均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不小于90%;3、将均浆液转移至冷的离心管中,于4C, 3000 rpm离心10 min,弃沉淀；4、取上清转移至新冷离心管中,于4 C , 14 000 rpm离心30 min ,所得上清转至新管中, 即为胞浆蛋白,分装冷冻保存；5、取沉淀,参加1mL冷的抽提Buffer,涡旋振荡混匀后,4c放置10〜15min；【注：因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4c混匀后参加】6、4 ℃ , 3000rpm离心5min ,取上清转移至新管(注意勿将沉淀带入上清),进行下步提取;7、置于37 c水浴10min；8、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相. 上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到.或室温静置30分钟〜1小时亦可见分层.以下亦同.】9、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min； 10、置于37 c水浴10min； 11、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；12、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min；13、置于37 c水浴10min；14、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量〔因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值〕,分装冷冻保存.6用RIPA强配方,把脱氧胆酸钠浓度调整至1.0%,同时参加NP-40和Triton X-100 ,浓度均为1%.我刚做了一个7次跨膜蛋白,LHR的WB.7提取总蛋白的方法不能用于膜蛋白的提取, 提供一个常用的方法：先别离膜,在提取膜蛋白. 这类方法在园子里有不少介绍. 我们实验室曾经采用蔗糖梯度超速离心别离膜,据说效果还可以.您可以试一下.呵呵——8细胞破碎后,先低速离心,除去未破碎的细胞和大的细胞碎片.保存上清,超速离心,可获得细胞膜.然后用detergent溶液萃取,就可以得到膜蛋白溶液了.9我有新的问题了...哪位仁兄有好的提取细胞膜蛋白的裂解液配方...我的膜蛋白总提不出来.我的细胞是HEPG2;目的蛋白是LDL受体；我的配方是这样的：4%CHAPS , 8 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride但是总提不出来....急！ ! ! ! !呵呵,CHAPS提取膜蛋白水平较差,尝试参加1%ASB-14 ,或者参加1 % Triton X-100,与CHAPS联合抽提.另外最好参加2M thiourea.祝好运1.6% Triton X-100, 5 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride ;2M thiourea; thiourea很贵吗我现在没有,又要急着用,能不能不用thiourea??thiourea不是很贵,merck250g才300多rmb.电泳时可以考虑用ASB-14 , sb3-10.没有的话,提取最好加点NP-40, 2M thiourea还是要的,要是有TBP就更好了.NP lysis buffer.NP 配方,stock solution 20ml (50mM Tris-HCL (PH8.0), 5mMEDTA, 0.05%NaN3, 0.14M NaCL, 100mM NaF), 1% Nonidet P40, 0.2TIU/ml aprotinin, 1.5uM pepstatin A, 20mM Iodoacetamide.NP配好后分装,-80度保存.用之前,参加NaV和PMSF.混匀后立即置于冰上.10如果你研究的蛋白表达比拟丰富没有必要提取膜蛋白,直接用RIPA裂解液裂解后离心取可溶性蛋白变性做WB就可以了；如果你蛋白的含量低或抗体特异性很差的话,你应该用试剂盒或超速离心提取膜蛋白,可以起到富集和纯化的作用,使你更容易得到好的结果！11RAPI的裂解液只能说是强的非变性裂解液,而算不上是强的变性裂解液.提取膜蛋白一般都在变性条件下才可以.所以,你应该改用其他更适合的强的变性裂解液,如含SB3-10、DM、ASB-14等膜助溶剂,或者SDS-Bolied loading bufffer,2-D 裂解液7M thiourea+2M urea 也可以12组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行(1)取组织,用PBS冲洗干净组织上的血液.参加10ml Buffer A ,用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆.每次30秒,重复3-5次.(2)离心机1000rpm , 4 C离心10min后,所得上清液转入超速离心管.(去掉大块组织及结缔组织)(3)100000g, 4c离心1hr,弃去上清.(此为胞浆蛋白,假设只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4 度,30分钟离心,取上清即可).沉淀用适量的Buffer B重悬,4度过夜后,分装至EP管, Eppendorf 台式离心机10000rpm, 4 C 离心30min.(4)收集所得上清液即为膜组份.Buffer A :0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl (PH 7.5), 120mM KCl , 1mM EDTA, 1mM EGTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B 20mM HEPES (PH 7.5), 10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM , PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.所得蛋白分装EP管(每管约50ul),取一管测蛋白浓度,其它放入-70度深冻冰箱保存.如果要定量的话,最好能立即根据浓度,参加上样缓冲,煮沸, 4度保存.反复冻融蛋白会降解,浓度不准.13我用来抽提大鼠脑组织细胞膜蛋白方法：取两只大鼠的整个脑组织,参加10ml Buffer A 于冰上充分匀浆.J6-HC离心机800rpm , 4 C离心10min后,所得上清液转入超速离心管.100000g, 4c离心1hr.弃去上清,沉淀用适量的Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装至EP管,Eppendorf台式离心机10000rpm, 4 C 离心30min.所得上清液即为膜组份.Buffer A : 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl 〔PH 7.5〕,120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mMPMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B ： 20mM HEPES 〔PH 7.5〕, 10%甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.CHAPS〔一种离子去污剂〕是提取膜蛋白的常用试剂一般用10mMol的浓度即可,你可以试试加到你的Buffer中,看效果如何.不过此药品很贵！lysis buffer的选择依赖于你所研究蛋白质的位置和性质：1〕细胞浆蛋白〔可溶性〕：Tris Buffer2〕细胞浆蛋白〔结合到细胞骨架〕：Tris-Triton buffer3〕膜结合蛋白：Np-40或RIPA4〕核蛋白：RIPA5〕线粒体蛋白：特殊的抽提裂解液6〕全细胞蛋白：Np-40 or RIPAWestern blotAdipose tissue membrane protein was extracted from approx. 20mg of adipose tissue. PAGE was performed according to Laemmli [ 8]. A portion of 2 g of adipose t issue membrane protein was applied per lane. In addition, 10 q of mononuclear cell membrane protein 〔corresponding to 1.7 106 mononuclear cells〕 was applied and used as a positive control for verification of blotting, incubation and detection. Tank blotting to nitrocellulose was performed according to standard protocols, with transfer for 3h at 70V and 15 C.°The blots were incubated with 1 闵/ml rabbit anti-〔human b2-adrenoceptor〕 IgG 〔Santa Cruz Biotechnology Inc.〕, and were then re-incubated with alkaline phosphatase-labelled goat anti-rabbit antibody. Detection was performed using DDAO [9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl)] phosphate (Pro-Q Western Blot Stain Kit; Molecular Probes Inc.) on a Fujifilm FLA-3000 instrument.Quantification of b2-adrenoceptor protein was performed by determining the fluorescence intensity of b2-adrenoceptor-antibody-immunoreactive bands. The concentration of b2-adrenoceptor protein is expressed as the intensity of the immunoreactive bands of the tissue samples in relation to the intensity of the immunoreactive bands of the mononuclear cell membrane protein internal standard. Like others before us trying to isolate the b2-adrenoceptor [9], we observed several immunoreactive bands on our Western blots ( Figure 1). On all blots we found a single major band at 57kDa and several smaller immunoreactive bands (38-52kDa). Theb2-adrenoceptor is known to have a molecular mass of 64kDa and to be very fragile, so the immunoreactive bands on our blots must represent proteolytic degradation products and/or secondarily modified b2-adrenoceptor. When trying toquantify the receptor it is therefore uncertain whether to include all visible bands [total band area (T)] or to include only the single major band (S). We have done both. Figure 1 shows the area included in determining the intensity of the single major band and total band area intensity.All blots were loaded with the same amount of membrane protein per well, but since we wished to determine the level of protein expression in relation to individual cells, the concentration is expressed as intensity of b2-adrenoceptor protein per ng of DNA. The coefficient of variation based on 13 double determinations was 28% for total band area determinations and 29% for single major band determinations14凯基膜蛋白提取试剂盒凯基膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒一、描述：本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白.其原理是裂解细胞后,先离心别离出质膜粗提物,再利用特殊的抽提Buffer,选择性地别离提取膜蛋白,抽提Buffer含一种特殊的去污剂,在4c时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer,但在37c时,抽提Buffer分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中,根楣该性质别离出膜蛋白.产物不仅含细胞膜蛋白,也含胞器质膜蛋白.提取方法简单,可靠, 快速.获得的膜蛋白纯度高,可用于PAGE电泳、Western Blot、免疫共沉淀等后续研究. 二、试剂盒组份三、蛋白提取操作步骤I实体组织蛋白的提取1、组织样本〔200〜300mg〕尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎；2、组织样本中参加1mL Lysis Buffer 〔注：使用前,每mL Lysis Buffer参加1科L蛋白酶抑制剂和1 ^L 1M DTT 〕,置玻璃均浆器冰上均质30〜50次〔或超声破碎细胞,每次30 S ,3〜4次,每次间隔1 min〕,置于冰上冷却.均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不小于90%;3、将均浆液转移至冷的离心管中,于4C, 3000 rpm离心10 min,弃沉淀；4、取上清转移至新冷离心管中,于 4 C , 14 000 rpm离心30 min ,所得上清转至新管中, 即为胞浆蛋白,分装冷冻保存；5、取沉淀,参加1mL冷的抽提Buffer,涡旋振荡混匀后,4c放置10〜15min；【注：因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4c混匀后参加】6、4 ℃ , 3000rpm离心5min ,取上清转移至新管〔注意勿将沉淀带入上清〕,进行下步提取；7、置于37 c水浴10min；8、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相. 上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到.或室温静置30分钟〜1小时亦可见分层.以下亦同.】9、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min；10、置于37 c水浴10min；11、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；12、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min；13、置于37 c水浴10min；14、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕；15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量〔因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值〕,分装冷冻保存.四、SDS PAGE电泳操作步骤1、进彳T PAGE电泳前,取该提取物,每100 dL膜蛋白提取物,参加约300 dL的溶解Buffer 和约100 dL三氯乙酸〔TCA〕试剂, 混匀后置冰上20〜30 min后,13 000rpm ,离心15 min ,尽可能除去上清；2、沉淀参加1mL丙酮,室温静置10min后,13 000rpm离心15 min；3、弃上清,沉淀真空旋干或置冰上枯燥约10 min 〔敞开离心管盖〕,参加适当体积的LoadingBuffer 〔使用前每100 ^L Loading Buffer参加2〜5dL疏基乙醇〕溶解,彻底分散〔枪头反复吹吸或剧烈涡旋〕；【注：参加Loading Buffer后如有局部难溶物,可取上清继续上样；如参加Loading Buffer 后澳酚蓝转呈黄色,此为少量TCA残留所致,不影响电泳结果.请参照Marker标准.】4、上样进行SDS PAGE电泳.五、考前须知：1、所有的试剂及器具均需预冷后使用.细胞或组织量需到达要求.2、抽提Buffer 4 C时,为混悬状态,请于此温度下混匀后吸取参加粗提物中.3、室温25c〜37c时,抽提Buffer需静置30分钟以上可看到分上下两层,其中约9/10 至4/5为上层水相,下层只占1/10至1/5为有机相.4、因产品采用不透明的包装瓶,因此无法观察到上述分层现象,可将该BUFFER倒入玻璃烧杯或试管中静置30分钟〜1小时可见分层.5、TCA试剂具强腐蚀性,操作时请带适宜的手套并注意防护.六、储存蛋白酶抑制剂-200C, Loading Buffer室温保存,其余40C,保存一年。

细胞膜蛋白wb制样

细胞膜蛋白wb制样细胞膜蛋白WB制样细胞膜蛋白是细胞膜上的一类重要蛋白质，它们在维持细胞结构完整性、参与细胞信号传导、调控细胞内外物质的转运等方面起着重要的作用。

为了研究细胞膜蛋白的结构、功能及其相互作用，科学家们开发了各种实验方法，其中细胞膜蛋白的免疫印迹（Western Blotting，WB）是一种常用而有效的技术手段。

细胞膜蛋白WB制样是指在WB实验中，对待测细胞膜蛋白进行样品制备和分离的过程。

下面将详细介绍WB制样的步骤和注意事项。

第一步是细胞膜蛋白的提取。

细胞膜蛋白广泛存在于细胞的膜结构中，因此需要通过细胞膜的裂解来获得细胞膜蛋白。

常用的方法有超声波破碎、冻融法等。

提取过程中需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以保护膜蛋白的完整性。

第二步是蛋白质的定量。

在WB实验中，需要知道待测蛋白的浓度，以便在后续步骤中加载适当的样品量。

常用的蛋白定量方法有BCA 法、Lowry法等。

第三步是蛋白质的电泳分离。

WB实验通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行蛋白质的分离。

在电泳过程中，蛋白质会按照其分子量大小在凝胶中迁移，从而实现蛋白质的分离。

第四步是蛋白质的转印。

将分离得到的蛋白质从凝胶上转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维膜（NC）上，以便进行后续的免疫检测。

转印可以通过湿式或半干式方法进行。

第五步是膜上蛋白的阻断。

在进行免疫检测之前，需要将膜上的非特异性结合位点进行阻断，以避免免疫试剂的非特异性结合。

常用的阻断剂有非脂奶粉、BSA等。

第六步是膜上蛋白的免疫检测。

将特异性的一抗与待测蛋白进行特异性结合，然后再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗结合，形成特异性的免疫复合物。

最后，通过添加显色底物，产生显色反应，从而观察待测蛋白的存在与数量。

细胞膜蛋白WB制样过程中需要注意以下几点。

首先，实验过程中需要保持洁净，避免污染。

其次，蛋白质的处理过程中需要加入蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以保护膜蛋白的完整性。