膜蛋白提取

1分离组织膜蛋白的方法：

1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。

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取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。样品蛋白含量测定采用酚试剂法。

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我们实验室提取膜蛋白的方法如下：

1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。3．按 2.5毫升（T75）/每瓶或5毫升（T175/ 每瓶加入冰冷的匀浆液（HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。

4．将匀浆液转入离心管中，加入适量的Tris –HCl (50mM, PH7.4) 4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心，共离心三次。

5．在最后一次离心得到沉淀中按250微升每瓶（T75）或500微升每瓶（T175）加入tris-HCl buffer，匀浆，取50微升匀浆液测量蛋白浓度。

6．按实验要求，将匀浆分装于1毫升的Eppendoff 管中，其于-80oC 冰箱中待用。

主要基于膜蛋白分子量较大，在40000g时易沉降来分离。

做膜蛋白的免疫荧光，可以用荧光抗体染色，然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，具体的protocol可以找到，就不多说了。需要注意的是，要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域，如果是胞外，可以直接染色；如果在胞内，则需要用无水甲醇在-20度处理10min，使细胞膜通透，然后再用抗体孵育，这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合。

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一般对膜蛋白的提取都是采用梯度离心或者高速离心的方法分离，可是我们现有的离心机都无法达到所需要的转速，所以我们试着采用分布溶解分布沉淀的办法。

1）预冷的pbs洗去组织血液，除去结缔组织、脂肪。

2）4 ℃剪碎，加bufferA玻璃匀浆器匀浆至无大块状物，10 ℃超声波10min，重悬，再破碎5—10min。

3）12000rpm离心10min，沉淀用bufferB重悬，20 ℃超声波10min。

4）12000rpm离心10min，沉淀用bufferC抽提。

5）12000rpm离心10min，所得上清含有9%的膜蛋白。

6）12000rpm离心10min，沉淀加bufferD沸水煮5min，12000rpm离心10min，上清含有1%的膜蛋白。

bufferA: 40mM Tris base

bufferB: 8M urea ,100mM DTT, 40mM Tris base

bufferC: 6-7M urea, 0.2mmol/L PMSF,40mM Tris base

bufferD: 1% SDS, 50mM DTT,25%Glycerol,in 0.4M Tris-HCl pH8.8

我们做的是动物组织的膜蛋白,提出来电泳条带还可以,只是我们没有专一膜蛋白抗体来检测提出来的是否是膜蛋白.但是这个方法是可行的

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三、蛋白提取操作步骤

Ⅰ实体组织蛋白的提取

1、组织样本（200～300mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎；

2、组织样本中加入1mL Lysis Buffer（注：使用前，每mL Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂和1μL 1M DTT），置玻璃均浆器冰上均质30～50次（或超声破碎细胞，每次30 S ，3～4次，每次间隔1 min），置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％；

3、将均浆液转移至冷的离心管中，于4℃, 3000 rpm 离心10 min，弃沉淀；

4、取上清转移至新冷离心管中，于4℃, 14 000 rpm 离心30 min，所得上清转至新管中，即为胞浆蛋白，分装冷冻保存；

5、取沉淀，加入1mL冷的抽提Buffer，涡旋振荡混匀后，4℃放置10～15min；

【注：因抽提Buffer在室温时会分层，请务必于4℃混匀后加入】

6、4℃, 3000rpm 离心5min，取上清转移至新管（注意勿将沉淀带入上清），进行下步提取；

7、置于37℃水浴10min；