总蛋白的提取
Trizol法提取细胞总蛋白
0.3M盐酸胍95%乙醇溶液：2.866g盐酸胍，加100ml95%乙醇。
1%SDS溶液：1gSDS溶解于100ml去离子水。
5.用2ml含有0．3mol／L盐酸胍的95％乙醇洗涤蛋白质沉淀，室温放置20min，4℃，7500rpm离心5min；重复洗涤三次；
6.无水乙醇洗涤一次沉淀，室温放置20min；
7.4℃，7500rpm，离心5min；
8.真空干燥沉淀，加入适量l％SDS，55℃振荡溶解3h；
9.不溶物再以4℃，10000rpm离心10min，取上清即为细胞总蛋白溶液，分装后于-80℃保存待用。
Trizol法提取细胞总蛋白
1.提取细胞总RNA吸去上清后，按0.3ml乙醇/1mlTrizol加入中间层和下层有机相，混匀，室温静置3min；
2.4℃，2000rpm，离心5min，取上清转移至新的EP管中（约0.8ml）；
3.加ห้องสมุดไป่ตู้1．5ml异丙醇沉淀蛋白质，室温放置10min；
4.4℃，12000rpm，离心10min，弃上清；
植物总蛋白提取演示教学
植物总蛋白提取精品文档一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度 2个小时(必要时过夜)，4度 25000g离心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀，-20度 1个小时,再次离心去上清，将真空干燥的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8M urea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震荡1小时，20度25000g离心20min，收集上清，沉淀再次用IEF缓冲液离心收集上清，可为后续试验做准备。
2．苯酚（phenol）提取法花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）继续研磨5min,加提取缓冲液（0.1mol/L 8.8 Tr i s –HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。
将样本转移至离心管中，4度震荡30min，25000g离心10min，将上层的phenol层转移进另一个试管，将下边的水相层加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）及提取缓冲液，震荡，离心，将再次收集到的phenol与前边收集的混合，加5倍体积的0.1 M ammonium acetate in 100%methanol，在-20度震荡沉淀蛋白质，必要时过夜，4度 25000g离心10min，将沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗两次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬— -20度震荡30min，4度 25000g离心20min，洗剂完成后，沉淀真空干燥，IEF buffer提取蛋白质，如方法1。
组织总蛋白提取步骤
组织总蛋白提取步骤
总蛋白提取是从细胞或组织中提取出的所有蛋白质的混合物。
总蛋白
的提取对于生物学研究和许多实验室技术都至关重要。
以下是一般的总蛋
白提取步骤：
1.组织的收集和处理：
a.收集需要提取总蛋白的组织样品，并尽快处理以防止蛋白质降解。
b.使用冰凉的无菌生理盐水将组织样品洗涤以去除任何外部污染物。
c.如有必要，将组织样品研磨成细小的粉末状，以提高蛋白质的释放。
2.细胞破碎和裂解：
a.使用合适的细胞破碎方法（如液氮研磨、机械破碎器或超声波处理）破碎细胞膜，释放细胞中的蛋白质。
b.加入破碎缓冲液（通常是一种含有盐和蛋白质保护剂的缓冲液），
并将样品在低温下裂解，以避免蛋白质的降解。
3.离心：
a.将处理后的样品进行高速离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
b.将上清液（含有总蛋白）转移到干净的离心管中。
4.测定蛋白质浓度：
a. 使用适当的蛋白质浓度测定方法（如二维凝胶电泳、BCA法、Bicinchoninic Acid法）测定总蛋白的浓度。
b.根据测定的浓度进行相应的稀释或浓缩。
5.进一步处理或分析：
a.根据具体实验目的，可以进一步处理总蛋白提取物，如进行蛋白酶消化、亲和层析或其他分离纯化方法。
b. 可以使用各种蛋白质分析技术（如SDS-凝胶电泳、Western blotting、质谱等）对总蛋白进行定性和定量分析。
总蛋白的提取步骤中，诸如细胞破碎方法、破碎缓冲液的配制、离心条件和测定蛋白质浓度的方法等，都需要根据具体需求和实验目的进行优化和调整。
同时，注意使用无菌操作和低温条件，以保证蛋白质的完整性和稳定性。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
总蛋白质提取方法
总蛋白质提取方法（1）在研钵中预先加入0.25 g PVPP交联聚维酮和少量石英砂，在电子天平上调零后称取5g 黄皮层组织样品，用液氮研磨至细粉末状，全部转移至50 mL压口离心管中；（2）依次加入30 mL 12.5% TCA/丙酮、2 mL 1 M DTT和1 mL 100 mM PMSF 苯甲基磺酰氟化物，充分振荡混匀后冰浴振荡提取15 min，然后4℃条件下13,000×g离心15 min（重复2～3次至沉淀基本变成白色）；（3）弃上清，轻轻磕散沉淀，加入30 mL 经-20℃预冷的0.1 M乙酸铵/甲醇溶液，充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取15min，然后4℃条件下13,000×g离心15min；（4）弃上清，轻轻磕散沉淀，加入30 mL经-20℃预冷的丙酮，充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取15 min，然后4℃条件下13,000×g离心15 min；（5）弃上清，-20℃条件下在吸水纸上倒置30 min除去残留丙酮；（6）轻轻磕散沉淀，依次加入15 mL 提取Buffer（700 mM蔗糖+ 500 mM Tris-base + 100 mM KCl）、15 mL Tris-饱和酚（pH 7.5）、2 mL 1 M DTT和1 mL 100 mM PMSF，充分振荡混匀后冰浴低速振荡提取30 min，然后4℃条件下5,000×g 离心30 min；（7）小心吸取上层深色酚相提取液转移至新的50 mL压口离心管中，加入20 mL 0.1 M 乙酸铵/甲醇溶液，轻轻颠倒混匀后-20℃静置3～6 h沉淀蛋白，然后4℃条件下13,000×g离心30 min；（8）弃上清，加入30 mL预冷甲醇，冰浴中轻摇5 min充分洗涤管壁及沉淀，然后4℃条件下13,000×g离心15 min；（9）弃上清，加入15 mL预冷丙酮，冰浴中轻摇5 min充分洗涤管壁及沉淀，然后4℃条件下13,000×g离心15 min；（10）弃上清，用预冷小药勺将所有沉淀轻轻刮下并小心转移至2 mL灭菌离心管中（冰浴），原管用2 mL预冷丙酮快速洗涤后一并转移至2 mL灭菌离心管中，然后4℃条件下13,000×g离心15 min；（11）弃上清，-20℃条件下在吸水纸上倒置30 min除去残留丙酮；（12）所得蛋白质干粉可密封后置-70℃保存备用，或加入270 μL样品溶解Buffer （8 M尿素+ 4% CHAPS + 40 mM Tris-Base）、20 μL 1 M DTT和10 μL 100 mM PMSF，室温间隔涡旋溶解30 min，然后15℃条件下13,000×g离心15 min，将上清液转移至1.5 mL灭菌离心管即可；用Bradford法定量后可按每管20 μL分装至灭菌PCR管中，置-70℃保存备用。
细菌总蛋白和膜蛋白提取方法
[【生物化学与分子生物学】]细菌总蛋白和膜蛋白提取方法膜蛋白, 细菌膜蛋白, 细菌一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。
该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。
2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。
3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。
4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。
缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。
2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。
每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。
3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。
每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。
4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。
每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g 离心5min，弃上清，重复洗涤2次。
最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。
5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
遇到失意伤心事，多想有一个懂你的人来指点迷津，因他懂你，会以我心，换你心，站在你的位置上思虑，为你排优解难。
一个人，来这世间，必须懂得一些人情事理，才能不断成长。
就像躬耕于陇亩的农人，必须懂得土地与种子的情怀，才能有所收获。
一个女子，一生所求，莫过于找到一个懂她的人，执手白头，相伴终老。
总蛋白提取方法
总蛋白提取方法嘿，朋友们！今天咱就来聊聊总蛋白提取这个事儿。
你说这总蛋白啊，就像是一个神秘的宝藏，藏在细胞的世界里，等着我们去把它挖掘出来。
要提取总蛋白，就好像是一场和细胞的“战斗”。
首先呢，得准备好各种“武器”，也就是实验器材和试剂啦。
就像战士上战场得有趁手的家伙事儿一样。
然后呢，就是要选择合适的样本。
这可不能马虎，就好比你要去钓鱼，总得选个有鱼的地方吧。
不同的样本，提取的难度和效果可都不一样哦。
接下来，就是关键步骤啦！就像解开一个复杂的谜题。
你得小心翼翼地操作，不能有一点马虎。
比如要掌握好各种试剂的用量和比例，这就好比做饭时放盐放调料，多了少了味道可就不对啦。
有时候我就在想啊，这提取总蛋白不就跟我们找东西一样嘛。
在一堆乱七八糟的东西里面，要精准地找到我们想要的那个。
而且还得保证它的完整性和活性，不能给弄坏了呀。
提取的过程中还得注意各种条件，温度啦、时间啦，都得拿捏得死死的。
这就像烤蛋糕，温度高了低了，时间长了短了，蛋糕可就不完美啦。
你说要是一个不小心，操作失误了，那不就前功尽弃啦？那得多郁闷啊！所以啊，每一步都得谨慎再谨慎。
还有啊，不同的提取方法也各有特点呢。
就像不同的武功秘籍，各有各的厉害之处。
有的方法简单快捷，但是可能纯度不那么高；有的方法复杂一些，但是能得到更纯的蛋白。
这可就得根据我们的需求来选择啦。
哎呀，说了这么多，其实提取总蛋白真的不简单啊！但这也是科学的魅力所在嘛。
我们就是要不断地探索，不断地尝试，才能找到最好的方法。
总之呢，提取总蛋白是一项既有趣又有挑战的工作。
它需要我们有耐心，有细心，还要有扎实的专业知识。
朋友们，加油吧，让我们在总蛋白的提取之路上不断前进，挖掘出更多的宝藏！。
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1.单层贴壁细胞总蛋白的提取：
（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）
（4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）
（6 ）于4℃下12000rpm离心5min。
（提前开离心机预冷）
（7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取：
（1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
（3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
（1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。
（2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
含量测定
1. 制作标准曲线
（1 ）从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg。
（3 ）按下表在各管中加入各种试剂。