PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测
流式细胞术在临床与科研中的应用
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淋巴细胞亚群
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29CD3+CD8+ CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29CD3+CD4+CD8+ CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
CD45RA-CD45RO+
淋巴细胞亚群与疾病
疾病
自身免疫性疾病 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎 自身免疫性溶血性贫血 重症肌无力
免疫缺陷病 爱滋病
病毒感染 传染性单核细胞增多症
慢性活动性肝炎 活动性肝硬化
肿瘤 消化道癌, 肝癌, 肺癌
再生障碍性贫血 粒细胞减少症
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
NK
监测细胞免疫状态
1.CD4+、CD8+T细胞减少：见于r免疫球蛋白缺乏症、胸腺 发育不良、严重联合免疫缺陷病。
传递； （4）细胞分化过程中的调控； （5）细胞亚群的功能。
临床与科研常见应用
1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态 2.白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系 4.干祖细胞的定量及成分分析. 5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多态性检测; 肿瘤癌基因及 抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶; 耐药蛋 白的分析等等。
阵发性睡眠性血红蛋白尿症32例临床分析
阵发性睡眠性血红蛋白尿症32例临床分析作者：马宏杰段泽晔来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第02期【摘要】目的：探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）临床特点，诊察方法：回顾分析我院2007-2012年32例阵发性睡眠性血红蛋白尿症临床资料。
结果：首诊诊诊断为PNH13例，占40.6%，有误诊经历19例占59.4%。
结论：阵发性睡眠性血红蛋白尿症起病隐匿，表现复杂易误诊，详细的病史询问，开拓思路，及时行CD55和CD59等检验的筛查，提高PNH早期诊断率。
【关键词】阵发性睡眠性；血红蛋白尿症；早期诊断【中图分类号】R55 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0037-02阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种获得性造血干细胞克隆性疾病，以发作性血管内凝血、静脉血栓形成、骨髓造血功能衰竭为主要表现[1]。
作为一种慢性溶血性疾病，其病程长，临床起病隐匿，表现复杂，早期诊断困难，我们分析了近年我科诊断的32例病例的临床特征，现报道如下。
1 临床资料1.1 一般资料本文报道病例32例，均为我科2007年6月-2012年12月确诊病例，其中男性19例，女性13例，年龄15-80岁，平均年龄52.5岁，病程2个月-16年，均符合张之南主编的《血液病诊断与疗效标准》[2]。
首诊临床表现为酱油色尿13例，面色苍白10例，巩膜黄染5例，血栓性疾病4例。
1.2 误诊情况：首诊为PNH13例，占40.6%，有误诊经历19例，占59.4%.误诊为血栓性疾病4例。
其脑梗塞1例；下肢静脉血栓2例；布-加氏综合症1例；肝炎3例；胃肠道疾病2例；肾脏疾病1例；缺铁性贫血3例；骨髓增生异常综合症2例；再生障碍性贫血4例。
误诊5个月—14年，最长误诊1例14年，一直以贫血待查诊治，后因腹痛发生小肠坏死，行部分小肠切除后，再发脾门静脉血栓经检验CD55和CD59等实验确诊。
1.3 方法：对考虑PNH患者进行CD55和CD59，酸化血清溶血试验，蔗糖溶血试验，尿含铁血黄素试验，铁染色，网织红细胞计数，血常规，及骨髓细胞形态血检测。
pnh诊断标准
pnh诊断标准
PNH，全称为阵发性睡眠性血红蛋白尿，是一种红细胞膜缺陷引起的慢性血管内溶血性贫血。
为了准确诊断PNH，医生会根据患者的临床表现、实验室检查和基因检测结果进行综合评估。
1.临床表现
PNH患者通常表现为慢性血管内溶血性贫血，以及由于红细胞破坏过多而导致的血红蛋白尿。
这种血红蛋白尿通常在睡眠后出现，因此被称为“睡眠性血红蛋白尿”。
其他可能的症状包括乏力、头晕、黄疸等。
2.实验室检查
PNH的实验室检查主要包括以下几项：
血红蛋白尿：PNH患者的尿常规检查可发现血红蛋白尿，这是PNH 的典型表现。
网织红细胞计数：PNH患者的网织红细胞计数可能升高，这是由于骨髓红系代偿性增生的结果。
血清铁蛋白和转铁蛋白饱和度：PNH患者的血清铁蛋白和转铁蛋白饱和度可能降低，这是因为溶血导致铁丢失过多。
血清胆红素：PNH患者的血清胆红素可能升高，这是由于红细胞破坏过多。
骨髓检查：PNH患者的骨髓检查可能显示红系增生旺盛，这与溶血性贫血的骨髓表现相符。
3.基因检测
PNH的基因检测是诊断的金标准。
医生会检测患者的红细胞膜蛋白是否存在缺陷，如CD55和CD59等。
这些蛋白缺陷会导致红细胞对补体系统的敏感性增加，从而导致溶血。
如果基因检测结果显示存在这些缺陷，那么可以确诊为PNH。
综上所述，PNH的诊断需要结合临床表现、实验室检查和基因检测结果。
如果医生怀疑患者患有PNH，应进行相应的检查以明确诊断。
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的诊断指南(流式细胞术)
流式细胞术诊断并监测阵发性睡眠性血红蛋白尿症和相关疾病指南背景：阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种特殊的获得性克隆性造血干细胞疾病，该疾病是由于PIGA基因体细胞突变，导致连接细胞膜的GPI相关锚蛋白缺失所致。
流式细胞术是检测GPI相关锚蛋白缺失的方法之一，同时也是诊断PNH所必需的检测指标。
然而到目前为止，对于运用流式细胞术检测GPI相关锚蛋白缺失方法还没有标准化、规范化。
方法：在本论文中，我们将提出一致方案，介绍运用流式细胞术检测PNH的规范程序。
结果：我们通过临床症状和对数据的分析、结果报告对病例提出综合意见。
但分析中，主要集中在对分析过程的重要性。
本文将区分常规分析（定义为：缺失细胞占1％或更多）和高灵敏度的分析（缺失细胞仅占小于0.01％的PNH细胞）。
其中如何设计抗体组合和设门对这两种分析都是非常重要的，本文将做详细介绍。
我们将通过对白细胞和红细胞的检测，以及各自的检测优势来讨论并评估PNH患者人群。
我们目前提供的步骤仍需要进一步完善，使其成为高灵敏度的检测技术，包括需要明确：试剂浓度；PNH克隆细胞在正常人群的发生率（背景），并讨论此技术的缺点，因为此缺陷将可能影响到结果解释。
结论：本论文可适用于对PNH感兴趣和刚开始建立检测PNH克隆细胞的实验室，使其建立一个比较完善的实验流程；也可用于已开展此检测项目，以提高其该实验室检测技术和报告水平。
背景阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是一种罕见的造血干细胞疾病，该疾病自19世纪初即被确认为一个具有独特临床症状的疾病（1,2）。
在疾病的发展过程中，PNH有三个显着的临床特点，但是这三个特点的个体差异很大（3-5）。
首先，以补体介导的血管内溶血为主要临床表现，包括：吞咽困难，嗜睡，勃起功能障碍（ED），慢性肾功能衰竭，肺动脉高压，贫血，和血红蛋白尿。
其次，具有形成血栓的倾向，该血栓不仅可发生在四肢，还好发于具有特殊部位，如肝门（Budd - Chiari综合征），脾，肠系膜静脉。
流式细胞术检测贫血患者血细胞CD55和CD59的表达及临床意义
流式细胞术检测贫血患者血细胞CD55和CD59的表达及临床意义金冬岩;陆春伟;佟海侠;刘勇【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2011(19)6【摘要】目的检测贫血患者外周血中红细胞和中性粒细胞膜表面抗原CD55和CD59的表达情况并探讨其临床意义。
方法应用流式细胞术检测贫血患者及健康对照组外周血红细胞和粒细胞的表面抗原CD55、CD59的表达水平。
结果正常人CD55-、CD59-红细胞和中性粒细胞的百分率均<5%。
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)患者均>20%;部分再生障碍性贫血患者>5%,但均<15%;部分缺铁性贫血患者CD55-、CD59-红细胞>5%,但均<15%,而中性粒细胞的结果全部正常;少部分巨幼细胞性贫血患者CD55-、CD59-血细胞>5%,但均<10%;自身免疫溶血性贫血患者的CD55-、CD59-红细胞和中性粒细胞百分比均正常。
结论利用流式细胞术同时检测外周血中红细胞和中性粒细胞CD55和CD59的表达是目前诊断和鉴别诊断PNH的最可靠、最敏感的方法,也可作为判断疗效的手段。
【总页数】2页(P161-162)【关键词】阵发性睡眠性血红蛋白尿;CD55;CD59;流式细胞术【作者】金冬岩;陆春伟;佟海侠;刘勇【作者单位】中国医科大学附属盛京医院检验科;中国医科大学公共卫生学院卫生检验教研室;中国医科大学附属盛京医院输血科【正文语种】中文【中图分类】R556【相关文献】1.流式细胞术检测用于贫血患者血细胞CD55、CD59中的临床意义 [J], 郑小江;廖丽娟;李春晓;陈宇锋2.流式细胞术对再生障碍性贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿患者行CD55、CD59检测的临床意义 [J], 李虹;马莉;杨洁;秦雯;谭玉洁3.阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者血细胞表面CD55和CD59的检测及临床意义[J], 吴敏乐;张臣青;黄家福;曾绍毅;王丹林4.贫血病人外周血细胞CD55和CD59检测结果及其临床意义 [J], 张剑波;董巍;江南;房俊5.贫血患者外周血CD55^+和CD59^+细胞检测及临床意义 [J], 邢娟娟;黄涛;彭燕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断与治疗中国专家共识
及疗效。例如将ＰＮＨ红细胞根据ＣＤ５５、ＣＤ５９的缺乏程度 可以分为三型：Ｉ型（补体敏感度正常）、Ⅱ型（中度敏感）、
通信作者：邵宗鸿，Ｅｍａｉｌ：ｓｈａｏｚｏｎｇｈｏｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｎ
万方数据
guide.Байду номын сангаас
注：Ｇ：粒细胞；Ｍ：单核细胞；ａ分子标志用于检测ＧＰＩ锚链蛋白 缺乏的细胞，其余分子标志用于设门。具体荧光选择可以不同，不同 试剂荧光颜色也可以不同。４色、５色、６色的检测方式敏感性高，效 果良好，如ＦＬＡＥＲ／ＣＤ２４／ＣＤｌ５／ＣＤ４５。如对单核及粒细胞进行５色 分析，则需要准备２个试管。如以ＣＤ４５／ＣＤｌ５／ＳＳＣ标记通常可区分 粒细胞与单核细胞，但若更好在分选单核细胞则需要准备另一支试 管进行ＣＤ３３设门。ＰＮＨ：阵发性睡眠性血红蛋白尿症
史堡直渲堂苤查！！！！生！旦筮丝鲞笠！塑垦！也』旦！坐！！！！：丛！堡！！！！！：！！！：丝。盟旦兰
・标准与讨论・
阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断与治疗中国专家共识
中华医学会血液学分会红细胞疾病（贫血）学组
为进一步提高我国阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ） 的诊治水平，中华医学会血液学分会红细胞疾病（贫血）学组 在广泛征求有关专家意见的基础上，参考国内外有关文献， 达成以下我国ＰＮＨ诊断和治疗共识。 一、ＰＮＨ定义及发病机制 ＰＮＨ是一种由于体细胞ｘｐ２２．１上ＰＩＧ—Ａ基因突变导致 的获得性造血干细胞克隆性疾病。其发病机制包括造血干 细胞ＰＩＧ—Ａ基因突变，使部分或完全血细胞膜糖化磷脂酰肌 醇（ｄｙｃｏｐｈｏｓｐｈａｌｉｄｙｌ—ｉｎｏｓｉｔｏｌ，ＧＰＩ）锚合成障碍，造成血细胞 表面ＧＰＩ锚连蛋白缺失，细胞灭活补体等能力减弱，从而引 起细胞容易被破坏，发生溶血等。临床主要表现为不同程度 的发作性血管内溶血、阵发性血红蛋白尿、骨髓造血功能衰 竭和静脉血栓形成。 二、ＰＮＨ诊断 （一）筛查ＰＮＨ克隆的指征 １．以血红蛋白尿、尿含铁血黄素阳性和（或）血清游离血 红蛋白增高为主要表现的血管内溶血。 ２．无法解释的溶血伴有铁缺乏、腹痛或食管痉挛、血栓 栓塞、血小板减少和（或）白细胞减少。 ３．Ｃｏｏｍｂｓ试验（一）、无明显肝脾肿大、极少见红细胞碎 片、非感染性溶血性贫血。 ４．骨髓衰竭症：①怀疑或确诊的再生障碍性贫血或低增 生性贫血；②难治性血细胞减少伴一系发育异常；③不明原 因的血细胞减少症。 ５．不同寻常的血栓形成：①非常见部位血栓形成：肝静 脉（Ｂｕｄｄ—Ｃｈｉａｒｉ综合征）、其他腹腔内静脉（门静脉、脾静脉 等）、海绵窦、皮肤静脉；②伴有溶血征象的血栓形成；③伴有 全血细胞减少的血栓形成。 （二）需常规随访ＰＮＨ克隆的患者 确诊ＰＮＨ患者，应常规监测ＰＮＨ克隆变化，若病情稳 定，可每年监测１次；出现任何临床或血液学参数变化时应 缩短监测间隔。 出现溶血和血栓，若可靠的实验室检查未证实ＰＮＨ克 隆存在，则无需密切监测ＰＮＨ克隆。 （三）诊断ＰＮＨ的实验室检测项目 １．常规检测项目： （１）血常规及凝血功能：红细胞计数、血红蛋白含量、网 织红细胞百分比；白细胞计数、血小板计数；成熟红细胞形态 ［有无异形和（或）红细胞碎片］、有无幼稚红细胞。血浆纤 维蛋白原、Ｄ一二聚体水平等。 （２）多部位骨髓穿刺：至少包括髂骨，若髂骨骨髓增生不 良，应进行胸骨穿刺。骨髓涂片分析：造血组织增生程度； 粒、红、淋巴细胞形态和不同阶段百分比；巨核细胞数目和形 态；／Ｊ、粒造血细胞面积；是否有异常细胞等。 （３）骨髓活检：至少取２ ｃｍ骨髓组织（髂骨）标本用以评 估骨髓增生程度、各系细胞比例、造血组织分布情况，以及是 否存在骨髓浸润、骨髓纤维化等。 （４）肝功能：特别是血清胆红素（直接、问接）水平及血 清乳酸脱氢酶水平。 （５）肾功能、甲状腺功能、电解质以及病毒学检查（包括 肝炎病毒、ＥＢＶ、ＣＭＶ等）。 （６）血清叶酸和维生素Ｂ１２水平。 （７）尿常规检查及尿含铁血黄素试验（实际检测的是脱 落的肾小管上皮细胞中的含铁血黄素）。 （８）风湿免疫性疾病相关抗体。 （９）血清ＥＰＯ水平。 （１０）细胞遗传学：常规核型分析，必要时进行荧光原位 杂交（ＦＩＳＨ）以及遗传性疾病筛查（儿童或有家族史者推荐 做染色体断裂试验）。 （１１）血浆游离血红蛋白和结合珠蛋白水平。 （１２）特异性补体溶血试验：Ｈａｍ试验、糖水试验、蛇毒因 子溶血试验、微量补体敏感试验，这些试验敏感度和特异度 均不高。 （１３）流式细胞术检测外周血成熟红细胞和成熟粒细胞 ＣＤ５５和ＣＤ５９有无缺失：目前已经发现了２０余种蛋白在 ＰＮＨ患者血细胞表面表达缺乏，如衰变加速因子（ＤＡＦ， ＣＤ５５）、反应性溶血膜抑制物（ＭＩＲＬ，ＣＤ５９）、Ｃ８结合蛋白 （ＨＲＦ）、内毒素受体（ＣＤｌ４）、低亲和力Ｆｃ受体（ＣＤｌ６）及尿 激酶型纤溶酶原激活剂受体（ｕＰＡＲ，ＣＤ８７）等。应用流式细 胞术检测ＧＰＩ锚连蛋白缺失细胞数量是诊断ＰＮＨ最直接、 最敏感的方法。ＰＮＨ克隆累及造血细胞依次为粒细胞、单核 细胞、红细胞、淋巴细胞，骨髓ＰＮＨ克隆出现比外周血早，网 织红细胞略早于成熟红细胞。建立ＰＮＨ诊断至少有一系及 以上细胞的两种ＧＰＩ锚连蛋白缺失。ＣＤ５９敏感度要高于 ＣＤ５５，ＣＤ５９一粒细胞可最早被检出，有早期诊断价值，且不受 输血影响。对ＰＮＨ克隆锚连蛋白的不同缺失程度进行量 化，可以对ＰＮＨ进行分型，以便进一步了解并监测病情进展
PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读
做20~30份正常人血样划定阳性区（Ⅰ区）范 围 同型阴性对照界定Ⅲ区范围， 中间的区域即为Ⅱ区。
根据CD59可以将PNH细胞分为3型 1型细胞 CD59完全阳性 正常细胞 2型细胞 CD59部分阳性 补体中度敏感 细胞 3型细胞 CD59完全阴性 补体敏感细胞
意义
PNH 克隆见于淋巴增殖性疾病
检测病种 NHL HD CLL ALL HCL 例数 87 55 红细胞 CD55/CD59 49 缺失检率 9.2% 22 4
(Hematol J 2001，2: 33)
PNH克隆见于浆细胞病
检测红细胞 CD55/CD59 缺失
病种 检测例数 MM 62 WM 7 MGUS 6 HCD 2 合计 77 缺失例数 (%) 6 2 1 1 10 (12.9%)
(Int J Hematol 2002, 75 :40)
FLAER
嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。 1998年Diep等报道嗜水气单胞菌(HEC)毒 素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合， 随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质 双层，在膜上形成孔洞致溶破。 PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细 胞完好。
李智伟
PNH
(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)
是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾 病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南 方。半数以上发生在20-40岁青壮年。男性 多于女性，与遗传及种族无关。本病起病隐 袭缓慢，呈慢性过程，以贫血、出血为首发 症状者较多，以血红蛋白尿起病者较少。
相当密切，可以相互转化且并存 AA→PNH较多(15%)，PNH→AA少 20%`~30% PNH可伴骨髓再障 AA(ATG治疗后)→PNH 10~31% AA-PNH综合征 16.5%(我国) 50%AA外周血或骨髓可检出PNH克隆 AA→PNH 生存率要高于PNH→AA MDS-RA 如捡出PNH克隆者预后好，且ATG(人胸 腺细胞免疫球蛋白)治疗有效。 PNH对AA和MDS的“自然治疗”，而“AA救了 PNH” 。
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的诊断指南(流式细胞术)
流式细胞术诊断并监测阵发性睡眠性血红蛋白尿症和相关疾病指南背景：阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种特殊的获得性克隆性造血干细胞疾病，该疾病是由于PIGA基因体细胞突变，导致连接细胞膜的GPI相关锚蛋白缺失所致。
流式细胞术是检测GPI相关锚蛋白缺失的方法之一，同时也是诊断PNH所必需的检测指标。
然而到目前为止，对于运用流式细胞术检测GPI相关锚蛋白缺失方法还没有标准化、规范化。
方法：在本论文中，我们将提出一致方案，介绍运用流式细胞术检测PNH的规范程序。
结果：我们通过临床症状和对数据的分析、结果报告对病例提出综合意见。
但分析中，主要集中在对分析过程的重要性。
本文将区分常规分析（定义为：缺失细胞占1％或更多）和高灵敏度的分析（缺失细胞仅占小于0.01％的PNH细胞）。
其中如何设计抗体组合和设门对这两种分析都是非常重要的，本文将做详细介绍。
我们将通过对白细胞和红细胞的检测，以及各自的检测优势来讨论并评估PNH患者人群。
我们目前提供的步骤仍需要进一步完善，使其成为高灵敏度的检测技术，包括需要明确：试剂浓度；PNH克隆细胞在正常人群的发生率（背景），并讨论此技术的缺点，因为此缺陷将可能影响到结果解释。
结论：本论文可适用于对PNH感兴趣和刚开始建立检测PNH克隆细胞的实验室，使其建立一个比较完善的实验流程；也可用于已开展此检测项目，以提高其该实验室检测技术和报告水平。
背景阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是一种罕见的造血干细胞疾病，该疾病自19世纪初即被确认为一个具有独特临床症状的疾病（1,2）。
在疾病的发展过程中，PNH有三个显着的临床特点，但是这三个特点的个体差异很大（3-5）。
首先，以补体介导的血管内溶血为主要临床表现，包括：吞咽困难，嗜睡，勃起功能障碍（ED），慢性肾功能衰竭，肺动脉高压，贫血，和血红蛋白尿。
其次，具有形成血栓的倾向，该血栓不仅可发生在四肢，还好发于具有特殊部位，如肝门（Budd - Chiari综合征），脾，肠系膜静脉。
高灵敏pnh检测内容
高灵敏pnh检测内容1.引言1.1 概述概述部分：高灵敏PNH检测的背景和意义PNH，即原发性免疫性血红蛋白尿症（Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria），是一种罕见的血液系统疾病。
患者的红细胞表面缺少CD55和CD59两种补体调节蛋白，导致对自体免疫攻击的敏感性增加，从而引发一系列的有损红细胞的反应，如溶血、血栓形成等。
此病主要表现为夜间的血红蛋白尿，伴随着贫血和血栓的临床现象。
高灵敏PNH检测就是在患者的血液样本中，通过对红细胞进行特定的免疫分析方法，检测CD55和CD59在红细胞表面的表达情况，进而确定患者是否患有PNH，以及对疾病的监测和评估。
与传统的PNH诊断方法相比，高灵敏PNH检测具有更高的准确性和敏感性，可以有效地早期发现PNH的存在，为患者提供更早的治疗和干预机会。
高灵敏PNH检测的意义在于提供了一种可靠的手段来诊断和监测PNH疾病。
通过该检测方法，可以在患者还未出现明显症状之前，及时发现PNH的存在，从而提前采取必要的治疗措施。
此外，高灵敏PNH检测还可以帮助医生评估疾病的严重程度和进展情况，为制定个体化的治疗方案提供依据。
对于PNH患者及其家属来说，高灵敏PNH检测可以提供一种心理上的安慰，让他们更好地了解疾病，并采取积极的态度面对治疗和康复。
随着科技的发展和研究的深入，高灵敏PNH检测方法和技术也在不断更新和完善。
相信在未来，高灵敏PNH检测能够为PNH疾病的早期发现和治疗提供更加精准和可靠的手段，为患者的健康带来更大的福祉。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以根据具体情况进行编写，以下是一个示例：文章结构:本文主要分为引言、正文和结论三部分。
引言部分概述了文章的背景和意义，介绍了本文的结构和目的。
正文部分包含了高灵敏pnh检测的背景和意义，以及相关的方法和技术。
结论部分对高灵敏pnh检测的重要性进行总结，并展望了其未来的发展。
引言部分将为读者提供一个整体的了解。
阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的诊断指南(流式细胞术)
流式细胞术诊断并监测阵发性睡眠性血红蛋白尿症和相关疾病指南背景：阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种特殊的获得性克隆性造血干细胞疾病，该疾病是由于PIGA基因体细胞突变，导致连接细胞膜的GPI相关锚蛋白缺失所致。
流式细胞术是检测GPI相关锚蛋白缺失的方法之一，同时也是诊断PNH所必需的检测指标。
然而到目前为止，对于运用流式细胞术检测GPI相关锚蛋白缺失方法还没有标准化、规范化。
方法：在本论文中，我们将提出一致方案，介绍运用流式细胞术检测PNH的规范程序。
结果：我们通过临床症状和对数据的分析、结果报告对病例提出综合意见。
但分析中，主要集中在对分析过程的重要性。
本文将区分常规分析（定义为：缺失细胞占1％或更多）和高灵敏度的分析（缺失细胞仅占小于0.01％的PNH细胞）。
其中如何设计抗体组合和设门对这两种分析都是非常重要的，本文将做详细介绍。
我们将通过对白细胞和红细胞的检测，以及各自的检测优势来讨论并评估PNH患者人群。
我们目前提供的步骤仍需要进一步完善，使其成为高灵敏度的检测技术，包括需要明确：试剂浓度；PNH克隆细胞在正常人群的发生率（背景），并讨论此技术的缺点，因为此缺陷将可能影响到结果解释。
结论：本论文可适用于对PNH感兴趣和刚开始建立检测PNH克隆细胞的实验室，使其建立一个比较完善的实验流程；也可用于已开展此检测项目，以提高其该实验室检测技术和报告水平。
背景阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是一种罕见的造血干细胞疾病，该疾病自19世纪初即被确认为一个具有独特临床症状的疾病（1,2）。
在疾病的发展过程中，PNH有三个显着的临床特点，但是这三个特点的个体差异很大（3-5）。
首先，以补体介导的血管内溶血为主要临床表现，包括：吞咽困难，嗜睡，勃起功能障碍（ED），慢性肾功能衰竭，肺动脉高压，贫血，和血红蛋白尿。
其次，具有形成血栓的倾向，该血栓不仅可发生在四肢，还好发于具有特殊部位，如肝门（Budd - Chiari综合征），脾，肠系膜静脉。
流式细胞术检测CD55及CD59对诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿的意义
常细胞相对减少，也会影响结果[6]。流式 细胞仪和抗 CD55、CD59 单克隆抗体直
细胞表面分子，故异常血细胞膜上 GPI 2.1 CD55 和 CD59 的表达率 对照组 接检测和计数 PNH 患者细胞膜有缺陷
生成障碍，导致 PNH 患者血细胞膜上 中性粒细胞 CD55 绝大部分表达为阳性， 的异常细胞，可大大减少上述因素的影
龄差异均无统计学意义（均 ＞ 0.05）。 1.2 试剂 鼠抗人 CD55 抗体-荧光素 3 讨论
测中性粒细胞 CD55 －、CD59 －和红细胞 CD59 －均大于 5%。有学者认为，此类患
异硫氰酸酯、鼠抗人 CD59 抗体-荧光素
CD55 又称为衰变加速因子，可加速 者虽然有关 PNH 的溶血试验阴性，但与
提示本方法对pnh的病情评综上所述cd55cd59抗原的检测提高了pnh克隆的检出率不但使典型pnh的诊断更加可靠也可使无典型血红蛋白尿发作的亚临床型pnh得以明和cd59抗原检测j中华血液学杂志摘要目的观察原发性肝癌phc患者血清乙肝病毒hbv感染状况及hbvdna水平
现代实用医学 2011 年 5 月 第 23 卷 第 5 期
1 资料与方法
达，中性粒细胞和红细胞 CD59 呈阴性 率均超过 5%，结合文献超过 5%为异常[5]，
表达。见表 1。
检出率为 100%。另 4 例临床从无血红
1.1 一般资料 9 例 PNH 患者，均符合 2.2 不同病情 PNH 患者的 CD55 和 蛋白尿，外周血细胞、白细胞和血小板无
参考文献[3]诊断标准。其中男 5 例，女 CD59 表达率 将 PNH 患者按病情分为 减少，上述糖水溶血试验、酸溶血试验和
[3] 张振萍,刘建华,李红.尿微量蛋白的联合 检测对糖尿病肾损伤早期诊断的价值[J]. 国际检验医学杂志, 2007, 28（1）:88-89.
流式细胞术在临床中的应用
GPI锚定蛋白测定
• 阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）的过去常用 诊断灵敏较低，有30%以上的患者呈阴性反应。 我们采用流式细胞术分析红细胞和白细胞膜 CD55,CD59分子的表达量和计数可以将灵敏度提 高到99%。
参考值 • 红细胞CD55,CD59 阳性率>95% • 粒细胞CD55,CD59 阳性率>95% 临床意义 • PNH诊断的金标准 • 可用于贫血患者的诊断和鉴别诊断 • 检测病情进展状况，判断疗效
白血病和淋巴瘤的免疫分型
免疫分型检测意义
• • • • • • 鉴别急性白血病淋髓系列 区分亚型 诊断双表型/混合细胞型 提高恶性血液病诊断与分型的准确性。 确定白血病细胞的阶段 敏感性高于形态学及染色体， 但低于基因。 • 比染色体及基因分析快速。
标本要求：单细胞悬液
标本类型 • PB • BM • 各种体液（如尿液、脑脊液、胸腔积液、腹水） • 各种灌洗液 • 其他组织穿刺标本
液体标本采集及保存：采集后EDTห้องสมุดไป่ตู้或 肝素抗凝，室温保存，6h内送检。
流式细胞术在科研中的应用
• 细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 • 凋亡检测 • 细胞因子的测量等
谢谢！
检测淋巴细亚群的胞临床意义
一般认为循环中淋巴细胞数目及比例变化是免疫 功能紊乱甚至缺陷的重要特征，会造成很多疾病的发 生发展。 自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮；1型糖尿病
内分泌系统疾病： 2型糖尿病 ； 儿科常见疾病：病毒性心肌炎 ；反复呼吸道感染； 急性肾小球肾炎 ； 血液系统与肿瘤：再生障碍性贫血 ； 肿瘤 呼吸系统疾病：病毒感染时，CD8+T 数目明显增多
HLA-B27检测
• HLA-B27是与强直性脊柱炎（AS）密切相关的基因。 利用流式细胞术检测HLA-B27抗原具有灵敏度高， 特异性强，结果准确、客观等优势。
PNH的名词解释
PNH的名词解释PNH，即“阵发性夜间血红蛋白尿症”（Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria）是一种罕见的遗传性血细胞疾病。
它的特点是患者的红细胞因体内缺乏特殊的膜蛋白，被免疫系统攻击并破坏，导致血红蛋白泄漏至尿液中，最终导致溶血性贫血等一系列临床表现。
一、PNH的病因PNH是由一种称为“PIGA基因突变”的遗传缺陷引起的。
通常情况下，PIGA基因在骨髓造血细胞分裂过程中会产生一个蛋白，它负责让其他蛋白附着在细胞膜上。
然而，PNH患者的PIGA基因出现突变，导致无法产生这个蛋白，细胞膜失去了固定其他重要蛋白的功能，包括一种称为“糖脂酰磷酰肌醇（GPI）锚”的蛋白，而GPI锚被认为是保护红细胞免受免疫系统攻击的关键。
二、PNH的临床表现PNH的临床表现因患者的骨髓受累程度和溶血程度的不同而有所差异。
其中最典型的症状是阵发性的夜间血红蛋白尿。
正常情况下，健康人的尿液是无色的，而PNH患者在清晨醒来后尿液中会发现红色的血尿，这是由于夜间红细胞破坏导致血红蛋白泄漏所致。
此外，PNH患者还可能出现疲劳、气短、黄疸、腹痛、贫血等症状。
在严重的情况下，溶血性危象可能会导致肾功能受损、衰竭甚至死亡。
三、PNH的诊断和治疗PNH的诊断主要依靠实验室检查，如高灵敏度流式细胞术、凝集素试验等。
其中高灵敏度流式细胞术是目前准确诊断PNH的最标准方法，可以对血细胞膜上的GPI锚进行检测。
在治疗方面，随着研究的不断进展，一些新的治疗手段逐渐展现出潜力。
包括单克隆抗体疗法、免疫调节剂等。
然而，由于PNH是一种罕见病，治疗方法还相对有限，且目前并无根治之法。
四、PNH对患者的影响及应对策略PNH的患者在日常生活中面临着许多不便和困扰。
贫血导致的疲劳和体力下降会影响到工作和生活质量。
溶血危机可能随时发生，给患者和家人带来心理负担。
因此，对于PNH患者来说，积极的心态和健康的生活方式是非常重要的。
在医生的指导下，患者可以适当运动、合理饮食、保持充足的睡眠以及避免潜在的致病因素。
阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊疗指南【2019版】
88.阵发性睡眠性血红蛋白尿症概述阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一种后天获得性溶血性疾病。
该病源于造血干细胞PIG-A 基因突变引起一组通过糖肌醇磷脂（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚连在细胞表面的膜蛋白的缺失，导致细胞性能发生变化。
异常细胞缺乏GPI 连接蛋白，从而对补体敏感，也因而引起相应的临床现象。
血管内溶血、潜在的造血功能衰竭和血栓形成倾向是其3 个主要临床表现。
病因和流行病学PNH 病因在于PIGA 基因发生体细胞突变，其编码蛋白产物糖基转移酶，是糖磷脂酰肌醇锚连蛋白（GPI）生物合成过程所必需的。
GPI 是可锚连多种功能性蛋白的膜结合蛋白，PIGA 突变造成PNH 克隆，其部分或全部糖基转移酶功能丧失，最终导致GPI 锚连的所有蛋白部分或全部丢失。
在细胞膜构成GPI 锚连蛋白中CD55（衰变加速因子，DAF）和CD59（反应性溶解膜抑制物，MIRL）属于补体抑制蛋白。
CD55 和CD59 缺乏导致补体介导的血管内溶血是PNH 的特征。
尽管干细胞PIGA 基因突变导致所有造血干细胞的全部GPI 锚连蛋白（GPI-Aps）丢失，但仍无明确的证据证明除了CD55 和CD59 外，仅GPI-Aps 缺陷即可导致PNH 临床病理过程。
除补体介导的血管内溶血，PNH 其他主要临床表现是骨髓衰竭和血栓。
尽管PIGA 体细胞突变和PNH 溶血关系明确，但PIGA 突变（导致GPI-Aps 缺陷）与PNH 骨髓衰竭及血栓之间关系仍然只是推测。
PNH 是一种获得性疾病，没有先天发病的报道（先天性CD59 缺乏除外），也没有家族聚集倾向。
PNH 发病率在西方国家为（1～2）/100 万人口/年，标化人口为1.3/100 万人口/年。
在我国牡丹江地区曾作长期调查，据1994 年报道标化发病率为2.7/10 万人口。
阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者3种GPI锚定蛋白表达的改变
阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者3种GPI锚定蛋白表达的改变白霞;高维强;王兆钺;李玉云;朱明清;阮长耿【期刊名称】《苏州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2003(023)002【摘要】目的比较阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者血细胞表面3种糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白表达情况.方法流式细胞术检测25例PNH患者粒细胞表面GPI锚定蛋白CD55、CD59和CD87的表达水平,并分析它们在不同疾病状态下的改变.结果 PNH患者粒细胞表面3种GPI锚定蛋白间具有较好的相关性(P均<0.05),红细胞表面CD55和CD59也表现出相关(P<0.01),但与粒细胞表面CD55和CD59的缺乏情况并不一致.结论 PNH患者同一系血细胞表面GPI锚定蛋白呈平行关系,这有助于对PNH发病机制的进一步了解.【总页数】3页(P182-184)【作者】白霞;高维强;王兆钺;李玉云;朱明清;阮长耿【作者单位】苏州大学附属第一医院,江苏省血液研究所,苏州,215006;苏州大学附属第一医院,江苏省血液研究所,苏州,215006;苏州大学附属第一医院,江苏省血液研究所,苏州,215006;苏州大学附属第一医院,江苏省血液研究所,苏州,215006;苏州大学附属第一医院,江苏省血液研究所,苏州,215006;苏州大学附属第一医院,江苏省血液研究所,苏州,215006【正文语种】中文【中图分类】R556.64【相关文献】1.胃肠病患者针灸治疗前后蛋白表达改变 [J], 孙正基;丁宇;张忠;高艳红2.干细胞缺陷性疾病患者两种GPI-锚蛋白表达及临床意义 [J], 黎纬明;李菁媛;邹萍;游泳;陈智超3.双相障碍患者HPA轴改变与血清蛋白表达谱差异研究 [J], 程宇航;谢静;何山;田玉洁;马征;李文标4.GPI锚定蛋白检测诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症的临床价值 [J], 段秀梅;车媛媛;谭岩;方艳秋;许淑芬;刘磊;孙牧男5.冠心病患者外周血单个核细胞基质金属蛋白酶9/组织型金属蛋白酶抑制剂1及磷酸化c-Jun蛋白表达改变与冠状动脉病变特征的相关性 [J], 张绍洁;吴黎明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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其它细胞的PNH检测
PNH患者的红细胞、粒细胞、单核细胞 及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白部分或全部 丧失。 粒细胞>单核细胞>淋巴细胞>红细胞 骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红 细胞略早于红细胞
其它细胞的PNH检测
应用FSC/SSC设门分析时会有许多脱颗粒 的中性粒细胞，这时只使用物理特征无法 准确设定粒细胞门了，这时必须使用系列 标志/SSC设门:CD15，CD33 。 CD64设门，分析单核CD14,CD55,CD59， PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分 辨 不能只根据淋巴细胞上GPI相关蛋白的表 达来诊断。
粘附分子 淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3或CD58)、 Blast-1/ CD48、CD67、CD66。
GPI锚连接蛋白
酶类 红细胞乙酰胆碱脂酶 ( AchE )、中性粒细胞碱性磷 酶酸酶 ( NAP )、5’外核酸酶 ( CD 73 )。 受体类 中性粒细胞III型Fc受体 ( FcRIIIb 或CD16 )、单核细 胞分化抗原 ( CD14 )、尿激酶型纤溶酶原激活物受 体 ( u-PAR )。 血型抗原 CD55 携带的Comer抗原、AchE携带的 Yt抗原。
做20~30份正常人血样划定阳性区（Ⅰ区）范 围 同型阴性对照界定Ⅲ区范围， 中间的区域即为Ⅱ区。
根据CD59可以将PNH细胞分为3型 1型细胞 CD59完全阳性 正常细胞 2型细胞 CD59部分阳性 补体中度敏感 细胞 3型细胞 CD59完全阴性 补体敏感细胞
意义
流式细胞术
原理： X染色体上PIG-A（造血干细胞经获得性 体细胞基因）突变 导致糖化肌醇磷脂(GPI)锚合成障碍 导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白 丢失，包括CD16、CD55、CD59等
GPI锚连接蛋白
补体调接蛋白 衰变加速因子(DAF或CD55)、膜攻击复合物抑 制因子(MACIF或M膜辅助蛋白(MCP)。
PNH 克隆见于淋巴增殖性疾病
检测病种 NHL HD CLL ALL HCL 例数 87 55 红细胞 CD55/CD59 49 缺失检出率 9.2% 22 4
(Hematol J 2001，2: 33)
PNH克隆见于浆细胞病
检测红细胞 CD55/CD59 缺失
病种 检测例数 MM 62 WM 7 MGUS 6 HCD 2 合计 77 缺失例数 (%) 6 2 1 1 10 (12.9%)
具有PNH克隆的血液病
检测粒细胞GPI 锚连蛋白表达
病种 AA MDS 检测例数 115 39 缺失例数( % ) 25 ( 22 % ) 9 ( 23% )
并发现 MDS有 PNH表达者 ATG（人胸腺细胞免 疫球蛋白）治疗有效
( An Intern Med 1999，131: 401 )
PNH和AA关系
1型细胞 CD59完全阳性
补体激活途径
Ag-Ab
C1
C1
经典途径
C4b2b (C3转化酶）
C2,C4
CD55
C3b
C3 P （备解素） PC3bBb
替代途径
C3bB
(C5转化酶） C4b2b3b或PC3bBb
CD59
C8 C9
C6C7
C5 C5b C5b678 C5b-9 (MAC)
分析
1.红系及粒系FSC/SSC设门 报告标本中CD55、CD59阴性比例
(Int J Hematol 2002, 75 :40)
FLAER
嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。 1998年Diep等报道嗜水气单胞菌(HEC)毒 素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合， 随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质 双层，在膜上形成孔洞致溶破。 PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细 胞完好。
CD55和CD59同时部分或完全缺失是 PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。 CD59重要性大于CD55 单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补 体的敏感性而造成溶血 CD59的缺失会增加补体的敏感性 临床上以CD59缺失作为诊断标准是一个 趋势。 解决了一切以补体溶血为基础的实验诊断 方法在诊断PNH的不确定性
FLAER
FLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞 上都有特异性表达，所以正常人及非 PNH贫血FLAER成100%阳性。 是目前诊断PNH最敏感、特异的方法。
FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%， 其它靶向标记检出率的敏感性为1%；
结果分析
1.设门 CD45/SSC 2.标记CD15，CD14，CD45，FLAER 检测PNH粒、单核及淋巴细胞，报告 标本中各系细胞FLAER阴性比例
相当密切，可以相互转化且并存 AA→PNH较多(15%)，PNH→AA少 20%`~30% PNH可伴骨髓再障 AA(ATG治疗后)→PNH 10~31% AA-PNH综合征 16.5%(我国) 50%AA外周血或骨髓可检出PNH克隆 AA→PNH 生存率要高于PNH→AA MDS-RA 如捡出PNH克隆者预后好，且ATG(人胸 腺细胞免疫球蛋白)治疗有效。 PNH对AA和MDS的“自然治疗”，而“AA救了 PNH” 。
FLAER
目前FLAER一般用于有核细胞的检测，不 能评价红细胞的PNH克隆。 由于红细胞表面没有气单胞菌溶素前体产 生所需要的蛋白水解酶类，尽管表达在红 细胞表面的血型糖蛋白不是锚连蛋白，但 是由于血型糖蛋白与气单胞菌溶素前体结 合力较弱，因此限制了FLAER在红细胞中 的应用。
与CD55、CD59比较，Flaer对PNH患者 对中性粒细胞的测定最为清晰、准确 临床上高度怀疑，而CD55、CD59不能 确诊的病例，可以结合F1aer检查，获得 明确诊断
血红蛋白尿
睡眠有关，早晨较重，下午较轻 尿液外观为酱油或红葡萄酒样; 伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、发热等
原因
因为补体作用最适宜的pH是6.8～7.O， 而睡眠时呼吸中枢敏感性降低，酸性代谢 产物积聚
研究历史
Strubing第一次报道PNH Ham 和Dingle 证明了PNH 患者的红细 胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就 是现在普遍使用的Ham 实验 1983年证实PNH患者GPI合成异常 1993年pig-a基因突变
与其他实验比较
1.酸溶血试验(Ham试验) 患者红细胞与含5%盐 酸的正常同型血清混合，pH6.4，37℃孵育 2小时，溶血明显。本试验特异性高，敏感 性差。 2.蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替 途径，使补体敏感的红细胞发生溶血。本试 验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。 3.热溶血试验和蔗糖溶血试验 因特异性差，常 作为筛选方法。
李智伟
PNH
(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)
是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾 病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南 方。半数以上发生在20-40岁青壮年。男性 多于女性，与遗传及种族无关。本病起病隐 袭缓慢，呈慢性过程，以贫血、出血为首发 症状者较多，以血红蛋白尿起病者较少。