抗血清制备原理、步骤及应用

抗血清制备原理、步骤及应用

抗血清是一种含有高效价特异性抗体的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。通过注射抗血清可以传递被动免疫治疗许多疾病。

一、抗血清制备原理：

将抗原注射于动物体，将引起免疫应答。可刺激动物的淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体，待血清中积累大量抗体时，采集动物血液并分离析出血清，此即含抗体的免疫血清（抗血清）。抗血清包括抗细菌、抗毒素、抗病毒血清。

二、抗血清制备步骤：

1、选择免疫动物

➢免疫动物一般选择青壮年期、健壮雌性个体。

➢抗原与免疫动物的种属差异越远越好。

➢针对不同性质的免疫原选择相应的动物。

➢制备H血清用马，制备R血清用兔，制备补体用豚鼠血清。

２、抗原制备

➢抗原剂量：用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/mL，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。

➢免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。通常小鼠首次抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100～1mg/次，合成免疫原为2mg（半抗原约

为20～200μg），一般需要与等量的福氏完全佐剂混合。加强免疫原与福氏不完全佐剂混合或不用免疫佐剂，剂量为首次计量的1/2。

➢抗原乳剂的配制：将等量的佐剂与抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，形成油包水乳剂。制成的油包水乳剂直接影响免疫效果，因此使用前需进行质量检查。检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整不分散，不合格的乳剂立即扩散，水面油亦逐渐扩大。若检查不合格，则须继续操作至质量合格为止。

３、确定免疫方案

➢根据免疫目的的要求、抗原性质、佐剂种类来制定免疫方案。可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。免疫接种途径通常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、淋巴结等接种途径，对抗原的吸收速度为静脉=腹腔=淋巴结＞肌肉＞皮下＞皮内。若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。免疫接种剂量应根据分子量大小、免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间决定。

➢免疫间隔时间：第一次与第二次免疫的时间间隔一般以10～20天为佳，二次以后间隔时间一般为7～10天。

４、免疫动物（常规免疫方法–皮内多点注射）

➢第一次免疫：剂量为每只兔子注射1.0mL抗原乳剂（含抗原量1～2mg）。注射部位为两只后脚掌的皮内各注射0.2mL，其余0.6mL分多点注入脊椎二侧、颈部、腹股沟和腋窝等处淋巴结附近部位皮内，每点可注入0.05mL，分12次注入。

➢第二次免疫：初次免疫后20天左右，剂量为1.0mL/只，加福氏不完全佐剂。注射部位在腹部皮下多点注射，每点注入0.1mL。

➢第三次免疫：二次免疫7～10天后，注射部位和剂量同第二次免疫。

➢试血：末次免疫5～7d后，抽取少许静脉血，分离血清后进行试血。采用免疫双扩散法测定效价在1:16以上即可放血，若效价较低，可继续加强免疫。

５、采血分离血清

➢放血：放血前动物应停食12h，如拟保留该免疫动物，可直接由心脏取血或切开耳缘静脉滴血或心脏穿刺取血。取血后由静脉缓缓注入等量5%葡萄糖溶液以补充失血量。取血的动物经2～3个月休息，可再次加强免疫后取血；如拟一次放血致死，可用颈动脉放血的方法。

➢分离血清：在无菌条件下，待血液自然凝固后，静置4℃冰箱，待血清析出后，经离心沉淀分出血清。

6、抗血清的鉴定与保存

➢抗体特异性鉴定：鉴定方法常采用双向免疫琼脂扩散技术。

➢血清抗体效价测定：测定方法常用的是放射免疫法和免疫双扩散法。

➢抗体纯度鉴定：采用SDS-PAGE法进行纯度鉴定。

➢抗血清的纯化：常见的纯化方法是提取特异性IgG。特异性IgG抗血清制备：首先用硫酸铵或硫酸钠盐析法粗提丙种球蛋白，再进一步纯化。粗提法提取γ球蛋白：采用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法，硫酸铵盐析法须经多次沉淀，经三次提取后的γ球蛋白大多属于IgG。

➢抗血清的保存：将鉴定合格后的抗血清，以1:100的比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其最后浓度分别为0.01%或0.05%。用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装约1mL，置于4℃保存，可保存3个月～6个月；-70℃～-20℃保存可保存2～3年；真空冰冻干燥保存，可保存4～5年。

三、实验流程图

四、主要仪器试剂

➢抗原与免疫对象：抗原、健康家兔。

➢试剂：生理盐水、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、注射器、石炭酸、防腐剂(1%的硫柳汞或5%的叠氮钠)等。

➢设备与器材：剪刀、镊子、注射器等器材和冰箱、离心机等设备。

五、注意事项：

(1)动物的免疫反应存在个体差异，因此制备血清时，应同时免疫3～4只。

(2)为制备单价特异性高的抗血清，所用抗原纯度越高越好，因此在纯化抗原过程中应尽可能除去可能存在的杂蛋白。

(3)要制备高效价的抗体，必须要加佐剂，但若抗原中存在杂蛋白，则可能因佐剂的存在而产生非特异性的抗体，所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂。

(4)制成的抗原乳剂是否为油包水乳剂应进行检查，否则会影响免疫效果，若不是油包水乳剂，应重新制备。

(5)当抗原量过少不易提纯时，可采用抗原抗体在琼脂扩散中形成的沉淀线直接免疫动物制备抗体。

(6)抗血清效价一般以抗血清稀释倍数表示。血清效价检测方法很多，灵敏度各不同，在表示抗血清效价时，应注意标明检测方法。

(7)分装保存的抗血清应标明抗血清的名称、效价、制备日期以及包装量。

六、抗血清的应用

1)疾病的紧急预防与治疗：当动物接种相应抗血清后，机体迅速得到大量非自身免疫抗体，从而快速中和侵入人体的病原，如抗猪瘟血清能有效控制猪瘟的疫情，抗犬瘟热血清对犬瘟热有独特的疗效。

2)疾病诊断和病原鉴定：血清学诊断方法在疾病诊断和病原鉴定中具有十分重要的地位，其中采用高效价特性的抗血清（阳性血清）作为反应的诊断物是血清学诊断方法的重点。如口蹄疫细胞中和试验性血清、日本血吸虫病凝集试验阳性血清、衣原体病间接血凝试验阳性血清等。

3)抗血清还可用于微生物的鉴定、抗原的分析、免疫球蛋白的鉴定以及其他蛋白质的鉴定与研究。