大肠杆菌发酵经验总结

⼤肠杆菌发酵经验总结
⼤肠杆菌发酵经验总结
⾸先，补料速率与⽐⽣长速率直接影响着⼄酸的⽣成速率和积累量（主要是补料速率与⽐⽣长速率影响发酵液中的残糖量，进⽽影响），所以适当的控制补料速率和⽐⽣长速率，对于控制⼄酸的量有很好的效果。

其次，必须要保证充⾜的溶氧，并严格控制pH值，⽽且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋⽩的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所⽣产出的蛋⽩⼤多是有活性的，⽽较⾼的发酵温度下产⽣的蛋⽩⼤多⼀包涵体形式存在。

第三，选取合理的诱导时间⾮常重要，⼀般的诱导时间选在指数⽣长后期，⽽且诱导时的⽐⽣长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速⽣长期与蛋⽩合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋⽩的⾼表达；2.已经得到了⼤量的菌体，⽽且菌体的⽣物量基本接近稳定，不论是从动⼒学⾓度，还是能耗，物料成本⽅⾯，都⽐较合理。

第四，补料过程中的碳氮⽐也很重要。

若氮源过⾼，会使菌体⽣长过于旺盛，pH偏⾼，不利于代谢产物的积累，氮源不⾜，则菌体繁殖量少从⽽影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体⽣长，碳源不⾜，则容易引起菌体的衰⽼和⾃溶。

另外，碳氮⽐不当还会引起菌体按⽐例的吸收营养物质，从⽽直接影响菌体的⽣长和产物的合成。

根据⾃⼰的经验，⼀般情况下，对于⼀个稳定的发酵⼯艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，⽽且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮⽐不合理造成的。

可以适当调整碳氮⽐。

⼤家讨论得较多的是关于代谢副产物⼄酸对⼤肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下⼏点，并作出相应解决措施。

⼀、代谢副产物-⼄酸
⼄酸是⼤肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多⼤的浓度下产⽣抑制作⽤各种说法不⼀，⼀般认为在好⽓性条件下，5～
10g/L 的⼄酸浓度就能对滞后期、最⼤⽐⽣长速率、菌体浓度以及最后蛋⽩收率等都产⽣可观测到的抑制作⽤。

当⼄酸浓度⼤于10或20g/L 时，细胞将会停⽌⽣长，当培养液中⼄酸浓度⼤于12g/L 后外源蛋⽩的表达完全被抑制。

预防⼄酸产⽣的措施：
1、通过控制⽐⽣长速率来减少⼄酸的产⽣：
⽐⽣长速率越⾼，⼄酸产⽣越多，当⽐⽣长速率超过某个值时，⼄酸开始产⽣。

可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等⽅法来降低⽐⽣长速率。

2、透析培养：
在⼤肠杆菌的培养过程中可以⽤透析技术除去发酵液中的有害物质，降低⼄酸含量从⽽实现重组菌的⾼密度发酵和产物的表达。

3、控制葡萄糖的浓度：
葡萄糖是⼤肠杆菌发酵过程中重要的碳源之⼀，⽤其作碳源是要将其控制在⼀个较低的⽔平上，以减少⼄酸的产⽣。

常⽤的控制⽅法主要有：
恒pH法：⼤肠杆菌会代谢葡萄等产⽣⼄酸，使pH 值下降。

因此可通过pH值的⾼低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。

恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到⼀定程度时菌体代谢下降，消耗氧能⼒下降，溶氧上升。

因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在⼀定的⽔平。

⼆、温度
⼤肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体⽣长时，⽐增长速率将会增⼤。

随温度上升细菌代谢加快，其产⽣代谢副产物也会增加。

这些副产物会对菌体的⽣长产⽣⼀定的抑制作⽤。

菌体⽣长过快也会影响质粒的稳定性。

降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和⽣长速率都会下降。

同时也减少了有毒代谢副产物的产⽣和代谢热的产⽣。

有时降低温度更有利于⽬的蛋⽩的正确折叠及表达。

在重组⼤肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不同，为了能获得⼤量的⽬的蛋⽩，⾸先要保证菌体的量，因此在前期可优先考虑菌体的⽣长，到诱导阶段应将⽬的产物的表达放在⾸位。

三、培养⽅式
微⽣物的培养⽅式主要有分批、连续和补料分批3种。

⼤肠杆菌发酵⼤多采⽤补料分批培养，这是在现代发酵⼯艺得到优化的⼀种⽅式，能有效的优化微⽣物培养过程中的化学环境。

使微⽣物处于最佳的⽣长环境。

这种⽅式⼀⽅⾯可以避免某些营养成
分初始浓度过⾼出现底物抑制现象，另⼀⽅⾯能够防⽌限制性营养成分被耗尽⽽影响细胞的⽣长和产物的形成。

补料分批培养已⼴泛应⽤于各种各样的初级、次级⽣物产品和蛋⽩等的发酵⽣产中。

⽣物技术研究者追求的两个主要⽬标，⼀是新型⽣物产品的开发，另⼀就是为传统的或新⽣⽣物产品，寻求更经济的⽣产⽅式。

近⼗年来，利⽤遗传⼯程技术来⽣产⼀些重要的⽣物药物，是⽣物技术领域中迅速发展的⼀个重要⽅向。

在这⼀研究领域⾥，如何创造更经济、更有效的⽅法，来提⾼⽣产过程的经济性和产品的市场竞争⼒，已经成为⽣物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。

利⽤重组DNA技术⽣产重要的⽣物药物，在⼈类⽂明史上具有划时代的意义。

由于⽣产成本和⽣产率的⾼低直接影响公司的⽣存，重组⽣物药物⽣产过程的优化已经成为⼀个重要问题。

它包括以下六个⽅⾯∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋⽩积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最⼤表达的分⼦策略；(4)细胞⽣长和⽣产环境的优化；
(5)发酵条件的优化；后处理过程的优化。

只有这六个⽅⾯都以实现⾼⽣产率为⽬标，整个
⽣产过程的最优化才能实现。

(⼀)细胞⽣长环境的优化策略
要提⾼细胞密度和⽣产率，⾸先需要对微⽣物⽣长的物理和化学环境进⾏优化，包括⽣长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。

优化这些参数的⽬的在于保证细胞⽣长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不⾜、防⽌产物降解以及减少有毒产物的形成。

1．培养基组成的优化
培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维⽣素和微量元素，这些营养物的浓度与⽐例，对实现⽣产重组微⽣物的⾼密度发酵是很重要的。

例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉⽣产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋⽩酶⽣产能⼒可提⾼10倍之多；在重组微⽣物达到⾼细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗⽣素和异源⽩介素β的产率显著提⾼。

此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的⽣长，但⽐起精氨酸充⾜时细胞⽣长优良的情况，其重组α-淀粉酶的产量可提⾼2倍。

培养基中复合氮源的种类对重组⼤肠杆菌的⾼密度发酵也⾮常重要。

⼀般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋⽩不稳定；⽽当流加培养基中含有蛋⽩胨时，⼤肠杆菌不能再利⽤其所产⽣的⼄酸。

将酵母膏和蛋⽩胨都加⼊流加培养基中，不但所⽣产的重组蛋⽩⾮常稳定，细胞还能再利⽤代谢合成的⼄酸，这是⼀种⾮常有趣的代谢机制。

恒化技术可⽤于优化精氨酸营养缺陷型⼤肠杆菌X90的⽣长培养基。

使该菌株以0.4 h-1的⽐⽣长速率在含精氨酸的基本培养基上⽣长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加⼊氨基酸、维⽣素和微量元素来考察这些物质对菌体⽣长和精氨酸合成的影响。

结果表明，由于氨基酸⽣物
合成途径的末端产物抑制作⽤，加⼊某些氨基酸后，细胞⽣长反⽽受到抑制。

加⼊NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。

⽽添加维⽣素对菌体⽣长基本上没有任何影响。

通过计算⽣物量对每种基质的产率，最终可以确定⾼密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，⼤肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋⽩酶。

2．特殊营养物的添加
在某些情况下，向培养基中添加⼀些营养物质能提⾼⽣产率。

这些营养物的作⽤有可能是作为产物的前体，也有可能是阻⽌产物的降解，例如，在培养重组⼤肠杆菌⽣产氯霉素⼄酰转移酶(⼀种由许多芳⾹族氨基酸组成的蛋⽩)时添加苯丙氨酸，可将酶的⽐活⼒提⾼⼤约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌⽣产β-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋⽩的稳定性显著提⾼。

其原因可能是由于宿主细胞产⽣的多种胞外蛋⽩酶的活性被抑制，从⽽防⽌了重组蛋⽩的降解。

在⽣长培养基中添加特殊物质有时还能以⼀种未知的机制提⾼⽣产率。

例如，在摇瓶培养Micro monospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提⾼35倍，但在⼩型反应器中却⽆法重复这⼀结果。

3．限制代谢副产物的积累
培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚⼤。

在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过⾼均会导致Crabtree效应的产⽣。

在这种效应下，酿酒酵母会产⽣⼄醇，⼤肠杆菌则会产⽣过量⼄酸，⼀旦⽣成⼄酸，细胞⽣长及重组蛋⽩的⽣产均会受到抑制。

⼤肠杆菌形成⼄酸的速度依赖于细胞的⽣长速度和培养基的组成。

业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如⼤⾖⽔解物)，则会增加⼄酸的积累量。

针对如何减轻由于⼄酸积累⽽产⽣的负⾯影响，众多研究者进⾏了⼤量⼯作，如利⽤循环发酵技术来限制⼄酸在重组⼤肠杆菌⾼密度培养中的积累。

近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻⼄酸的抑制作⽤。

如在培养基中添加10 mg/L的⽢氨酸能显著促进⼤肠杆菌合成重组α-淀粉酶和β-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有⼄酸伴随⽣成。

(⼆)培养模式
由于许多营养物在⾼浓度下对细胞有抑制作⽤，⽽为了达到⾼细胞密度，⼜必须供给⼤量的营养物质，因此，浓缩营养物必须
以与其消耗速率成⽐例的速度加⼊反应器中。

为此产⽣了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利⽤数学模型计算得出的策略来控制补料速率。

具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢⾏为；(2)利⽤抑制性底物合成⽬的产物的潜⼒；(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能⼒。

1．⼤肠杆菌流加发酵策略
⼤肠杆菌是迄今为⽌遗传背景最清楚的菌株，⼴泛⽤于基因⼯程的研究中。

⼤肠杆菌⾼密度培养时最关键的问题是如何尽量减少⼄酸的产⽣，因为⾼浓度葡萄糖或⾼⽐⽣长速率带来的⾼浓度⼄酸会严重抑制细胞⽣长和重组蛋⽩的⽣产。

研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，⼤肠杆菌仍会产⽣⼄酸。

因此，⾼细胞密度发酵所采⽤的流加策略必须按照⼀定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的⽔平。

营养物最好以它们的消耗速率加⼊反应器中，这样不仅可以防⽌底物积累到毒性⽔平，也不会使细胞处于饥饿状态。

近年来已经报道了多种控制⼤肠杆菌流加培养中流加速率的⽅法，其中⼤多数是将流加速率与⼀种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。

有学者将溶氧控制在⼀个预定值上以保证较低的⽣长速率，结果⼄酸产⽣很少，最终细胞⼲重达到110 g/L，并发现较低的⽐⽣长速率还有利于重组蛋⽩的⾼表达。

在另⼀个控制低⽐⽣长速率的⾼细胞密度培养中，研究者采⽤先指数流加葡萄糖、铵盐和⽆机盐，后采⽤⼴义线性流加的培养策略，有效地防⽌了⼄酸的积累，重组⼤肠杆菌的细胞密度达到66 g/L，通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋⽩。

如果将葡萄糖浓度控制在⼀个不致于产⽣毒性的⾜够低的⽔平上，也可以使细胞在不存在限制性
基质的情况下迅速⽣长到⾼细胞密度。

这种控制策略对仪器的要求较⾼。

Kleman等采⽤在线葡萄糖分析仪，以微⽣物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率，这⼀算法能够在产物诱导阶段中根据细胞⽣长的变化⾃动调整流加速率。

培养携带质粒的⼤肠杆菌MV1190，其质粒中带有编码1,5-⼆磷酸核酮糖羧化酶的基因，最终细胞⼲重达到39 g/L，产⽣1.7 g/L
可溶的活性蛋⽩。

2．重组酵母的流加发酵
酵母中⼴泛⽤于遗传⼯程研究的菌株是酿酒酵母。

但采⽤酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋⽩⽣产的⽔平较低；
(2)质粒不稳定；(3)⽣成⼄醇。

其中⽣成⼄醇是研究者最不希望出现的，因为这会抑制重组蛋⽩的形成。

近来研究表明，其它酵母，如巴斯德毕⾚⽒酵母也具有作为重组宿主的潜⼒。

Clare等⽐较了重组巴斯德毕⾚⽒酵母和酿酒酵母在⾼细胞密度状态下表达和分泌⿏表⽪⽣长因⼦的能⼒。

培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕⾚⽒酵母，最终可获得447 mg/L胞内重组蛋⽩；⽽培养酿酒酵母所获得的最⾼⽔平仅6～7 mg/L。

通过先指数流加，后采⽤基于CO2释放和RQ值的线性流加控制⽅式可使重组巴斯德毕⾚⽒酵母的细胞⼲重达到80～90 g/L，并分泌⾼⽔平的重组⼈⾎清蛋⽩。

⽽培养酿酒酵母，细胞⼲重和重组蛋⽩的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。

即使将酿酒酵母的⽣长速率维持在0.12～0.18 h-1，也将形成10～13 g/L的⼄醇，因⽽导致产率降低。

但酿酒酵母产⼄醇也并不是不可控制的。

Shimizu等采⽤⼀个复杂的流加系统，将酵母的⽣长速率控制在0.3 h-1，可使⾕胱⽢肽(G SH)的⽣产最⼤⽽⼄醇的⽣成最⼩。

3．流加培养的控制
⼀个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶⼀是流加过量，补料组分在反应器中积累从⽽对细胞⽣长和产物形成产⽣抑制；⼆是流加不⾜，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。

计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的⼿段。

近年来，应⽤计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。

由于现代计算机技术的帮助，⼈们能够采⽤多种⽣长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从⽽使复杂的控制系统得以实现。

在各种⼈⼯智能技术中，模糊推理(fuzzy reasoning)是应⽤最⼴的⼀种。

模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学⽣长模型，也采⽤“语⾔定义的规则系统”(linguistic ally defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的⾮线性和动态⾏为。

Alfafara等在流加培养酿酒酵母⽣产⾕胱⽢肽的研究中，采⽤⼀个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度，对系统进⾏优化后⾕胱⽢肽的⽐产⽣速率达到6.2 h-1。

⽬前，在流加培养中应⽤模糊逻辑控制技术的最⼤问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。

⾃适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所帮助。

(三)诱导策略
对于许多带有诱导型启动⼦的重组微⽣物，只有将⽣长期和产物形成期分开才能获得最⼤⽣产率。

在流加培养中，这两段时期的分离可以通过延迟诱导直⾄细胞⽣长已达到⾼密度来实现。

此外，如果质粒稳定并且产物对培养物⽆毒，那么可以⽤重复补料分批培养系统来提⾼⽣产率。

有学者采⽤重复补料分批培养技术培养酿酒酵母，每24 h更换50%的培养基，持续30 d，其产物(hirudin)的产量可⽐连续培养系统提⾼3倍。

如果诱导物和产物对细胞都有毒性，那么应当⼈为地将诱导期和⽣长期分开。

对于这种情况，两级连续培养是最适宜的培养⽅式。

控制第⼀罐的条件，使细胞⽣长处于最适状态之下，⽽诱导与产物形成则发⽣在第⼆罐中。

例如，在恒化器中培养⼀株能产β-内酰胺酶的重组⼤肠杆菌，将第⼀罐的发酵液导⼊第⼆罐中，构成⼀个两级培养系统。

第⼆罐中添加营养物以及IPTG作为诱导物。

结果获得300 mg活性β-内酰胺酶(相当于总蛋⽩的25%)，其中90%分泌⾄胞外。

这⼀系统⾄少可以稳定运⾏50 d。

另⼀相似的系统被⽤于培养⼤肠杆菌⽣产重组蛋⽩A-EcoRI蛋⽩融合体。

培养在恒浊器中进⾏，对第⼆罐进⾏热诱导，结果获得了⽐分批发酵⾼6倍的⽐⽣产率。

研究者还尝试将⽣产重组蛋⽩的两级连续培养系统与亲和⾊谱柱相组合，试图实现重组蛋
⽩⽣产
和纯化的连续化。

但由于技术上的⼀些原因，这种组合还未得到成功。

⽐⽣长速率对细胞⽣长和产物形成均有重要作⽤。

经常会遇到的情况是，最适于细胞⽣长的⽐⽣长速率却并不适于产物的形成或其它特性的实现。

我们在培养⾯包酵母时发现，⽐⽣长速率为0.
2 h-1时细胞产率最⾼，⽽⽐⽣长速率为0.178 h-1时酵母发酵活⼒最佳。

针对这⼀现象我们提出了⼀个两阶段控制⽐⽣长速率的流加培养策略，结果在⼀个反应器中实现了⾼发酵活⼒与⾼细胞产率的统⼀。

(四)细胞循环发酵从反应器⾓度来考虑获得⾼细胞密度，通常采⽤的是细胞循环⽣物反应器。

这种反应器利⽤⼀种切向流或中空纤维过滤器从醪液中分离细胞，细胞返回容器，⽆细胞醪液则以给定速率连续转移，同时代之以新鲜培养基。

利⽤细胞循环技术，可使细胞保留在反应器中并达到⾼细胞密度，⽽毒性废产物和胞外产物则不断转移，这可以延迟或防⽌由细胞⽣长或产物形成引起的反馈抑制。

细胞循环⽣物反应器能够适⽤于多种机体和⽣产系统，但它的应⽤也存在许多限制，主要包括∶(1)作⽤于进⼊过滤单元的细胞的剪应⼒太⼤；(2)系统的放⼤存在许多实际困难。

操作细胞循环⽣物反应器时必须考虑两个因素，⼀是稀释率(流速／体积)；⼆是循环速率(指通过过滤系统的培养基速率)。

稀释率的⼤⼩影响细胞的⽣长速率，不同的实验⽬的对稀释率的要求也不同；⾼的循环速率可使组分混合均匀，特别适⽤于细胞容易凝聚或成团的情况。

但循环速率过⾼会使作⽤在细胞上的剪切⼒过⾼，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。

因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应⽤的⼀个重要因素。

细胞循环技术可望获得⾼的体积⽣产率，这对产物的提取⾮常有利。

近年来循环发酵技术已⼴泛⽤于⽣产细胞代谢物，如燃料酒精和有机酸(如丁酸)及2,3-丁⼆醇。

Lee和Chang采⽤细胞循环发酵技术，重组⼤肠杆菌细胞⼲重达到145 g/L，其重组青霉素酰化酶⽣产率⽐分批培养提⾼了近10倍。

对于活细胞即为所希望的产物的培养，细胞循环发酵也能发挥作⽤。

如在⾷品⼯业中，为⽣产⽜奶，奶酪和酸乳酪需培养不同的乳杆菌，采⽤细胞循环⽣物反应器可以很容易地提⾼这些⽣物体的的密度。

在多种控制⼿段的帮助下，⽬前⼈们已经能很容易地获得超过100 g/L的细胞密度。

但已有的研究结果表明，与最适⽣物量形成所对应的⽣长条件通常会导致较低的⽐⽣产率。

例如，⽤细胞循环反应器⽣产2,3-丁⼆醇，⽣物量提⾼了⼤约6倍，但体积⽣产率只提⾼了2～3倍。

同样，流加培养可以使链霉菌的细胞⼲重达到43 g/L，但蛋⽩酶活为零，⽽当细胞⼲重为18 g/L时蛋⽩酶活却⾼达3500 U/mL。

我们在研究中也经常遇到类似问题。

要解决这⼀问题，⼀⽅⾯应当研究如何促进重组蛋⽩的⾼效表达和提⾼重组菌株的稳定性，另⼀⽅⾯要研究与⾼细胞密度相关联的⾼⽔平产物的形成条件。

引⾔：⾼密度培养技术(High—cell—density cultivation，HCDC)，也就是⾼密度发酵技术，提⾼菌体的发酵密度，最终提⾼产物的⽐⽣产率(单位体积单位时间内产物的产量)不仅可以减少培养体积、强化下游分离提取，还可以缩短⽣产周期、减少设备投资从⽽降低⽣产成本，能极⼤地提⾼产品在市场上的竞争⼒。

这⼀⽬的的实现，除了重组菌本⾝的表达性质外，还必须赋予重组菌⽣长和产物表达的最适环境条件，包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH、稳定的⽐⽣长速率、适宜的溶解氧以及营养物的合理流加等。

重组⼤肠杆菌⾼密度发酵成功的关键技术是补料策略，也就是根据重组菌的⽣长特点及产物的表达⽅式采取合理的营养物流加⽅式。

碳源和氮源是两种常⽤的限制性基质，葡萄糖因细菌利⽤快且价廉易得，已⼴泛⽤作重组菌⾼密度发酵的限制性基质。

⼤肠杆菌在过量葡萄糖或缺氧的条件下会发⽣“葡萄糖效应”，积累⼤量有机酸⽽影响重组菌的⽣长和外源蛋⽩的有效表达。

因此⼤肠杆菌⾼密度发酵中，合理流加碳源使葡萄糖效应降低，是成功的关键。

⾸先对重组Escherichia coli的⾼密度培养⼀⽂进⾏重点推荐/doc/f1602d0176a20029bc642db1.html
/read.php?t id-2728-toread-1.html
该⽂从⾼密度培养过程中培养基成份及作⽤、⾼密度培养的过程控制参数、底物补料⽅式的种类及特点对重组Escherichia coli⾼密度培养进⾏了概述；并阐述了⼄酸的⽣成机制和控制⼄酸⽣成的策略；最后对重组Escherichia coli⾼密度培养及外源蛋⽩⾼表达进⾏了研究。

知识点全，阐述细致全⾯，不愧为⼤肠杆菌培养者和学习者的不错选择，版主在此进⾏重点推荐
其次有很多会员对培养的相关问题进⾏了讨论，具体讨论话题及内容总结如下：
问：请问⼤肠杆菌发酵中C:N怎么来控制啊？
答：如果是在分批补料发酵中C含量控制在0.35-0.5%，N含量控制在0.07-0.15% ，经验之谈
问：请教⼤肠杆菌摇瓶发酵⽤的化学合成培养基都有哪些？
答：LB，SOB，SOC等，具体可以查阅分⼦克隆！
讨论1：⼤肠杆菌是否能利⽤⼄酸作为碳源的问题讨论
问题：发酵过程中⼤肠杆菌在葡萄糖等碳源消耗完的情况下，能否利⽤其代谢产⽣的代谢副产物⼄酸作为碳源？
回答1：不能啊，⼄酸⼜不能进⼊TCA循环
回答2：⼤肠杆菌就怕产⽣⼄酸影响代谢。

回答3：能利⽤其代谢产⽣的代谢副产物⼄酸作为碳源，没有问题的。

不知道楼上两位怎么会说不能利⽤。

但是过⾼的⼄酸对
菌体⽣长不利
回答4：⼄酸是⼤肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多⼤的浓度下产⽣抑制作⽤各种说法不⼀，⼀般认为在好⽓性条件
下，5～10g/L 的⼄酸浓度就能对滞后期、最⼤⽐⽣长速率、菌体浓度以及最后蛋⽩收率等都产⽣可观测到的抑制作⽤。

当⼄酸浓度⼤于10或20g/L 时，细胞将会停⽌⽣长，当培养液中⼄酸浓度⼤于12g/L 后外源蛋⽩的表达完全被抑制。

看到过以⼄酸作碳源进⾏⼤肠杆菌发酵的，但不是⾼密度发酵，且直接以⼄酸作碳源（不加⼊任何其它碳源），⽽不是以代谢产⽣的⼄酸为碳源。

⼄酸是不能直接进⼊TCA循环的，必须是被氧化后才能被利⽤。

3楼的说能够利⽤其代谢副产物⼄酸作为碳源，我也愿听其详，望不吝赐教！
除TCA循环外，还牵涉到⼄醛酸途径和磷酸戊糖途径。

但⼀般的⼤肠杆菌都是进⾏TCA循环，除了⼀些特殊菌种如lpdA基因敲除突变E．coli当TCA循环被抑制就会进⾏⼄醛酸途径和磷酸戊糖途径。

回答5：我做的是⼤肠杆菌的基因⼯程菌，就是不能利⽤⼄酸，要防⽌⼄酸的产⽣，对于整个代谢有很⼤影响。

回答6：这个问题呢⼤肠杆菌绝对是可以利⽤⼄酸的。

因为我做的就是关于⼤肠杆菌产⼄酸的课题。

当以葡萄糖为碳源时，⼤肠杆菌回产⽣⼄酸。

⽽当葡萄糖被消耗光以后，⼤肠杆菌就可以利⽤⼄酸来提供能量。

这⼀点是肯定的
我在实验过程中还同时补加⼄酸和葡萄糖，实验数据表⾯是可以利⽤⼄酸的。

但是由于⼄酸的可以影响⼤肠杆菌的⽣长和外源基因的表达，所以在以葡萄糖为碳源时，都采⽤限制流加⽅式来补料。

但实际上⼤肠杆菌是可以利⽤⼄酸的。

回答7：具体的利⽤途径是⼄酸⾸选被转化成⼄酰辅酶A，然后可以进⼊TCA循环，同时也可以利⽤糖异⽣途径来和成其他氨基酸的前体。

具体的途径可以查⼀下NCBI上⾯的⽂献。

回答8：可以吧，没有碳源的情况下，适量的⼄酸应该还可以有利于⽣长的，所以发酵中，诱导前可以空耗⼀段时间。

讨论2：做⼤肠杆菌的⾼密度发酵时，以⽢油作为碳源进⾏补料流加存在什么问题？
问题：通常以⽢油作为碳源进⾏⼤肠杆菌的⾼密度发酵产⽣⼄酸量少，⽐较容易获得⾼密度。

除了⽣长速率较慢、菌体收率低，及⽢油成本较之葡萄糖⾼之外，还有什么缺点吗？希望做过这⽅⾯研究或有这⽅⾯知识的朋友进来⼀起讨论。

回答1：做基因⼯程菌发酵，我们采⽤的是葡萄糖做为唯⼀的碳源，进⾏流加补料，如果采⽤⽢油相对⽐较好，可以减少⾼密度发酵时，产⽣的⼄酸。

⽢油脱⽔酶不仅对氧敏感⽽容易失活,⽽且在有⽢油存在时,它也会发⽣⾃杀失活，过⾼的⽢油浓度会增加3.磷酸⽢油(Ｇ3Ｐ)的积聚从⽽明显抑制菌体的⽣长，由于⽢油浓度过低也不利于基因的转移形成。

在采⽤⽢油作为碳源，同时补加适量的葡萄糖作为菌体⽣长的优先碳源,以提⾼⽢油的转化率。

我们现在采⽤葡萄糖作为碳源，下步计划做加⼊适量⽢油来减少⼄酸产⽣的实验。

回答2：⾼密度发酵当中，补料还得注意搅拌转速的问题。

不同浓度底物流加对搅拌转速是不⼀样，我遇过这样的问题。

讨论3：影响重组⼤肠杆菌发酵的主要因素有哪些？问题：⼤家讨论得较多的是关于代谢副产物⼄酸对⼤肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下⼏点，并作出相应解决措施。

回答1：⼀、代谢副产物-⼄酸
⼄酸是⼤肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多⼤的浓度下产⽣抑制作⽤各种说法不⼀，⼀般认为在好⽓性条件下，5～
10g/L 的⼄酸浓度就能对滞后期、最⼤⽐⽣长速率、菌体浓度以及最后蛋⽩收率等都产⽣可观测到的抑制作⽤。

当⼄酸浓度⼤于10或20g/L 时，细胞将会停⽌⽣长，当培养液中⼄酸浓度⼤于12g/L 后外源蛋⽩的表达完全被抑制。

预防⼄酸产⽣的措施：
1、通过控制⽐⽣长速率来减少⼄酸的产⽣：
⽐⽣长速率越⾼，⼄酸产⽣越多，当⽐⽣长速率超过某个值时，⼄酸开始产⽣。

可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等⽅法来降低⽐⽣长速率。

2、透析培养：
在⼤肠杆菌的培养过程中可以⽤透析技术除去发酵液中的有害物质，降低⼄酸含量从⽽实现重组菌的⾼密度发酵和产物的表达。

3、控制葡萄糖的浓度：
葡萄糖是⼤肠杆菌发酵过程中重要的碳源之⼀，⽤其作碳源是要将其控制在⼀个较低的⽔平上，以减少⼄酸的产⽣。

常⽤的控制⽅法主要有：。