错配修复蛋白和p53蛋白表达与结直肠癌的临床病理关系及其相关性

错配修复蛋白和p53蛋白表达与结直肠癌的临床病理关系及
其相关性
赵喜连;郗彦凤;白文启;吴月琴;步鹏
【摘要】目的探讨错配修复蛋白(mismatch repair protein,MMRP)及p53蛋白在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中的表达,进而分析微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)、p53与CRC临床病理特征的关系及其相关性.方法采用组织芯片及免疫组化法对980例CRC中4种MMRP及p53进行检测,将4种MMMP中的1种及以上表达缺失定为MSI组,全部阳性表达定为微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)组.结果 (1)MMRP表达缺失率为11％,MLH1 、PMS2、MSH2及MSH6的表达缺失率分别为7.3％、7.1％、2.0％及1.9％;其中共同缺失表达类型为MLH1-PMS2、MSH2-MSH6者分别为52例、14例,统计分析结果显示二者均呈正相关(ra=0.712),4种蛋白均缺失者3例.(2) p53阳性率为59.1％.(3)MSI与患者年龄、肿瘤部位、大小、组织学类型、淋巴结转移、临床分期及Ki-67有关(P＜0.05).(4)p53与组织学类型、大体分型、浸润深度、远处转移及Ki-67有关(P＜0.05).(5)MSI与p53呈负相关(rs=-0.118).结论 MLH1、PMS2缺失表达较MSH2和MSH6多见.MLH1与PMS2、MSH2与MSH6常常协同表达或缺失.MSI及p53与CRC临床病理特征关系密切,对预测CRC的风险、恶性程度的评估等具有指导意义.MSI与p53表达呈负相关,提示二者可能参与CRC的不同发生、发展过程.
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2016(032)004
【总页数】6页(P370-374,379)
【关键词】结直肠肿瘤;错配修复基因;p53;MSI
【作者】赵喜连;郗彦凤;白文启;吴月琴;步鹏
【作者单位】山西医科大学研究生学院,太原030001;山西医科大学附属山西省肿瘤医院病理科,太原030013;山西医科大学附属山西省肿瘤医院病理科,太原030013;山西医科大学附属山西省肿瘤医院病理科,太原030013;山西医科大学附属山西省肿瘤医院病理科,太原030013
【正文语种】中文
【中图分类】R735.3
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，位居第3位[1]。

我国CRC的发病率及病死率呈逐年上升趋势[2]。

目前认为CRC的形成途径主要有两条[3-5]，即染色体不稳定(chromosomal instability, CIN)途径和微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)途径，其中CIN途经约占80%，发起始动因素是癌基因(Ras等)、抑癌基因(APC、p53、DCC、MCC等)突变，经过多阶段、多因素而致癌[4-6]。

而MSI则由错配修复基因(mismatch repair genes, MMR)缺陷造成，包括90%的遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)和10%～15%的散发性结直肠癌(sporadic colorectal carcinoma, SCRC)[4,7]。

本实验分别选取代表CIN途经的p53和代表MSI途经的4种错配修复蛋白(mismatch repair protein, MMRP)，采用组织芯片和免疫组化相结合的方法检测其在CRC中的表达，探讨二者与CRC 临床病理特征的关系及二者的相关性，为CRC的诊断治疗、风险评估及发病机制等提供实验依据。

1.1 临床资料收集2011～2013年山西省肿瘤医院存档的手术CRC切除标本980例，所有病例均具有完整的临床信息，且患者术前均未进行放、化疗。

每例
标本均经两位资深的病理医师复诊，参照WHO(2010)消化系统肿瘤进行分类。

1.2 HE及组织芯片标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色。

根据HE切片选取病灶区域，用记号笔定位。

用采样针从标记好的蜡块
组织中取2～4 mm长的组织条，打入42孔(6×7)蜡块微阵列中。

其中第一行后2个孔作为空白及定位标识(图1)。

1.3 免疫组化采用BenchMark XT全自动免疫组化仪对有代表性的4种MMRP(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)、p53及Ki-67进行染色。

操作步骤按
照Roche程序执行，上述抗体均购自北京中杉金桥公司。

1.4 判读标准(1)MMRP：MLH1、PMS2、MSH2和MSH6均定位于胞核，
采用半定量积分法，阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分；≤10%为1分；11%～50%为2分；51%～80%为3分；≥80%为4分；染色强度：无色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分；将两种得分结果相乘：≥2分为蛋白阳性，1分为蛋白低表达，0分为蛋白缺失表达，其中蛋白低表达和表达缺失均按阴性进行统计。

将4种MMMP中的1种及以上表达缺失定为MSI组，全部阳性表达定为微卫星稳定(microsatellite stable group, MSS)组。

(2)p53：定位于
细胞核，核呈黄色或棕黄色定为阳性。

(3)Ki-67：参照Martins等[8]评判标准进
行计数和评分。

每张切片选取阳性率高的区域10个高倍视野，每个视野计数100个细胞。

1.5 统计学方法应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 MMRP在CRC中的表达980例CRC中MMRP阳性者872例(89%)，表达缺失者108例，缺失率为11.0%，其中MLH1、PMS2、MSH2及MSH6表达
缺失者分别为72例(7.3%)、70例(7.1%)、20例(2.0%)及19例(1.9%)，MLH1
与PMS2共同表达缺失者52例(5.3%)，MSH2与MSH6共同表达缺失者14例
(1.4%)，4种均表达缺失者3例(0.3%)(图2)。

2.2 MSI与CRC临床病理特征的关系MSI与患者年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型、淋巴结转移、临床分期、Ki-67增殖指数有关，差异有统计学意义(P<0.05)；与患者性别、大体分型、分化程度、浸润深度、神经累犯、远处转移、CEA含量等均无关(P>0.05，表1)。

2.3 p53蛋白在CRC中的表达980例CRC中p53阴性者401例(40.9%)，阳性者579例，阳性率为59.1%(图3)。

2.4 p53蛋白与CRC临床病理特征的关系p53蛋白表达与组织学类型、大体
分型、浸润深度、远处转移及Ki-67增殖指数有关，差异有统计学意义(P<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、临床分期、淋巴结转移、脉管侵犯、神经累犯及CEA含量等均无关(P>0.05，表2)。

2.5 相关性分析MSI与p53表达呈负相关(rs=-0.118，P<0.001，表3)，MLH1与PMS2表达呈正相关(rs=0.712，P<0.001)，MSH2表达与MSH6表达呈正相关(rs=0.712，P<0.001，表4)。

CRC是一种严重威胁人类健康的肿瘤，随着人类社会的进步，CRC的发病率与病
死率呈明显上升趋势[1,2]。

目前虽然在合理的手术、放化疗和靶向药物的作用下
患者的预后和生存质量有了提高，但仍有一部分患者手术效果差、对药物治疗不敏感、易复发甚至在发现时已到晚期，所以有必要对CRC的发病机制进行进一步研究，以便为CRC的预防、筛查、诊断及治疗等提供理论依据。

CRC的发生、发展是多因素、多阶段的过程，近年来MSI途径引起了大家的广泛关注。

微卫星[4,9]是广泛存在于原核及真核生物基因组中具有高度多态性的短串
联重复核苷酸序列，由2～6个核苷酸组成。

MMR突变或启动子甲基化可以引起
DNA错配修复功能的降低，导致MSI[4]。

MMR系统作为人体细胞内的一种安全保障体系，可对DNA碱基错配进行修复，使遗传物质的完整性和稳定性得以保持。

MMR系统[5,7]包括MutS(MSH2、MSH6、MSH3等)和MutL(MLH1、PMS2、PMS1等)，通常MSH2和MLH1分别与其同源性MMRP形成复合体发挥作用。

研究发现MSI与10%～15%的SCRC以及90%的HNPCC有关[4,7]，而目前关
于MSI状态的研究主要集中在遗传相关的CRC，且大多为小样本分析，缺乏系统性，尤其国内尚缺乏大宗文献报道。

本实验通过扩大样本量对CRC中MMRP进
行检测，结果显示MMRP表达缺失率为11.0%，与Jung等[10]的结果较接近(12.5%)。

另外，国内对CRC中关于MLH1、PMS2、MSH2和MSH6等4种MMRP同时检测的大宗报道较少见。

国外学者Amira等[11]曾报道MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的缺失率分别为15%、15%、21%和13%，本组实验
结果显示MLH1、PMS2、MSH2、MSH6缺失率分别为7.3%、7.1%、2.0%和1.9%，Kim等[12]对韩国人的研究结果显示MLH1、MSH2及MSH6的缺失率分别为3.7%、2.0%、5.2%。

可以看出各研究间缺失蛋白的种类及比例不同，我国
以MLH1及PMS2多见，提示不同人种不同地区发生突变的基因有所不同。

本组实验经统计分析发现MLH1与PMS2、MSH2与MSH6均呈正相关(rs=0.712)，提示MLH1与PMS2、MSH2与MSH6常常协同表达或缺失，这可能与DNA在损伤修复过程中MLH1和MSH2分别与其同源性MMRP形成复合体机制相吻合。

大量研究结果显示MSI CRC好发于右半结肠，组织学类型以黏液腺癌和低分化腺癌最为常见[4,10,13]。

本组实验结果显示MSI与肿瘤发生部位相关，MSI组发生
于升结肠(17.6%)及横结肠(5.6%)者明显高于MSS组(4.8%及0.9%)，而发生于直肠者(55.6%)明显低于MSS组(77.8%)，提示结肠癌和直肠癌在发生过程中可能存在差异。

本组实验亦显示MSI组发生黏液腺癌及印戒细胞癌者多见。

研究显示在MSI CRC中，特别是HNPCC患者，其发病年龄小，多发生于50岁之前[10]。

本
组实验结果显示MSI与患者年龄相关，这对于筛选遗传性CRC具有重要意义。

本组实验亦显示MSI与临床分期、Ki-67增殖指数及淋巴结转移相关，MSI组临床
分期早、Ki-67增殖指数低且淋巴结转移较少，这可能与MSI CRC患者预后好有关。

CRC中CIN途径遵循正常黏膜-腺瘤-腺癌多阶段、多步骤过程，在此过程中p53
发挥着重要作用[14]。

p53为17号染色体上的抑癌基因，研究显示在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现p53基因突变[15]，在大肠癌中突变所占比例报道不一，
为40%～75%[6]。

本组实验结果显示p53阳性率为59.1%(579/980)，与大量报道的平均值接近。

近年国内外的研究结果表明，p53蛋白的表达可能与组织浸润
肠壁的深度、淋巴结转移等呈正相关，并认为p53蛋白的阳性表达可作为患者预
后的一项预测指标[6]。

本组实验结果显示，p53与肿瘤浸润深度、远处转移及Ki-67有关，提示p53突变者肿瘤的增殖活性增加，同时肿瘤细胞具有更强的浸润和转移能力。

另外本实验结果亦显示p53与组织学类型及大体分型有关。

p53与MSI对于CRC的发生、发展具有重要意义，但是二者在CRC中的相互关
系尚不明确。

Bond等[16]报道MSI CRC中p53的突变率较低(17%)，本组实验
结果显示p53在MSS组阳性率为61.1%，而在MSI组为42.6%，且经相关分析显示MSI与p53呈负相关，提示二者可能是在不同的发病机制上参与了CRC的
发生、发展过程。

还有一些研究显示p53、MSI与CRC患者预后相关，p53突变者预后差[17]，而MSI患者其预后好，且显示MSI CRC患者不能从5-FU化疗药物中获益[18]，所以联合检测p53与MSI可以对患者进行预后评估、同时能够预
测患者对以氟尿嘧啶为基础的辅助化疗药物的疗效。

综上所述，MSI及p53与CRC临床病理特征的关系密切，而组织芯片与免疫组化相结合的方法可以在节约成本的同时实现对MMRP及p53蛋白的快速检测，通
过对二者的检测可以更好的了解我国CRC的特点，为CRC的早期诊断、风险评估、
预后预测及制定和完善符合我国的诊断、治疗规范等提供参考。

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