淫羊藿苷对缺糖缺氧条件下间充质干细胞活性及旁分泌功能的影响

第19卷第2期2020年4月

Vol.19No.2

Apr.2020

浙江医学教育

Zhejiang Medical Education

*基础与临床研究•淫羊薑昔对缺糖缺氧条件下间充质

干细胞活性及旁分泌功能的影响

袁雯霞，赵杨敏，干云霄，刘丹丹@

(杭州医学院，浙江杭州310053)

摘要：目的：研究淫羊霍昔对缺糖缺氧(OGD)环境下移植的间充质干细胞(MSCs)活性和促血管生成相关细胞因子、microRNA等旁分泌功能的影响。方法：MTT法检测OGD时间、淫羊霍昔浓度对MSCs增殖活性的影响，流式细胞仪分析细胞凋亡水平,Hoechst33342染色观察凋亡细胞形态;ELISA评估VEGF、bFGF的细胞分泌水平；实时荧光定量PCR测定MSCs及外泌体中5种促血管生成相关microRNA的表达水平。结果：高、低浓度的淫羊霍昔对OGD 处理6h的MSCs表现出明显的促细胞增殖活性(P<0.05),淫羊霍昔孵育显著抑制OGD诱导的MSCs早、晚期凋亡，增加细胞上清中V EGF、bFGF的分泌水平。除了miR-103-3p,淫羊霍昔显著上调miR-126a-5p、miR-210-3p、miR-378a-5p和m i R-322-5p在MSCs的表达(P<0.05),外泌体中的表达水平低于细胞内。结论：淫羊霍昔可显著提高OGD条件下MSCs的增殖活性和旁分泌功能。

关键词：淫羊霍哥缺糖缺氧；间充质干细胞汐卜泌体；microRNA

中图分类号:R392.3文献标识码：A文章编号:1672-0024(2020)02-0041-04

Effects of Icariin on the Activity and Paracrine of Mesenchymal Stem

Cells with Oxygen-Glucose Deprivation

YUAN Wenxia,ZHAO Yangmin,GAN Yunxiao,LIU Dandan@

(Hangzhou Medical College,Hangzhou310053,China)

Abstract：[Objective]To study the effect of Icariin on the activity and paracrine of angiogenic cytokines and microRNA of transplanted MSCs in oxygen-glucose deprivation(OGD)environment.[Method]MSCs activity after OGD and Icariin treat­ment was detected by MTT.The apoptotic ratio was analyzed by flow cytometry and the morphology of apoptotic cells was ob­served after Hoechst3332staining.Secretion of VEGF and bFGF was evaluated by ELISA.The expression of five microRNAs related to angiogenesis in MSCs and exosomes were determined by real-time fluorescence quantitative PCR.[Result]Icariin showed the strongest proliferation-promoting activity on MSCs with OGD for6h.Icariin incubation significantly inhibited MSCs apoptosis and increased VEGF,bFGF secretion.Except mir-103-3p,the expression of mir-126a-5p,mir-210-3p,mir-378a-5p and mir-322-5p in MSCs was significantly up-regulated.They were lower in exosomes than those in MSCs.[Conclusion]Icariin can significantly improve the proliferation activity and paracrine of MSCs with OGD treatment.

Key words：Icariin;oxygen-glucose deprivation;mesenchymal stem cells;exosome;microRNA

缺血性脑血管病常引起相应部位脑组织的缺血甚至坏死，具有极高的发病率、病残率、病死率和复

作者简介：袁雯霞（1985-）,女，浙江天台人，硕士研究生，讲师/主治医师。研究方向：干细胞移植

基金项目：浙江省中医药管理局科研项目（编号：2014ZA018）;浙江省教育厅一般科研项目（编号:¥201636956）;浙江省自然科学基金一般项目（编号:LY18H090011）

@通信作者：刘丹丹，副教授7559220@

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第19卷浙江医学教育第2期

发率，严重影响人们的身体健康。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可取自自体骨髓，不受伦理限制；体外扩增方便，免疫原性低；并具有多向分化潜能，可改善脑缺血后损伤器官的结构和功能。MSCs是目前干细胞移植治疗脑缺血的主要来源⑵。研究表明80%以上的移植细胞在输入体内后的72h内死亡，其原因可能和缺血微环境诱导的细胞凋亡有关⑴。因此，提高MSCs在缺血微环境中的细胞活性和生物学功能是改善细胞移植治疗脑缺血效果的主要措施之一。

淫羊W<(Icariin,ICA)是温阳补肾中药淫羊霍的主要活性成分之一，我们的研究表明淫羊霍昔和间充质干细胞移植联合治疗大鼠脑缺血时，可显著增加脑内血管生成因子和神经生长因子的分泌，减 少梗死体积，改善神经损伤症状评分⑵。但淫羊霍昔对缺血微环境中MSCs的作用如何，目前尚不清楚。本实验中，我们以原代大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象，通过构建细胞急性缺糖缺氧再灌注模型(oxygen-glucose deprivation,OGD)以模拟脑缺血损伤，并探讨淫羊霍昔对缺血微环境中MSCs的活性和促血管生成相关的细胞因子microRNA表达水平的影响。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂

SD大鼠5只，购自上海斯莱克，用于骨髓MSCs 的提取。细胞因子ELISA试剂盒购自上海艾莱萨生物科技有限公司。淫羊霍昔购自Sigma,Hoechst 33342染色液和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司。

1.2OGD模型的制备、MTT检测及细胞分组

全骨髓贴壁法培养并收集SD大鼠MSCs,调整细胞浓度为104/mL,UZ100yL/孔接种到96孔板。第二天加入无糖Earle's液，分别缺糖缺氧损伤0〜8 h后换液继续培养。MTT法检测细胞增殖活性，每 组设8复孔。然后加入5mg/mL MTT溶液20"/孔，继续孵育4h,终止培养,弃上清，加DMSO120“/孔,振荡。酶标仪测定490mn波长各孔光吸收值，选择最佳OGD时间。细胞实验分组：正常组，缺氧组，高浓度组(OGD+淫羊霍昔O.lyM/L),低浓度组(OGD+淫羊霍昔0.01yM/L)。

1.3Hoechst33342染色观察细胞凋亡

MSCs以105/mL,500yL/孔接种到24孔板。贴壁后第二天OGD培养一定时间和加药24h后，在培养液中滴加适量Hoechst33342活细胞染色液，轻柔混匀。37兀培养箱中孵育lOmino吸除含染料的培养液，用PBS洗涤2〜3次，甘油封片。荧光显微镜下观察拍照。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡

收集各组MSCs,吹打成单细胞悬液。加入5ptLAnnexin V-FITC,lOptL碘化丙呢(PI)染色液，轻轻混匀。室温避光孵育10〜20min。流式细胞仪立即上机检测。

1.5ELISA测定

根据试剂盒说明,ELISA检测细胞培养上清中VEGF、bFGF的分泌水平。

1.6实时荧光定量PCR检测miRNA表达

超速离心法提取外泌体E,提取各组细胞和外泌体的总RNA,反转录合成cDNA,用于实时定量PCRo内参(U6)及所有的指标均按以下程序进行：95兀，10min;40个PCR循环(95兀，10秒；60兀，60秒(收集荧光))。数据采用2-^CT法计算目的基因相对表达量。

1.7统计学处理

用SPSS18.0统计软件。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1淫羊餐昔对OGD条件下MSCs增殖活性的影响

缺氧2〜8h,细胞增殖活性均有不同程度降低。低浓度淫羊霍昔有较强的生物学活性，可显著提高缺氧后的细胞增殖能力，但对缺氧8h后的细胞活性无明显作用。相反，高浓度的淫羊霍昔抑制短时间缺氧(2〜4h)后的细胞活性，但显著提高缺氧6h (^3,28=10.051,P<0.01)和8h(F3,28=8.388,P< 0.05)后的细胞活性有明显促进作用。由以上可知，缺氧6h后，高、低浓度的淫羊霍昔均表现出最明显的促细胞增殖活性,6h成为后续实验的最佳缺氧时间。

2.2淫羊餐昔对OGD条件下MSCs凋亡的影响

流式细胞仪检测发现(图A),缺氧和淫羊霍昔主要影响早期凋亡细胞数量。MSCs OGD处理6h 后，早期凋亡数量大幅度增加(吗,8=16.681,P< 0.01),中晚期凋亡比例也明显上升(吗,8=6.047,P <0.05)o淫羊霍昔的孵育则显著降低早期凋亡细胞数量(P<0.01),同时中晚期凋亡细胞也有明显

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