以thya为标志的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统的构建及其在基因疫苗中的应用

中国人民解放军军事医学科学院
硕士学位论文
以thyA为标志的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统的构建及其
在基因疫苗中的应用
姓名：黄维
申请学位级别：硕士
专业：分子遗传学
指导教师：曹诚;钟辉
2002.5.28
图１整合有缺陷型＾原噬菌体同源重组系统的大肠杆菌的目的基因与
外源线性ＤＮＡ进行同源重组示意图
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培养，观察菌株生长情况。

（技术路线图如图２所示）
１．２．７ＤＹ３３０－ＴＡｇａｍ—ｋｉｌ－ｃｌｌｌ菌株的鉴定：
４２＂Ｃ培养３６小时后，在ＭＭ平板上长出了数个白色菌落。

再将这些克隆平行点种于含／不含胸腺嘧啶的卡那霉素ＭＭ平板，分别置于４２＂Ｃ和３２＂Ｃ培养箱中培养，挑选只在４２℃生长，依赖胸腺嘧啶，具有Ｋａｎ’的菌落即为ＤＹ３３０一ＴＡｇａｍｋｉｌｃｌｌｌ阳性克隆，命名为ＤＹ３３０．ＴＩ。

１．３实验结果
１．３．１含有大肠杆菌ｔｈｙＡ侧翼序列同源片段的Ｋａｎｒ基因ＰＣＲ产物以Ｐ１、Ｐ２为引物，ｐＥＴ２８ｂ（＋）质粒为模板，经ＰＣＲ扩增，获得了预计大小的扩增产物，其长度为１３０９ｂｐ（５０＋５０＋１２０９＝１３０９ｂｐ）。

包括ｐＥＴ２８ｂ（＋）Ｋａｎ’基因的ＣＤＳ序列（３９９４－４８０９ｂｐ）及其起始密码子上游的３９４ｂｐ（４８０９—３９９４＋３９４＝１２０９ｂｐ），和大肠杆菌ｔｈｙＡ内部的５０ｂｐ同源序列（３０１—３６０ｂｐ）及ｔｈｙＡ全基因下游（１１６３ｂｐ以后）的５０ｂｐ同源序列。

大肠杆菌ｔｈｙＡ全长１１６３ｂｐ，利用该ＰＣＲ产物可将ＤＹ３３０染色体上的ｔｈｙＡ基因３６１．１１６３ｂｐ片段缺失。

（图３）
图３用于同源重组的Ｋａｎ７ＰＣＲ片段
１．ＤＮＡｌｄａｒｋｅｒＤＬ２０００（１００、２５０、５００、
７５０、１０００、２０００ｂｐ）
２．以Ｐｅｔ２８ｂ（＋）为模板的Ｐ１／Ｐ２Ｋａｎｒ
ＰＣＲ产物（１３０９ｂｐ）
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图４ＤＹ３３０－Ｔ的１２个阳性克隆在不同培养基中的生长状况如图所示。

ＭＭ：ＭＭ培养基ＬＢ：ＬＢ培养基Ｋａｎ：卡那霉素（２０ｕｇ／ｍ１）Ｔ：胸腺嘧啶（５０ｕｇ／ｍ１）
图５ＤＹ３３０－ＴＰＣＲ鉴定结果
１．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００ｂｐ）
２．ＤＹ３３０＊ＴＰＩ，Ｐ２ＰＣＲ产物（１３０９ｂｐ）
３．ＤＹ３３０－ＴＰ３／Ｐ４ＰＣＲ产物（１６１９ｂｐ）
４．ＤＹ３３０Ｐ３／Ｐ４ＰＣＲ产物（１２１３ｂｐ）
５．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００ｂｐ）
上述克隆分别在三种培养温度下进行。

即４２℃、３７℃、３２℃
ｌ号、２号为ＤＹ３３０－ＴＡｇａｍ－ｋｉｌ－ｃｌｌｌ阴性克隆；
３号、４号为ＤＹ３３０．ＴＡｇａｍ．ｋｉｌ－ｄｌｌ阳性克隆。

即ＤＹ３３０．ＴＩ．
５－８号为ＤＹ３３０－ＴＩ的出发菌ＤＹ３３０－Ｔ。

ＬＢ：ＬＢ培养基Ｔ：胸腺嘧啶（５０ｕｇ／ｍ１）Ｋａ：卡那霉素（２０ｕｇ／ｍ１）．
同样的克隆筛选也使用了相应的ＭＭ培养基，与ＬＢ中生长情况相同，图从略。

图６ＤＹ３３０－ＴＩＤＹ３３０－Ｔ菌落生长状况表型筛选鉴定
第二部分构建以ｌ匆ｄ为选择标志的互补质粒及大肠杆菌染色体－质粒平衡致死系统的克隆。

以下为ｐｃＤＮＡ３．Ｉｍｙｃｈｉｓ（－）ＡＸｍｎｌ＋ＢｓｐＨＩ双酶切片段（图７）：构建ｐｃＤＮＡＴＥ的技术路线图（图９）。

图７ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ（－）Ａ酶切片段１．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００（１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００ｂｐ）
２．ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ（－）Ａ／ＸｍｎＩ＋ＢｓｐＨｌ（１００８、１９０５、２６１０ｂｐ）
３．ｐｃＤＮＡ３．Ｉｍｙｃｈｉｓ（－）Ａ／ＸｍｎＩ＋ＢｓｐＨｌ（１００８、１９０５、２６１０ｂｐ）图８大肠杆菌ｔｈｙＡＰＣＲ产物１．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００（１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００ｂｐ）
２．ＤＹ３３０Ｐ７／Ｐ８ＰＣＲ产物（１１８２ｂｐ）３．２００ｂｐＬａｄｄｅｒ（２００－２０００ｂｐ）
２．３．２ｐｃＤＮＡＴＥ酶切鉴定
由于大肠杆菌ｔｈｙＡ基因的两端均有ＨｉｎｄＩＩＩ位点（Ｉｂｐ、１１６３ｂｐ），ｐｃＤＮＡ３．Ｉｍｙｃｈｉｓ（－）Ａ的ＭＣＳ位点上也有该酶切位点（９９２ｂｐ），因此用ＨｉｎｄｌｌＩ完全酶切ｐｃＤＮＡＴＥ后，应有三个片段，长度分别为８３１ｂｐ（１８１６－９９４＋９ｆｆｉ８３１ｂｐ），１１６３ｂｐ（即ｔｈｙＡ全长基因），２１８２ｂｐ（４１７６．１１６３・８３１＝２１８２ｂｐ）。

酶切鉴定结果如预期那样，
证明ｐｃＤＮＡＴＥ由大肠杆菌的ｔｈｙＡ、Ｐｃｍｖ・ＭＣＳ—ｆｌｏｒｉ和ｐＭＢｌｏｆｉ三个片段按定向
２．３．３ｐｃＤＮＡＴＥ的大肠杆菌ｔｈｙＡ基因测序结果
ｐｃＤＮＡＴＥ的大肠杆菌ｔｈｙＡ基因与ＧｅｎｅＢａｎｋ中收录的大肠杆菌ｔｈｙＡ基因序列进行比较表明二者具有１００％的同源性，证明大肠杆菌ｔｈｙＡ基因ＰＣＲ产物的正确性，且其在基因序列上高度保守，符合细菌管家基因的特点。

（附图１）
图１０ｐｃＤＮＡＴＥ酶切鉴定结果１．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００（１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００ｂｐ）
２．ｐｃＤＮＡＴＥ／ＨｉｎｄｌｌＩ（８３１、１１６３、２１５２ｂｐ）
３．ｐｅＤＮＡＴＥ质粒图１１霍乱弧菌ｔｈｙＡＰＣＲ产物１．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００（１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００ｂｐ）
２．ｐＦＧＹｌ０１Ｐ９／Ｐ１０ＰＣＲ产物（１１５１ｂｐ）３．２０（ＹｏｐＬａｄｄｅｒ（２００－２０００ｂｐ）
２．３．４ｐｃＤＮＡＴＣ的构建
与ｐｅＤＮＡＴＥ构建过程相似，ｐｃＤＮＡＴＣ的构建是由霍乱弧菌ｔｈｙＡ基因（１１５３ｂｒ，）代替大肠杆菌ｔｈｙＡ基因（１１７７ｂｐ）与ｐｃＤＮＡ３．Ｉｍｙｃｈｉｓ（－）Ａ的Ｐｃｍｖ．ＭＣＳ－ｆｌｏｒｉ和ｐＭＢｌｏｒｉ两个片段进行连接克隆而成。

它是以霍乱弧菌ｔｈｙＡ基因为选择标志的互补质粒。

ｐｅＤＮＡＴＣ长度为４１５２ｂｐ（１１５３＋１９０５＋１０９４＝４１５２ｂｐ），由于霍乱弧菌ｔｈｙＡ基
因内部具有ＫｐｎＩ（５２４ｂｐ）、ＥｅｏＲＶ（１０９９ｂｐ）酶切位点，ｐｅＤＮＡＴＣ的ＭＣＳ来自
图１１ｐｅＤＮＡＴＣ酶切鉴定
１．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００（１００、２５０、５００、７５０、
１０００、２０００ｂｐ）
２．ｐｃＤＮＡＴＣ／ＫｐｎＩ不完全酶切（５２４、８２３、
１３４７ｂｐ）
３．ｐｅＤＮＡＴＣ质粒
４．ｐｃＤＮＡＴＣ／ＫｐｎＩ完全酶切（５２４、８２３、
２８０５ｂｐ）
５．２００ｂｙＬａｄｄｅｒ（２００．２０００ｂｙ）
无选择压力组，经１０次传代培养后，互补质粒的检出率如下：ｐｅＤＮＡＴＥ是３％，平均每代质粒丢失率为１０．４％；ｐｃＤＮＡＴＣ是５％，平均每代质粒丢失率为９．０％。

实验表明，营养选择压力是维持以染色体．质粒平衡致死系统中互补质粒稳定存在必要条件。

选择压力一旦去除，互补质粒会很快丢失。

这与以抗生素作为选择压力的质粒载体系统得出的结论相同。

此外，利用同一基因自身互补或异种基因功能互补的方式均可构建出稳定的染色体．质粒平衡致死系统。

２．３．８平衡致死系统的生长特性研究
４２。