医学Western blot(细胞蛋白)

Western blot （细胞蛋白）
1.取细胞：若细胞为贴壁细胞，先将细胞用胰酶消化下来（至L5ml EP管）；
若为悬浮细胞，可直接抽取一部分细胞至EP管，离心（我们实验室小离心机
4500rpm, 5min,具体可调节），去上清。

2.洗：加ImlPBS充分混匀，离心（同上，具体可调节），去上清。

3.裂解：加 80T20ul 裂解液（RIPA:PMSF： COCK TAIL=100:1:1）,充分混
匀，
冰上裂解30mino
4.离：12000rmp,4℃, 10min o将上清转移至另一 L5ml EP 管。

5.定量（BCA法）
6.加蛋白上样缓冲液（5X）,即步骤三所加裂解液的量4二所加蛋白上样缓冲液
的量。

充分混匀。

7.沸水煮lOmin,取出冷却4℃,可放-20℃保存。

8.配胶：先配下层胶，按需求选择板子（1.0或1.5）,配完立即加无水乙醇等
待30min凝（天冷时间可延长）。

上层胶，配完立即插梳子等20-30min （天冷时间可延长）。

9.加样第一孔加marker （3. 5-4ul）第二孔以后加样品，最后一个可再加marker
（1.5-2. OuD&B：在电泳液中加样；电压80V. 30min,等到在压缩胶的作用下，处于同一水平线或看到marker红蓝分离，可调电压至120v （40-50min）0
电泳液是IX SDSo
10.切胶根据因子分子量（可扩大切胶范围，以防出现误差）
11.转膜海绵用遇冷的转膜液浸湿，PDF膜用甲醇激活lmin.
放置顺序海绵-膜-胶-海绵-电极板,注：赶气泡,然后通电
12.封闭5%脱脂奶粉（比如称0. 5g奶粉，取10ml IX TBST） 2h.然后IX TBST洗
13.孵育一抗，摇30min-lh后放4℃冰箱过夜。

14.回收一抗，IX TBST洗膜，洗3次，lOmin/次，转速130左右
15.孵育二抗2h 2ml左右（转速70）
16.回收二抗TBST洗膜，洗3次，10min/次
17.显影（1:1）,每个膜2001d左右。