5现代色谱分析-毛细管电泳

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第二节 毛细管电泳基本理论
电泳和电渗 分离柱效 引起区带展宽的因素
一.电泳和电渗
电泳(electrophoresis)和电渗(electroosmosis) 是毛细管电泳分离理论中最基本的概念。 电泳是指溶液中带电粒子(离子)在电场中定 向移动的现象。 电泳迁移速度Vp为 Vp=µE=µV/L 式中 µ-电泳迁移率(电泳淌度) (electrophoresis mobility)(m2/V.s)
毛细管电泳最基本的分离模式。背景电 解质是缓冲液,分离是基于样品中各个 组分间质荷比的差异。有时需在缓冲液 中加入一定的添加剂,用以提高分离选 择性,改变电渗流的大小、方向或抑制 毛细管壁的示样 品离子的迁移,带正电荷的物质, 迁移方向与电渗流相同,带负电荷 物质的迁移方向则与电渗流相反
1984年,Terabe等建立了分离电中性有机 化合物的胶束电动毛细管色谱。此后相继 出现了毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、 毛细管电泳手性分离等。
毛细管电泳的优缺点
优点:与HPLC相比,CE操作简单,样 品消耗少,分离效率高,运行成本低。 缺点:在迁移时间的重现性、进样准确 性方面逊色于HPLC,并且不利于制备性 的分离。
在缓冲液中加入有机添加剂,如甲醇、 异丙醇等,或水溶性高分子物质,对 EOF也有较显著的抑制作用。
二.分离柱效
毛细管电泳中,若有电渗流存在,则分离 时间用表观电泳迁移率µapp表示为:
µapp=µ+µeo
按照Giddings的色谱柱效理论,分离柱效表 示为: N=l2/σ2 σ2是以标准差表示的区带展宽,l为区带移动 的距离。
毛细管电泳装置
1.高压电极槽和进样机构 2.填灌清洗机构 3.毛细管 4.检测器 5.铂丝电极 6.低压电极槽 7.恒温系统 8.数据记录处理系统
毛细管电泳的几种分离模式
毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE) 胶束电动色谱(micellar electrokinetic chromatography, MEKC) 毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis, CGE) 毛细管等速电泳(capillary isotachophoresis, CITP) 毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focus, CIF) 毛细管电色谱(capillary electrochromatography, CEC)
V-毛细管柱两端施加的电压 L-毛细管柱长 物质在毛细管中的保留时间为: t=l/Vp=Ll/µV l为毛细管柱进样端至检测窗口的距离(有效 距离) 电渗是指在电场作用下,毛细管中或固相多孔 物质内,液体沿固体表面移动的现象。电渗与 固液两相界面的双电层有着密切电导关系。
石英毛细管壁上的硅羟基在水溶液中发生电离, 所产生的SiO-负离子使毛细管壁带负电荷。溶 液中的抗衡离子靠静电吸附和分子扩散在固液 界面上形成双电层(electric double layer),双 电层包括紧密层和扩散层。 在电场作用下,固液两相间的相对运动发生在 紧密层与扩散层之间的滑动面上。 由于离子的溶剂化作用,当形成扩散层的离子 在电场中移动时,携带着液体一同移动,因此 产生电渗流(electroosmotic flow,EOF)
毛细管电色谱(CEC) 毛细管电色谱(CEC)
以微填充柱作为分离柱,以电渗流驱动 流动相完成色谱分离过程。
CEC与HPLC的比较 CEC与HPLC的比较
方法 HPLC 填料大小(μm) 5 3 1. 5 CEC 5 3 1.5 柱长(cm) 50 25 10 50 50 50 分离柱效 55,000 45,000 30,000 115000 170,000 250,000
毛细管等速电泳 分离原理示意图
L.前导电解质; L.前导电解质; T.终结电解质; T.终结电解质; A,B.表示样品中的不 同组分. a.毛细管中充入前导电解 a.毛细管中充入前导电解 质、样品和终结电解质; b.电泳开始; b.电泳开始; c.样品中A,B两组分得 c.样品中A 到完全分离;d f.分别 到完全分离;d—f.分别 表示相应过程的浓度轮 廓.
三.引起区带展宽的因素
1.分子扩散 2.焦耳热引起的区带展宽 3.进样引起的区带展宽 4.电泳引起的区带展宽 5.毛细管壁吸附引起的区带展宽
焦耳热引起的区带展宽
电流通过毛细管中的电解质溶液时会产生焦耳热,焦 耳热与电场强度、电解质溶液的浓度等有关。焦耳热 通过毛细管壁向周围环境散发。这一过程的温度分布 如下图。
扩散双电层模 型
HPLC由于压差产生抛物线型的流体流速轮廓。电渗流的 HPLC由于压差产生抛物线型的流体流速轮廓。电渗流的 流速轮廓是一个平面,在毛细管中如同瓶塞一样流动, 不存在径向的流速梯度。这是毛细管电泳分离柱效高于 HPLC的原因之一。 HPLC的原因之一。
缓冲液pH对电渗流的影响 缓冲液pH对电渗流的影响
肌 红 蛋 白 及 其 碎 片 离 分 泳 电 胶 凝 管 细

毛细管等速电泳(CITP) 毛细管等速电泳(CITP)
基于样品中各组分电泳迁移率的差异,但是 与CZE不同的是,CITP采用非连续的电解质溶 液—前导电解质(LE)和终止电解质溶液 (TE)。在毛细管中加入具有pH缓冲能力的前 导电解质,将终止电解质(TE)装在负极槽中, LE和TE构成不连续的电泳介质环境。当有效淌 度比 TE大、比LE小的样品离子进行电泳时,首 先按照有效淌度的大小进行分离。互相分开后, 电泳进入稳态,除按有效淌度大小排列外,区 带之间不再发生宏观变化,以LE的速度等速前 进。
电泳引起的区带展宽
当样品离子具有与背景电解质中的同号离子相同的电 泳迁移率时,样品离子传递电流的效率与背景电解质 中的同号离子相同,此时样品区带具有与周围缓冲液 相同的电导率。但是,多数情况下并非如此,因此会 引起样品区带与周围电解质溶液间的电导率差,从而 导致峰形展宽。
毛细管壁吸附引起的区带展宽
随着pH的增大,石英管壁表面的硅羟基解离度增加,界 随着pH的增大,石英管壁表面的硅羟基解离度增加,界 面有效电荷密度增大,EOF随之增大。 面有效电荷密度增大,EOF随之增大。
阳离子型的表面活性剂使电渗流发生反转 a.无表面活性剂存在;b.阳离子表面活性剂在毛细管
壁表面的吸附,抵消了原来的负电荷,使电渗迁移率0; c.继续增大阳离子表面活性剂的浓度,阳离子表面活性 剂分子通过非极性链疏水相互作用,在毛细管柱表面 形成双分子层,使电渗流反转.
Basics cont.
毛细管电泳的发展
电泳过程中产生的焦耳热引起溶液对流, 扰乱区带,使电泳分辨率受到限制。 20世纪50年代后,相继发展了多种支持 物电泳,如纸电泳、琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺电泳,支持物不仅可抗对流, 而且凝胶还起筛分作用,所以具有很高 的分辨率。
毛细管电泳的发展
1967年,Hjerten在3mm内径的石英 管内壁涂上纤维素以消除电渗流,并且 让管子绕管轴旋转以克服焦耳热引起的 对流。 1970年,Everaerts等建立了等速电泳 (isotachophoresis),该方法需在细内径 管中进行。
进样引起的区带展宽
在高效毛细管电泳中,细内径毛细管的采用虽然提供 了潜在的高分离效率,但也给进样带来了严格的要 求.如果采用内径从2µm到100µm的毛细管,长度lm时 相当于3.1nl到7854nl的总柱体积,则不合适的进样很 容易导致样品过载.解决这一问题的途径是采用柱上 进样方法,由此消除非柱上进样可能造成的区带扩张, 这时进样对分离效率的影响仅由样品区带的长度决定。 如果高效毛细管电泳要达到仅由分子扩散决定的高分 离效率(一般 N>10 5),则样品区带的长度至少需小 于分离柱长度L的1%.如果采用2µm到100µm的毛细管, 长度lm时进样体积应小于0.03nl到79nl。用流体动力进 样与电动进样两种方法,可以达到毛细管电泳的进样 要求.
毛细管电泳的发展
1981年,Jorgenson和Lukacs发表了在毛细管 电泳发展史上具有划时代意义的工作,他们采 用75µm内径的石英毛细管做为分离室,紫外柱 上检测的方法,在30kv的分离电压下分离丹酰 化氨基酸,柱效达到40万个理论塔板。他们的 工作为毛细管电泳的发展奠定了基础。
毛细管电泳的发展
由于石英的导热性较好,因此毛细管内外壁之间的温 差较小;而毛细管外壁与环境之间的温度梯度最大。 所以为提高散热效率,应采用粗外径的毛细管柱,以 增大毛细管柱的外表面面积。由于毛细管柱中沿径向 存在一个抛物线型的温度梯度,由此引起介质的粘度 在径向上的梯度分布,进而引起径向上的电泳速度梯 度。图为热效应引起的分离区带展宽示意图。
毛细管电泳的几种分离模式
在以上6中毛细管电泳分离模式中,除了毛细 管电色谱(CEC)和毛细管凝胶电泳(CGE) 需制备分离柱外,其它几种分离模式的区别仅 在于使用的缓冲溶液(背景电解质, background electrolyte, BGE)的区别。
毛细管区带电泳(CZE) 毛细管区带电泳(CZE)
第五章 毛细管电泳
第一节 概述
毛细管电泳的发展 毛细管电泳装置 毛细管电泳的几种分离模式
毛细管电泳的发展
电泳(Electrophoresis)是指溶液中带 电粒子在电场的作用下发生迁移的电动 现象。将电泳发展成为分离技术应归功 于Tiselius的工作。他于1930年建立 “移界电泳(moving boundary electrophoresis)”,成功地将人血清 中的蛋白质分为5个主要组分,这项工作 成为蛋白质化学发展的基础,因此 Tiselius本人荣获1948年诺贝尔化学奖。
毛细管等电聚焦(CIF) 毛细管等电聚焦(CIF)
基于不同蛋白质或多肽之间等电点的差异。 阳极电解质为稀酸(一般为磷酸),阴极电解质为稀 碱(一般用NaOH)。 将样品和两性电解质混合后充入毛细管。当电泳开始 时两性电解质和蛋白质发生迁移,两性电解质在毛细 管中形成一个pH梯度,蛋白质迁移至其等电点的pH区 域时,便停止移动,这样,各组分分别被聚焦在很窄 的pH范围内,所以,等电聚焦的分辨率很高。聚焦完 成后,在阳极和阴极电解质溶液中加入盐(NaCl和 NaOH)破坏已形成的pH梯度,使样品重新带电,在电 场作用下发生迁移,或采用压力将样品推出,进行检 测。
胶束电动色谱(MEKC) 胶束电动色谱(MEKC)
在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂(如 SDS),当表面活性剂浓度超过其临界胶束浓 度时,则形成亲水胶束,胶束具有疏水内核, 外层带负电荷。溶质分子则在极性缓冲液与胶 束中心的非极性相(准固定相)之间有一定的 分配。中性粒子因其本身疏水性不同,在二相 中分配存在差异。在电渗流作用下,胶束携带 溶质一起前行,疏水性强的溶质和胶束结合得 较牢,流出慢。不同分子在两相中的分配差异 是MECC分离的基础。
胶束电动色谱(MEKC) 胶束电动色谱(MEKC)
毛细管凝胶电泳( CGE) CGE)
聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶具有多孔性, 对于不同大小的分子阻力不同,所以可按分子 大小分离组分,这与分子排阻色谱原理是一样 的。毛细管凝胶电泳实际上是分子排阻色谱与 电泳的结合,可使被分离组分按照分子大小和 质荷比进行分离。由于在电泳分离中又增加了 凝胶的排阻作用,其分离能力很强。 以甲基纤维素、羟甲基纤维素等粘度较小 的聚合物代替聚丙烯酰胺凝胶的方法称为无胶 筛分。
毛细管等电聚焦分离原理示意图
1.预先在毛细管中充入两性电解质溶液;2.将样品和两性电解质 .预先在毛细管中充入两性电解质溶液;2 的混合溶液注入毛细管;3.电泳开始,在毛细管中建立PH梯度, 的混合溶液注入毛细管;3.电泳开始,在毛细管中建立PH梯度, 使蛋白质聚焦;4.用NaOH做阳极电解液,使蛋白质迁移,进行检测 使蛋白质聚焦;4.用NaOH做阳极电解液,使蛋白质迁移,进行检测
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