菌种管理规程

菌种管理规程
目的
规范药品微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种
的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

范围
本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、验收、保存、传代、使用及销毁等。

责任
●质量控制处主管：负责菌种的申购。

●微生物检验人员：负责菌种的验收、保存、传代、使用及销毁等。

●质量控制处经理：负责菌种申购计划的审核及日常督促检查。

●质量管理负责人：菌种申购计划的审核。

●制造中心总监：菌种申购计划的批准。

相关术语
●标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理
中心提供的冷冻干燥菌。

●传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存
的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

●工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养
后，作为日常工作使用的菌种。

●菌种的代是指将其接种至新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称
为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

相关文件
无
程序
1菌种的申购
质量控制处主管根据菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出申购计划，由质量控制处经理、质量管理部负责人审核，制造中心总监批准后，向中国药品生物制品检定所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可
以直接向省（市）药检所购买传代用菌种。

购买时，需询问和确定菌种的代数，以便传代时控制代数。

同时在运输过程中注意严格按照保存条件要求进行。

2菌种的验收
菌种到达实验室后，由质量控制处微生物检验人员验收，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《菌种接收记录》上，内容包括：名称、数量、编号、代数、来源、接收日期、接收人等，新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。

从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。

储存于2～8 ℃，有效期为3个月。

新购进的菌种斜面应在一周内完成传代。

3 菌种的传代：菌种的传代因冻干菌（标准菌种）与传代用菌种而不完全相同。

3.1标准菌种的复苏、确认、传代
3.1.1 标准菌种的复苏步骤如下：
➢把冻干菌种管、灭菌毛细滴管（1ml）、双碟、镊子、营养肉汤培养基（或其它适宜培养基）数支，移入接种室或超净工作台。

➢将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。

点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上，
烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养
基），滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。

➢取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培
养基）少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出
管内菌液，接种至营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）内，并根
据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24～72h（细菌需要 24～
48h的培养物，酵母菌需要72h的培养物，形成孢子的微生物则宜保
藏孢子）。

最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌（121℃，30分钟）。

黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2
滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7
天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无
色，接近菌层培养基略带黄色。

确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温
-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。

➢取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至100ml4.4.2项下液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。

以无菌技术向复壮后的菌种中加
入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。

每个菌种
制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，
即进行相应的确认。

其余作为储备管。

黑曲霉的h项下洗脱液按h
项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。

以无菌技术向
复壮后的菌种中加入20ml30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻
存管。

制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质
量控制，即进行相应的确认。

其余作为储备管。

将上述制备好的
冻存管逐支粘贴标签。

内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、
代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。

➢储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。

➢取出培养物，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活生长，若不浑浊，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细
菌应至少培养1周以上，真菌和酵母菌至少应培养2周以上，并
在丢弃之前应高温灭活处理（121℃，30分钟）。

3.1.2 标准菌种的确认
➢用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培
养基平板上，然后在30～35℃下培养1～3天（细菌）；23～28℃下培
养5天（真菌和酵母菌）。

培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形
态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌
划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴
定。

鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。

最后
再做生化实验以进一步鉴定该菌种。

➢若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。

应根据其原因采取
措施重新分离挑选纯菌落。

➢上述操作完成后，需填写《菌种传代、分离、鉴定记录》。

➢各菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见《菌种复活、划线用培养基、培养条件》（附件2）。

3.1.3 标准菌种的传代和保藏
➢按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代（G
），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单
1
个纯种菌落，此为第2代（G
）。

2
➢菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，
），同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作作为传代用菌种（G
2
用菌种，此为第3代（W
）。

3
➢将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。

3.2 传代用菌种的传代和保藏
3.2.1当无标准用菌种时，可从省（市）药检所购买菌种作为传代用菌种，不需经过复溶增菌，但应划线接种确认。

3.2.2将购回无异常的传代用菌种（一般为第3代），根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第4代)，同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种（仍为第3代）。

3.2.3传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：
➢从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。

➢将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。

➢关闭紫外灯。

点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，
右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分
在火焰上烧灼，往返通过三次。

➢右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一
下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管
口移至火焰上方。

➢塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，
使细菌接种在斜面的表面上。

➢取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。

➢将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。

➢按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。

➢当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。

3.3 工作用菌种的传代:当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。

3.3.1取在冰箱 4～8℃保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。

3.3.2也可取用“甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法”保存的菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。

3.4 传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。

同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护，工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具等。

如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检验人员应立即向质量控制处主管报告以便及时进行处理。

3.5传代后，按检定菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容包括：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。

交微生物组主办统一保管。

同时及时填写《菌种传代、分离、鉴定记录》。

4.3 各菌种的保存方法、条件及期限，见《传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限》。

5 菌种的编号
采用字母加数字表示：英文缩写字母—代次—传代日期—顺序号
菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副伤寒沙门菌（S.p）
代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种用G表示；工作用菌种用W 表示；如G3表示传代用菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。

传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。

如2012年01月12日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为：
E.c-G3-120112-01。

6 菌种的保管
6.1 菌种设专人加双锁保管，并对所保存的菌种建立《菌种保存、领用、发放登记台账》。

6.2 菌种的定期检查与鉴定
6.2.1在菌种的保存期间，应每天（工作日）检查保存菌种冰箱的温度、每周检查菌种管的塞子是否松动或生霉，并及时填写《检定菌种观察记录》，如有异常应及时处理。

6.2.2菌种在保存期内均应根据菌种的特性（工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次）检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态及生化特性等项目，若发现与原菌种变异较大，应重新分离、纯化、鉴定、再加以保存，并做好《检定菌种传代、分离、鉴定记录》。

6.3 所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。

7 菌种的领用与使用
7.1微生物学检验人员根据检验需要，需到菌种保管人员处工作用菌种或传代用
菌种，用于日常检验或验证试验，使用后及时填写《菌种使用登记表》和《菌保存、领用、发放登记台账》，以便追踪菌种使用历史。

7.2 冻干菌种管一旦解冻制备工作菌种后，不得重新冷冻和再次使用。

8菌种（废弃）的销毁
8.1下列情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采用121℃、30分钟湿热灭活处理：
新一代菌种制备成功后的上一代菌种；
使用完后的菌种和带有标准菌种的器具和培养物；
超过有效期的菌种；
凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种；
其他应废弃的菌种。

8.2废弃菌种的销毁由质量控制处微生物主办提出申请，交质量控制处主管批准后，由微生物检验人员进行灭活处理，填写《废弃菌种（物品）销毁处理记录》。