实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾和罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中的表达

实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾和罗氏沼虾卵黄蛋白原
mRNA在卵巢和肝胰腺中的表达
李媛媛;蔡生力;刘红
【摘要】Vitellin, as the major constituent of the yolk protein is to provide nutrition to the developing of embryos and early larve in crustaceans. Its source and biosynthesis regularity have been the focus of crustacean research in past decades. The accurate site for vitellogenin synthesis was investigated in two representative shrimp species Litopenaeus vannamei and Macrobrachium rosenbergii with real-time PCR in this experiment.Based on histological observation, the ovarian development was divided into six stages in L. vannamei (oogonium proliferation, previtellogenic, primary vitellogenic, secondary vitellogenic, mature, and recovery stages) and five stages in M. rosenbergii (previtellogenic, primary vitellogenic, secondary vitellogenic, mature, and gravid stages). It was found that both L. vannamei and M. rosenbergii expressed Vg-mRNA in hepatopancreas and ovary. In L. vannamei, the relative quantity of Vg-mRNA expression of each developmental stage was 1.1, 5.9, 10.4, 26.9, 85.3, and 1.5 in ovary, and 1.3, 3.2, 7.1, 37.2, 51.6, and 1.0 in hepatopancreas respectively. In M. rosenbergii, the relative quantity of Vg-mRNA expression of hepatopancreas in each ovarian developmental stage was 3.4, 12.6, 15.2, 38.9, and 2.9 compared to 1.0, 1.3, 1.7, 4.8, and 1.5 in ovary, respectively. In all examined shrimps the Vg-mRNA expression decreased sharply to the minimum at the last development stage. The
research confirmed that both penaeid shrimp(Litopenaeus vannamei) and caridea prawn(Macrobrachium rosenbergii) were able to synthesize the vitellin in ovary and hepatopancreas, and with the gonad development, the vitellin synthesis showed clear regularity.%卵黄磷蛋白作为卵黄蛋白的主要成分,可为甲壳动物胚胎和早期幼体发育提供能量,为研究其来源及合成规律,实验应用SYBR G reen Ⅰ荧光定量PCR法检测了凡纳滨对虾和罗氏沼虾性腺不同发育时期卵巢和肝胰腺两种组织中卵黄蛋白原mRNA的表达水平.结果发现,凡纳滨对虾和罗氏沼虾的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达.随着卵巢的发育,凡纳滨对虾卵巢中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前5个阶段不断增加,分别为1.1,5.9,10.4,26.9,85.0,恢复期急剧减少,为1.6.肝胰腺中的相对表达量也不断增加,分别为1.3,3.3,7.1,37.3,51.6,恢复期急剧减少,为1.0.罗氏沼虾肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前四个阶段不断增加,分别为3.4,12.6,15.2,38.9,抱卵期急剧减少,为2.9；而卵巢在整个发育过程中对卵黄蛋白原合成的贡献比较小,分别为1.0,1.3,1.7,4.8,1.5.研究表明,两种虾类的肝胰腺和卵巢均具合成卵黄蛋白的功能,而且在不同的卵巢发育阶段呈现明显的规律性.
【期刊名称】《水产学报》
【年(卷),期】2012(036)011
【总页数】8页(P1667-1674)
【关键词】凡纳滨对虾;罗氏沼虾;实时荧光定量PCR;卵黄蛋白原mRNA
【作者】李媛媛;蔡生力;刘红
【作者单位】上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306
【正文语种】中文
【中图分类】Q786;S917.4
卵黄积累是包括甲壳纲、昆虫纲等节肢动物卵母细胞发育成熟的必要前提[1], 也是雌性个体生殖周期中的关键阶段[2]。

虾类胚胎发育以及对虾类无节幼体完全依赖于卵黄来满足营养需要。

卵黄的主要成分是卵黄蛋白, 主要由脂肪和蛋白质组成, 卵黄磷蛋白(vitellin, Vn)又是卵黄蛋白的主要成分。

卵黄磷蛋白是在卵黄发生期, 由卵黄磷蛋白的前体—卵黄蛋白原(vitellogenin, VTG)释放到血淋巴中被卵母细胞吸收后加工(主要是糖基化)所形成[3]。

有关十足目甲壳类卵巢中卵黄的来源, 在过去的几十年研究中一直存在争议, 内源性合成和外源性合成都有报道。

Soroka等[4]对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)次级卵黄发生期的肝胰腺和卵巢进行离体培养发现, 肝胰腺有合成作用, 而卵巢未见有合成。

Yano等[5]通过组织和免疫化学的方法研究认为日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的卵巢是卵黄蛋白的合成场所,而肝胰腺合成的蛋白与抗卵黄磷蛋白血清没有沉淀反应,所以认为肝胰腺不是卵黄的合成场所。

Quackenbush[6]通过离体培养的方法研究认为肝胰腺可能是南方滨对虾(Litopenaeus schmitti)卵黄蛋白原的合成部位。

Fainzilber等[7]通过离体培养的方法研究认为短沟对虾(Penaeus semisulcatus)的卵巢是其主要的卵黄蛋白原合成场所,处于卵黄合成早期雌体的肝胰腺也有合成卵黄蛋白原的功能。

目前多数研究结果认为卵巢和肝胰腺是十足类的卵黄蛋白合成组织。

实时荧光定量 PCR ( real-time fluorescence quantitative PCR )技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出, 该技术实现了 PCR从定性到定量的飞跃, 具有灵敏度高, 特异性和可靠性强,能实现多重反应, 自动化程度高, 无污染, 具有实
时性和准确性等特点[8]。

该技术已经广泛应用于分子生物学领域。

Cheng等[9]应用实时荧光定量PCR技术对罗氏沼虾分别注射格氏乳球菌和注射生理盐水后, 体内血细胞和肝胰腺的超过氧化歧化酶基因的表达进行了定量检测。

马细兰等[10]运用建立的荧光实时定量PCR技术检测了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）GH、GHR 和 IGF-I基因表达的发育性变化。

本实验以国内外养殖最广泛的甲壳类凡纳滨对虾和罗氏沼虾为研究对象, 使用荧光定量 PCR技术, 对处于不同性腺发育时期的卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原 mRNA的表达进行相对定量检测,研究这两种虾类的卵黄蛋白原发生组织及其合成规律, 为在生产上人工调控虾类性腺发育提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 实验材料
实验用凡纳滨对虾为越冬亲虾, 2011年4月采集于海南省文昌市禄泰种苗集团。

罗氏沼虾 2010年6月采集于上海市金山区申漕种苗基地。

活虾运至实验室后, 观
察外部特征, 初步确定其发育阶段,并称量体质量, 测量体长, 然后进行解剖, 取其性
腺并称重, 计算性腺指数, 并记录。

每尾虾取性腺,肝胰腺, 肌肉各0.2～0.4 g, 立即
用液氮速冻, 放入无RNA酶的eppendorf管中并贮存于-80 ℃, 该样品用于总RNA提取, 其他卵巢用甲醛固定, 石蜡切片后进行组织学观察。

1.2 总RNA的提取
使用 Invitrogen公司的 Trizol试剂盒进行总RNA的提取。

用UV-4802H紫外可见分光光度计测量吸光值, 通过 OD260/280判断总 RNA纯度, 用1.5%的琼脂糖
凝胶电泳鉴定其完整性, -80 ℃保存备用。

1.3 cDNA的合成
使用北京艾德莱生物技术有限公司的TUREscript 1 st Strand cDNA Synthesis
Kit 进行RT-PCR扩增。

在干净的0.2 mL的无RNA酶的离心管中加入1 μL
oligo(dT)18 (0.5 μg/μL)，1 μL dNTP (10 mmol/L ),4 μL 5×RT Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor(40 units/μL)，1 μL TUREscript H-RTase，2 μL Total
RNA/mRNA，加 RNase-free ddH2O 至20 μL, 轻轻混匀后先于PCR仪上42 ℃孵育50 min, 再70 ℃加热5 min失活TUREscript H- RTase。

得到的cDNA可以用于PCR扩增或者保存到-20 ℃备用。

1.4 引物设计
参照 GenBank中凡纳滨对虾卵黄蛋白原mRNA和18 S ribosomal RNA的相关序列, 分别设计用于荧光定量的目的基因和内标基因的特异性引物(表1)。

参照GenBank中罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA和18 S ribosomal RNA的相关序列, 分别设计用于荧光定量的目的基因和内标基因的特异性引物(表 2)。

表1 凡纳滨对虾荧光实时定量 PCR分析所用引物Tab. 1 Primers used for real-time fluorescence quantitative PCR analysis of L. vannamei引物primer 序列primer sequence F-Vitellogenin mRNA-F 5’-GGAAATCAAGGAGCGATCAGAA -3’F-Vitellogenin mRNA-R 5’-AATAAGGGCAGGGAGGACAAA -3’F-18S ribosomal RNA-F 5’-CCTCGGTTCTATTTTGTCGGTTT -3’F-18S ribosomal RNA-R 5’-GCAGATGCTTTCGCAGTAGGT -3’
表2 罗氏沼虾荧光实时定量 PCR分析所用引物Tab. 2 Primers used for real-time fluorescence quantitative PCR analysis of M. rosenbergii引物primer 序列primer sequence L-Vitellogenin mRNA-F 5’-CGAAGAGGCAATACCACAAACTC-3’L-Vitellogenin mRNA-R 5’-CTTCCACCATAACCTTGACTGCT -3’L-18S ribosomal RNA-F 5’- GTCTGTGATGCCCTTAGATGTCC-3’L-18S ribosomal RNA-R 5’- GCAAGCCCCAATCCCTATC-3’
1.5 常规PCR
PCR扩增25 μL体系为, cDNA模板2.5 μL、2×Master Mix 12.5 μL、5 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、ddH2O 9 μL。

反应条件为96 ℃预变性5 min; 94℃变性1 min、62 ℃退火 1 min、72 ℃ 延伸1 min,共37个循环; 72 ℃延伸10 min。

1.6 荧光定量PCR扩增
荧光定量PCR 25 uL扩增体系为 cDNA模板2 μL、SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、DEPC处理过的双蒸水9.5 μL。

两步法PCR扩增标准程序:95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s、62 ℃退火30 s, 共40个循环。

1.7 数据分析
在使用相对定量时, 因为 CT(反应管内的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数)值是指数关系, 不是线性关系, 不能用于t检验或方差分析(ANOVA)等统计分析方法。

统计数据时应将原始CT值进行2-CT 转换, 从而达到线性关系[11]。

卵黄蛋白原 mRNA基因相对表达水平用 Livak等[12]建立的2-ΔΔCt法计算, 公式为: ΔΔCt=试验组(Ct目的基因- Ct内标基因)-对照组(Ct目的基因- Ct内标基因)。

所有样品重复3次, 目的基因相对表达量用平均值±标准差表示, 数据分析采用SPSS 统计分析软件 Duncan氏法进行多重比较, 当P＜0.05时认为差异显著。

单因素方差分析, Duncan氏法多重比较, 以mean ± SE(n=3), 标有不同字母的值之间差异显著( P ＜ 0.05)。

2 结果
2.1 卵巢分期
根据组织学切片观察, 结合甲壳动物卵黄发生的特点和规律, 把凡纳滨对虾的卵巢发育分为6个时期:卵原细胞增殖期, 卵黄发生前期, 初级卵黄发生期, 次级卵黄发生期, 成熟期, 恢复期(表3)。

把罗氏沼虾的卵巢发育分为5个时期: 卵黄发生前期, 初
级卵黄发生期, 次级卵黄发生期, 成熟期, 抱卵期(表 4)。

表3 凡纳滨对虾卵巢发育分期Tab. 3 The ovarian development stages in L. vannamei分期 development stages 主要特征 main characteristics卵原细胞增殖期眼柄剪掉之前, 透明, 细线状。

性腺指数2.76, 卵母细胞直径在24～44 μm, 卵巢透明,细胞近圆形刚剪掉眼柄一两天, 半透明或白色。

性腺指数 3.5～4.28, 卵
母细胞直径在 50～78或117～171 μm, 核仁分布在细胞周围, 少量可见滤泡细胞初级卵黄发生期卵黄发生前期卵巢淡绿色, 逐渐变粗, 体积增大。

性腺指数5.06, 卵母细胞直径在132～220μm, 滤泡细胞迅速增大, 数量增加, 包围在卵细胞外, 形成滤泡细胞层, 细胞核缩小, 有油滴出现次级卵黄发生期卵巢淡黄色, 逐渐变粗, 体积进一步增大。

性腺指数7.69, 卵母细胞直径在170～260 μm, , 胞质出现大量嗜酸性颗粒成熟期卵巢充斥整个头胸甲和背部, 卵粒清晰可见。

卵母细胞发育完全成熟, 卵粒清晰可见滤泡细胞消失恢复期灰褐色, 卵巢急剧萎缩, 呈细线状。

卵子基本产完, 卵细胞被滤泡细胞吸收
表4 罗氏沼虾卵巢发育分期Tab. 4 The ovarian development stages in M. rosenbergii分期development stages 主要特征main characteristics卵黄发生前期白色透明或者半透明。

性腺指数: 1.3, 可见在发育的卵母细胞, 少量滤泡细胞初级卵黄发生期体积增大, 颜色加深呈现淡绿色。

性腺指数: 3.4, 滤泡数量增加, 形成滤泡细胞层次级卵黄发生期长块状, 草绿色, 体积增大, 前段延伸到头胸甲的
1/2处。

性腺指数: 6.8, 出现大量嗜酸性卵黄颗粒成熟期暗绿色, 完全充满整个头胸甲。

性腺指数: 10.3, 滤泡细胞消失, 卵黄颗粒充满整个细胞, 细胞核消失, 无核仁抱卵期卵巢萎缩, 外部呈现暗褐色或者灰褐色。

性腺指数: 1.3, 有许多滤泡细胞围成的空腔
2.2 退火温度的确定
以目的基因和内标基因的特异性引物在不同退火温度扩增模板卵黄蛋白原 mRNA
的 cDNA。

凡纳滨对虾模板cDNA和罗氏沼虾模板cDNA在62 ℃时扩增效果最好, 故选用62 ℃作为PCR扩增的退火温度。

2.3 PCR结果
以优化的PCR反应条件及程序进行常规PCR扩增, 反应结束以后取8 μL产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析, 结果显示, 电泳呈单一条带, 凡纳滨对虾卵黄蛋白原mRNA基因与内标基因18 S rRNA基因的PCR产物分别位于109和133 bp左右, 且无其他杂带。

罗氏沼虾卵黄蛋白原 mRNA基因与内标基因18 S rRNA基因的PCR产物分别位于137和125 bp左右, 且无其他杂带。

2.4 荧光定量PCR特异性
以优化的PCR反应条件及程序对凡纳滨对虾和罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA分别进行荧光定量PCR扩增, 软件分析显示扩增曲线均呈现典型的S型曲线(图1、图3)，溶解曲线分析显示只有一个峰值, 没有非特异性扩增（图2、图4）。

本实验采用2步法。

以10倍系列稀释的标准品为模板, 进行荧光定量PCR扩增, 结果表明, 在1～10-5范围内有良好的扩增曲线,用已经建立的荧光定量RT-PCR 方法在不同时间对每份样品重复检验3次。

图1 凡纳滨对虾卵黄蛋白原mRNA荧光定量PCR扩增曲线Fig. 1 PCR amplification curves of vitellogenin mRNA in L. vannamei
图2 凡纳滨对虾卵黄蛋白原mRNA荧光定量PCR溶解曲线Fig. 2 PCR melting curves of vitellogenin mRNA in L. vannamei
2.5 卵黄蛋白原mRNA基因与18S rRNA基因的荧光定量PCR标准曲线
凡纳滨对虾以次级卵黄发生期的卵巢中总RNA反转录而来的cDNA为模板, 将模板做10倍的梯度稀释, 共5个梯度, 每个梯度3个重复, 制作目的基因和内标基因的标准曲线。

图3 罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA荧光定量PCR扩增曲线Fig. 3 PCR
amplification curves of vitellogenin mRNA in M. rosenbergii
图4 罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA荧光定量PCR溶解曲线Fig. 4 PCR melting curves of vitellogenin mRNA in M. rosenbergii
图5 凡纳滨对虾卵黄蛋白原mRNA基因的标准曲线Fig. 5 Standard curve of Vg mRNA gene in L. vannamei
罗氏沼虾以成熟期的卵巢中总RNA反转录而来的 cDNA为模板, 将模板做 10倍
的梯度稀释,共5个梯度, 每个梯度3个重复, 制作目的基因和内标基因的标准曲线。

经过优化, 实时荧光定量检测系统计算出凡纳滨对虾和罗氏沼虾的目的基因(卵黄蛋白原mRNA)与内标基因(18S rRNA)的标准曲线相关系数r均为0.99以上, 扩增效率为90%以上。

斜率相差小于 0.1, 表明两者扩增效率已非常接近, 则可以用△△Ct
法进行相对定量分析。

图6 凡纳滨对虾18S rRNA基因的标准曲线Fig. 6 Standard curve of 18S rRNA gene in L. vannamei
图7 罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA基因的标准曲线Fig. 7 Standard curve of Vg mRNA gene in M. rosenbergii
图8 罗氏沼虾18S rRNA基因的标准曲线Fig. 8 Standard curve of 18S rRNA gene in M. rosenbergii
2.6 凡纳滨对虾卵黄蛋白原mRNA基因的相对表达量
在不同卵巢发育阶段, 凡纳滨对虾卵黄蛋白原mRNA基因在卵巢和肝胰腺中的相
对表达量见图9。

在肝胰腺中, 卵黄蛋白原mRNA的表达量随着卵巢的发育不断增加, 表达量从卵原细胞增殖期的1.3到成熟期达到峰值51.6, 特别是在次级卵黄发
生期和成熟期的卵黄蛋白原mRNA的表达量增加迅速, 与之前 3个发育期相比, 差异极显著(P＜0.01)。

消退期的卵黄蛋白原mRNA的表达量急剧下降, 与卵原细胞
增殖期相近,与肝胰腺相似。

在卵巢中, 卵黄蛋白原 mRNA的表达量在前5个阶段
也是不断增加, 从卵原细胞增殖期的1.1迅速增加, 在成熟期表达量达到峰值 85.0, 同样, 恢复期卵巢的卵黄蛋白原 mRNA的表达量也很低, 约为1.5, 与卵原细胞增殖期的表达量相近。

图9 不同发育期凡纳滨对虾卵巢和肝胰腺中的卵黄蛋白原mRNA的相对表达量1.卵原细胞增殖期; 2.卵黄发生前期; 3. 初级卵黄发生期; 4. 次级卵黄发生期; 5.成熟期; 6. 恢复期。

Fig. 9 Relative expression of Vg mRNA gene in ovary and hepatopancreas at different development stages in L. vannamei1. oogonium proliferation stage；2. previtellogenic stage；3.primary vitellogenic stage；4. secondary vitellogenic stage；5.mature stage；6. recovery stage.
上述结果显示, 肝胰腺和卵巢组织的卵黄蛋白原 mRNA表达量总体趋势基本一致, 都是随着卵巢的发育, 逐步增加, 尤其在次级卵黄发生期和成熟期增加迅速, 表达量达到峰值。

产卵后, 卵巢处于恢复期时, 表达量迅速下降, 接近卵原细胞增殖期。

从卵巢和肝胰腺两种组织mRNA表达量看总体水平基本接近, 卵巢略高。

2.7 罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA基因的相对表达量
罗氏沼虾不同发育时期卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中的相对表达量见图10。

随着卵巢的发育, 肝胰腺卵黄蛋白原 mRNA的表达量不断增加尤其在成熟阶段, 增长迅速, 比前一阶段(15.2)增加了150%, 达到峰值38.9, 消退期的卵黄蛋白原mRNA的表达量急剧下降, 与卵原细胞增殖期相近。

卵巢组织虽然可以在各个卵巢发育阶段检测到卵黄蛋白原 mRNA的表达, 但其表达量在整个卵巢发育阶段都较
低(＜2), 仅成熟期稍高(4.8)。

从结果看, 罗氏沼虾肝胰腺卵黄蛋白原mRNA的表
达量要比卵巢组织显著高, 约占总量的90%。

图10 不同卵巢发育期罗氏沼虾卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量1. 卵黄发生前期；2. 初级卵黄发生期；3. 次级卵黄发生期；4. 成熟期；5. 抱卵期。

Fig. 10 Relative expression of Vg mRNA gene in ovary and hepatopancreas at different development stages in M. rosenbergii1. previtellogenic stage；
2. primary vitellogenic stage；
3.secondary vitellogenic stage；
4. mature stage；
5. gravid stage.
3 讨论
近些年来, 国内外学者对甲壳动物卵黄蛋白原合成部位以及合成机理有较多的研究, 但结果不一致, 争论颇多, 一般认为卵巢、脂肪体、肝胰腺是卵黄蛋白原的可能合成部位。

20世纪 80～90年代, 对于十足目尤其是对虾的卵黄蛋白原合成部位的研究中不同的学者得出的结论不同,这些研究大多都建立在体外培养的基础上。

在短沟对虾的研究中，Browdyd[13]认为卵巢是其主要的卵黄蛋白原合成部位, 肝胰腺对卵黄蛋白原的合成作用很小。

Sagi等[14]用免疫学的方法发现罗致沼虾的肝胰腺有卵黄蛋白的合成功能,Okuno等[15]通过 Northern分析罗氏沼虾的肝胰腺有卵黄蛋白mRNA表达, 而卵巢和脂肪组织中没有发现。

张成锋等[16]利用反转录
PCR(reverse transcription PCR)的方法初步探讨了不同发育期的中国明对虾（Fenneropeaneus chinensis）卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原 mRNA的表达, 结果表明, 两者都有卵黄蛋白原 mRNA的表达, 都是卵黄蛋白的合成部位。

高祥刚等[17]利用半定量PCR方法对日本沼虾(Macrobrachium nipponense)卵黄蛋白原的合成部位进行了研究, 发现卵巢在卵黄蛋白原的合成中贡献较小, 肝胰腺贡献较大。

本实验中，无论是凡纳滨对虾还是罗氏沼虾,肝胰腺和卵巢均显示卵黄蛋白原mRNA的强烈表达, 表明两种组织都能合成卵黄蛋白原。

这一结果与Quackenbush[6], 张成峰等[16], 高翔刚等[17]等的研究结果一致, 而与 Yano等[5]的日本囊对虾卵巢是卵黄蛋白原的唯一合成组织结果不同，推测可能是由于实验方
法的不同所导致的差异。

本实验结果可见, 凡纳滨对虾肝胰腺和卵巢组织的卵黄蛋白合成显示一定的规律性, 卵黄蛋白原 mRNA表达量总体趋势基本一致, 都是随着卵巢的发育, 逐步增加, 尤其在次级卵黄发生期和成熟期增加迅速, 表达量达到峰值。

产卵后, 卵巢处于恢复期时, 表达量迅速下降, 表明卵巢在经过一个旺盛的合成卵黄蛋白活动后, 进入一个短暂的休息期, 为下一次发育做准备。

从凡纳滨对虾卵巢和肝胰腺两种组织mRNA 表达量看总体水平基本接近, 卵巢略高。

这一结果与Browdy等[13]对短钩对虾的研究结果有一定的差异, 其原因尚待进一步探讨。

罗氏沼虾的卵黄蛋白原mRNA表达在卵巢和肝胰腺中都可以检测到, 总的趋势也是随着卵巢的发育表达量逐步增强, 尤其是肝胰腺在成熟期,增长迅速, 表达量是前两个发育期的150%～200%。

进入抱卵期后, 卵巢有一个休整阶段, 卵黄蛋白合成活动相对较小。

与凡纳滨对虾不同的是罗氏沼虾肝胰腺卵黄蛋白原mRNA的表达量要比卵巢组织显著高, 约占总量的90%。

显然肝胰腺是罗氏沼虾卵黄蛋白原的主要来源。

这一结果也支持了高翔刚等[17]在日本沼虾研究中所认为的卵巢在卵黄蛋白原合成中贡献比肝胰腺小的观点。

十足目对虾派种类在人工繁殖条件下都较难成熟, 通常需要切除眼柄, 去除眼柄中的性腺抑制激素(gonadal inhibiting hormone, GIH)后, 卵黄发生才能启动, 从而达到卵巢发育成熟的目的。

与之相反,属于真虾派的沼虾类以及同是需要抱卵的爬行亚目蟹类, 在人工繁殖时, 其性腺发育非常容易,甚至需要通过调控温度和营养以控制其早熟。

这两类甲壳动物从繁殖习性看, 有着明显的区别, 对虾类需要产几十万到上百万卵, 卵巢需要吸收大量的卵黄以保证所产的卵能在水中完成胚胎和早期无节幼体发育。

沼虾类一般仅产几千到几万个卵,因此一次成熟对卵黄蛋白的需求比对虾类要小得多。

从卵黄蛋白的合成组织看, 同是卵生动物的鱼类、两栖类、鸟类的卵黄蛋白由肝脏
组织合成[18-19]。

昆虫由脂肪体合成[20-21], 甲壳动物则较为复杂, 已有的研究认为等足目类由脂肪体合成[22],十足目类主要由卵巢和肝胰腺合成。

目前的研究多数认为,对虾类主要依赖卵巢, 而本实验结果显示，肝胰腺和卵巢的贡献相近, 卵巢略高。

在罗氏沼虾中主要依赖肝胰腺, 卵巢贡献较小。

从比较生物学角度看, 卵黄合成组织有一个从脂肪体到卵巢再到肝胰腺的转变过程, 显示了与生物从低阶元向高阶元进化相类似的现象。

同时在十足目中卵黄蛋白的合成从对虾的主要依赖卵巢到沼虾类的主要依赖肝胰腺是否与对虾类卵黄蛋白合成较难, 不易成熟而真虾类则相对容易成熟有关联, 有待进一步深入探讨。

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