DNA的亚克隆综合实验方案

DNA的亚克隆综合实验方案
班级：生物科学1班姓名：魏小笛学号：108012011087
一、实验学时：3
二、实验类型：综合性实验
三、实验要求：必修
四、实验目的
对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等
五、实验内容
(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。

六、实验过程
一、目的DNA片段和载体的制备
选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。

根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端、不对称粘性末端、平端。

具体步骤:
１．按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。

•DNA 5μl
•10×buffer 1μl
•无菌水 3.5μl
•内切酶0.5μl
•总体积：10μl
２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。

３．Eppendorf管于３７℃水管中反应1小时。

４．反应结束后加入2μl的6XLoading buffer以终止反应。

５．混匀后0.8％琼脂糖凝胶上60伏电泳２小时。

载体的制备：
用碱裂解法制备质粒。

（PUC18质粒载体DNA）
具体步骤：
1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于37℃振荡培养14～18 h。

-培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。

影响质粒质量。

2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解,DNA变性。

5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。

-中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和
蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6.12000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。

-抽提掉剩余蛋白。

7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入1倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。

-可以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。

不要沉淀太久
8.1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

-不要太干，否则不易溶解。

9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用
二、目的DNA片段和载体的连接
1.在灭菌的EP管中，按下列参数准备连接反应体系10ul：
T4 DNA连接酶1ul
10Xbuffer 1ul
载体DNA xul
目的DNA片段yul
加DDH2O 至20ul
（载体DNA与目的DNA片段的摩尔数比控制在1:3~1:10）
2.在14°C保温反应12h，或4°C保温反应16~20h）
三、连接产物的转化
感受态细胞的制备：选用大肠杆菌
1．吸取1ml菌液，12000 rpm，离心1 min，以回收细菌。

2.每管加1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞,冰浴1min后12000 rpm，1 min 。

3. 重复2一次。

4.倒净上清液，倒置离心管1min，使残留液流尽。

每管加100 ul冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重新悬浮细胞（重悬时操作要轻），冰浴5分钟即成感受态细胞悬浮液。

连接产物的转化：
（1）取灭菌的Ep管，分别加入以下各组分：加入10～20ng质粒DNA （体积小于10ul），100ul感受态细胞悬浮液，1ul pUC18 （2）轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min。

（3）转入42℃水浴2min。

（4）迅速转入冰上冷却2min，修复细胞膜。

（5）加600ul无抗生素LB液体培养基，摇匀后于37℃，200 rpm，振荡60min。

使受体菌恢复正常生长状态。

（6）取200UL菌液涂板,置于37℃恒温培养箱倒置培养12－16h。

四、重组子筛选
采用蓝白斑筛选方式，白色菌落为含有重组分子的菌落，蓝色菌落为只含有空载体的菌落。