一、网织红细胞(Ret)计数

优点：操作简单、快速，同时可获得多项血细胞参数。 缺点： ①不同的仪器使用的溶血素不同，形成不同的Hb 衍生物，某些溶血剂形成的衍生物稳定性差，故应严 格控制溶血剂的加入量及溶血时间。 ②有些溶血剂虽加入KCN,但衍生物并不是HiCN,而 是氰化血红蛋白仪器需经过校正后才能进行Hb测定。 ③ 低色素性贫血、某些肝病等，由于RBC具有抵 抗溶血剂的作用，导致RBC溶血不完全而影响Hb测定。
RET分型
较成熟RBC稍大，直径8.0～9.5µm。
0 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
骨髓，
外周难见
(0.08%)
周围血少量
(0.15%)
外周最多
（60%以上）
பைடு நூலகம்
花冠型
有核
丝球型
充满，相互连接
网型、
松散，连成网
破网型
稀疏，丝点状
点粒型
散在，细颗粒 细丝状
ICSH 及NCCLS的定义：网织红细胞是已不含有细胞核的红细胞， 应分四型： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 。
染色后，使含有RNA的RBC被计数，自动计算出RET的%及绝对数。优点：
测量细胞多，避免主观因素、方法易于标准化。国外已广泛使用，国 内逐步推广使用。但成本高。
近年来，新型多参数血细胞分析仪具有Ret计数功能。
【质量控制】
1.抗凝血最好在4h内处理，保存在4º C，可延长至8h. 2.染色温度控制在37º C为宜，无论何种染液，室温（25º C） 以下染色时，RET检出率明显减低，故要求37º C恒温染 色。 3. 玻片法容易使血液中的水分蒸发，造成涂片困难，受染料沉 淀的干扰，故已少用。 4. 试管法为手工RET计数的首选方法，染液与血液的比例以 1:1为宜，严重贫血时可适当增加血液比例。 5. 推制血膜不宜太薄或太厚，否则会造成RET分布不均。 6. ICSH推荐使用Miller窥盘作Ret计数，其CV=10%±
费用低廉，国内目前使用的主要方法；但易产生沉淀。
四、操作 1. 取小试管一支，加染液和血液各2滴，混匀。 2. 置37℃水浴箱15min，取出后微振2min，推片。 3. 将Miller 窥盘放入目镜，选择合适部位计数，油镜下 Miller 窥盘的小格A内计数所有无核红细胞，大格B （含小格面积）内计数网织红细胞。或计数1000个红 细胞中的网织红细胞数。 五、计算 大格网织红细胞总数 1. Ret% = ×100 小格红细胞总数×9 B 2. 绝对值计算:RBC×Ret%（ × 109/L）
0.5～1.5 2.0～6.0
【测定方法及评价】
1.显微镜计数法：国内的主要方法，器材价廉、作简单、费用低。 缺点：工作效率低、精密度低，操作批内重复CV在20%以上；其相对 计数结果（%）显著受成熟RBC浓度的影响，使用Miller窥盘可将计数 精密度控制在CV≤15%，可提高工作效率。
2.网织红细胞仪测定法：采用流氏细胞技术，将RBC经特殊荧光染料
一、氰化高铁血红蛋白法 【原理】除SHb外，其他Hb均可被高铁氰化钾氧化成高
铁Hb(Hi)，再与试剂中的CN-结合，生成稳定棕红色 的HiCN，在540nm处比色，求得Hb的克数。
【器材和试剂】
1.分光光度计或血红蛋白比色计 2.血红蛋白转化液：WHO和国家卫生部临床检验中心 推荐 (文-齐氏液) 高铁氰化钾 K3[Fe(CN)3](AR) 200 mg 氰化钾 KCN 50 mg 磷酸二氢钾 KH2PO4 140 mg Triton X-100 0.5～1.0 ml 加水至 1000 ml。
【方法学评价】
3.十二烷基硫酸钠血红蛋白（SDS-Hb）测定法：
原理：除SHb外，其他Hb均可与低浓度SDS生成SDS-Hb 棕红 色化合物。最大吸收峰538nm,波谷500nm,其摩尔消光系数不 确定，不能用吸光度值直接计算。 特点：试剂无毒、结果准确、重复性好， 缺点：其依赖HiCN法间接得出结果，该试剂可破坏WBC， 不适于血细胞分析仪
【临床意义】
（3）作为观察病情的指标：
①溶血和失血性贫血在治疗过程中，连续进行RET计数， 可作为判断病情变化的参考指标。 如治疗后RET逐渐降低，表示溶血或出血已得到控制；
如RET持续不减低，甚至更见增高，表示病情未能控制， 甚至还在加重。
② RET计数对骨髓移植后造血功能重建情况及造血功能状 态估计有一定价值。如Ret> 15×109/L ,表示无移植并 发症；若Ret<15×109/L，说明可能失败。
5.Hb功能 运输O2和CO2,结合可逆。1分子Hb结合1分子O2 ，在标准 状况下，每克Hb能结合1.39 ml O2 。
。
血红蛋白测定
• 测定血液中各种血红蛋白的总浓度。 • 方法有多种
血红蛋白计法 氰化高铁血红蛋白法（HiCN） 十二烷基硫酸钠血红蛋白测定法（SLS-Hb） 其他方法
血红蛋白计法
3 1
A
控制Ret计数CV=10% (ICSH推荐)需镜检的RBC数
Ret（%） １～２ ３～５ ６～10 11～25 窥盘小方格内镜检RBC数 1000 500 200 100 相当镜检RBC总数 9000 4500 1800 900
【正常参考值】
方 法 年龄组 相对值（%）
显微镜 计数
成人、儿童 新生儿
障最为显著，典型病例RET常低于0.5%，甚至为0，RET绝对 值低于15×109/L常作为再障的诊断标准之一。也可见于急 性白血病时骨髓红系增生受抑制或因化疗、放疗造成的骨 髓抑制。
【临床意义】
（2）贫血治疗的疗效观察：
① 巨贫、缺铁经合理治疗后，RET逐渐↑，并先于RBC、 Hb的↑。用药后3～5d开始↑，7～10d达高峰(一般为 6～8%，高者达10%)，治疗2周左右逐渐下降，然后RBC、 Hb 才逐渐↑ 。 ② 再障治疗有效时，RET逐渐回升甚至轻微升高。
本试剂中含有少量KCN，废液必须无害化处理。
废液处理：用水按1:1稀释,再按每升液体加35ml次氯 酸钠，充分混匀，敞开容器口，过夜，使CN-氧化成N2 和CO2 ↑，或水解成CO32-和NH4+，然后倒入下水道。
【方法学评价】
1.氰化高铁血红蛋白（ HiCN ）法：
特点： ①WHO和ICSH推荐的标准方法，
步骤 1 加盐酸 比色方管内加入1.10当量盐酸到刻度20%（蓝色） 2 采血 采血20μl,擦去管外余血加入，清洗2-3次，混匀,使血 液与盐酸混合，成均匀黄褐色，将方管插入比色架，无刻度 面放前后面。 3 稀释 10分钟后滴加蒸馏水稀释，同时不断搅动混合，边滴边观察 色泽是否与标准黄褐色相同。接近时，慢慢加入直到颜色完 全相同，停止滴加蒸馏水。 4读数 此时观察方管内凹最低处刻度即每100ml血液中含血红蛋白 克数（红色）。
血红蛋白特点
1. 完整的Hb分子，具有四级空间结构的四聚体，只有
这种四级结构才具备结合O2和CO2的能力。
2. 珠蛋白具有种属特异性,每个珠蛋白分子含两条α 链和非α链。正常成人Hb有三种:
①HbA(α2β2 ),占90%,
②HbA2(α2δ2 ) ， 占2～3%， ③HbF(α2γ2，＜2%）；新生儿HbF占70%， 1岁后降至成人水平。
氰化高铁血红蛋白法
【操作】20µl血加入5ml转化液,冲洗吸管2～3次 混匀, 室温置５min 后，转化液作空白，于540nm（1cm光径） 比色。 【计算】Hb(g/L) = Aλ 540 × 64458/(44×1000) ×251=A×367.7 也可用市售Hb标准品（50、100、150、200g/L）作标 准曲线。也可用校准后得血红蛋白仪直接测定。 【注意事项】
【临床意义】
（1） 评价骨髓造血功能： ① RET↑是红系造血功能活跃的反映。表示骨髓造血功能旺
盛，见于增生性贫血，以溶贫最为显著（6～8%，急性溶血 可达20%，严重者可达40～50%）；急性失血可明显↑ ；缺 铁和巨贫RET正常或轻度↑ 。
② RET↓表示骨髓造血功能减低，多见于再障，尤以急性再
②具有操作简单、 ③结果稳定可靠， 504 ④参考品保存时间长，便于质控， ⑤读取光密度后可直接定值等优点。 缺点：① ② ③ ④ 不能测SHb； 对HbCO转化速度慢（需100min）； 高球蛋白或高白细胞血样，试剂易浑浊； 含剧毒药品KCN.应作减毒处理。
540
两种方法比较
HiCN法 定体积 测吸光度计算 精度高 仪器试剂要求高 比色法 定吸光度 测体积计算 精度低 仪器试剂要求低
网织红细胞（Ret）计数
RBC生成过程：
RET
多能干细胞
原红
早幼红
中幼红
晚幼红
成熟RBC
Ret概念: 是介于晚幼红和成熟红细胞之间尚没有完全成熟的红细胞，因其
胞浆中尚有残存的嗜碱性物质（RNA、核糖体）经活体染色后，聚集成深 染颗粒，颗粒多时形成网状，故名网织红细胞。 正常情况下，晚幼红脱核后平均需2天才能发育成完全成熟的RBC。
故认为
RET
【器材和试剂】
3
1 A
1. 显微镜、Miller窥盘。 B 2. 新亚甲蓝染液（WHO推荐） 新亚甲蓝N 0.5g 草 酸 钾 1.6g 蒸 馏 水 100ml ，用前过滤。 WHO推荐，其对Ret染色力强且稳定，但该染液在室温下只稳定3周； 3.灿烂甲酚蓝染液： 灿烂甲酚蓝 柠檬酸三钠 氯化钠 双蒸水 1g 0.4g 0.85 100ml ，用前过滤。
血红蛋白测定
血红蛋白组成 珠蛋白肽链（4条）,每条折叠的珠蛋白肽链结合1个 亚铁血红素，分子量64458（不带O2）。 珠蛋白肽链 珠蛋白肽链 珠蛋白肽链 珠蛋白肽链 亚铁血红素 亚铁血红素 亚铁血红素 亚铁血红素
原卟啉 Fe 2+ 原卟啉 Fe 2+ 原卟啉 Fe 2+ 原卟啉 Fe 2+
血 红 蛋 白
【正常参考值】
成人男： 120～160 g/L 成人女: 110～150 g/L 新生儿: 170～200 g/L
【临床意义】
贫血诊断优于RBC. Hb<120 g/L, （女，110 ）轻度， Hb<90 g/L, 中度 Hb<60 g/L, 重度 Hb<30 g/L, 极重度
【质量控制】
1.技术误差：稀释倍数尽量准确，分光光度计波、比色杯 光径要经常校正，以减少技术误差。 2.HiCN转化液：应置棕色瓶中，不得使用塑料容器，以防 CN-丢失。 3. HiCN参考液：是制备标准曲线、计算K值、校正仪器及 其他测定方法的关键物质，ICSH公布严格的 规格和制备方法。国产标准品已有供应
4.叠氮高铁血红蛋白（HiN3）测定法： 5.碱羟血红蛋白（AHD575）测定法：
试剂毒性较低，较准确、重复性较好，但仍存在公害问题， 对HbCO转化慢（20min）。
优点：准确度、精密度均较高，参比标准为氯化血红素。 缺点：参比标准纯度不达标，不便自动分析。
【方法学评价】 6.血细胞分析仪法
逐渐替代手工，
血红蛋白结构图
血红蛋白特点
3. 亚铁血红素无种族特异性，由2价铁离子和原卟啉组成呈扁平型。 4. Hb状态 氧合Hb(HbO2 ）
--与O2结合，
还原Hb(Hbred）-脱氧 高铁Hb(Hi)-被氧化成。
碳氧Hb（HbCO）-与CO结合， 硫化Hb（SHb）-病理情况
Hb及衍生物因结构不同具有不同的吸收光谱。