磁珠法核酸自动提取温度控制系统设计

磁珠法核酸自动提取温度控制系统设计
江琴;张彦娥;林建涵;王禹贺;李莉
【摘要】针对自主设计的基于纳米磁珠的自动核酸提取系统设计了温度系统,主要包含系统温度控制算法分析、硬件电路设计及相关软件设计;系统温度采用全加热和在固定频率及占空比PWM波控制下间歇性加热的分段控制,通过实验确定全加热时间及PWM波的占空比,并建立知识库,可以满足使用多种磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的温度要求;用该系统为河南惠尔纳米科技公司试剂盒中裂解液及洗脱液加热,实验发现,裂解时8个裂解孔的最大温度差异小于6℃,洗脱时8个洗脱孔的最大温度差异小于5℃,均满足核酸提取实验时对温度的要求.
【期刊名称】《计算机测量与控制》
【年(卷),期】2014(022)010
【总页数】3页(P3378-3380)
【关键词】自动核酸提取;温度;控制算法;磁珠法
【作者】江琴;张彦娥;林建涵;王禹贺;李莉
【作者单位】中国农业大学现代精细农业系统集成研究教育部重点实验室,北京10083;中国农业大学现代精细农业系统集成研究教育部重点实验室,北京10083;中国农业大学现代精细农业系统集成研究教育部重点实验室,北京10083;中国农业大学农业部农业信息获取技术重点实验室,北京 100083;中国农业大学现代精细农业系统集成研究教育部重点实验室,北京10083
【正文语种】中文
【中图分类】TP273
0 引言
磁珠分离法是一种新型的核酸提取法，已经广泛运用［1－3］，利用核酸可吸附
在磁珠表面的特点，在外加磁场的作用下可实现核酸的快速分离，易实现自动化［4］。

磁珠法核酸自动提取仪可以简单、快速、高效和经济地实现各种样本核酸的自动提取［5］。

磁珠分离法提取核酸一般包括：裂解、结合、洗涤、洗脱4个步骤［6］。

其中裂解和洗脱两个步骤一般需要在合适的温度下才能达到最佳效果。

本文针对自主设计的核酸自动提取系统设计了一套温度控制系统以保证核酸提取质量。

该温度控制系统采用STM32单片机为主控芯片，4条电热陶瓷片作为加热元件，Pt100作为温度监测传感器，并用C#软件编辑核酸提取系统软件界面和温度控制算法，能对裂解和洗脱有温度要求的两个环节实现温度调节控制，提高核酸提取质量和效率。

1 系统总体设计
1.1 温度控制系统的工作环境
核酸自动提取系统主要配合市售96孔采样板进行核酸提取，采样板有12列，每
列8个孔，规定第1、7列为存放裂解溶液的裂解孔，第2、8 列为存放磁珠溶液
的磁珠孔，第3、4、5、9、10、11列为存放洗涤液的洗涤孔，第6、12列为存
放洗脱液的洗脱孔。

温度控制系统需要控制裂解液和洗脱液温度使其满足磁珠法提取核酸试剂盒使用说明书规定的要求，因此设计核酸提取仪放置采样板的基座，其结构如图1所示。

图1 96孔采样板（a）及放置基座结构（b）
该设计结构可保障4个凹槽导热块与采样板底座紧密契合。

导热块底部固定陶瓷
加热片，通过程序控制加热片的加热，达到期望温度。

1.2 温度控制算法选取
核酸提取需要的温度及使用试剂量需要按照核酸提取试剂盒说明进行，不同厂家的试剂盒对温度及试剂量的要求不同，尤其是试剂量的变化将导致温度系统响应变化，增加了建立温度响应数学模型的难度。

通过大量实验发现，若以某个固定功率持续不断地给该系统加热，系统最终会保持在某一个恒定温度，这是由于加热功率与散热功率达到了一个平衡。

陶瓷片以某固定功率加热时导热块温度与深孔板内液体温度变化趋势如图2所示。

图2 固定功率加热温度趋势图
基于此，本文提出了一种分段开环控制模式。

加热分为两个阶段：第一阶段陶瓷片全功率加热，第二阶段以一个固定占空比PWM 波控制陶瓷片加热。

其中，全功率加热可以使裂解液及洗脱液快速达到实验要求的温度值，而固定PWM 波控制的加热使得系统温度保持在样品裂解或洗脱的要求值。

因此，全功率加热时间及PWM 波占空比是本控制方法最重要的控制参数，参数
的确定是本控制方法的核心。

本研究通过实验法确定市场上较常用的几种试剂盒，找到合适的参数，并建立温度控制知识库。

为了提高系统的普适性，若使用知识库中没有的试剂盒做实验，可以通过选择知识库中已有的要求相近的试剂盒方案进行实验，也可以通过软件自设定全功率加热时间及PWM 波占空比这两个参数进行
实验。

2 系统硬件设计
2.1 硬件系统构架与功能
核酸自动提取仪温度控制硬件系统主要包括温度采集单元、温度控制单元、RS232串口通讯单元。

其整体结构如图3所示。

图3 系统整体结构框图
本系统采用STM32F103ZET6单片机作为核心控制芯片，通过串口接收上位机设
定的加热指令控制单片机工作，单片机根据此指令控制陶瓷加热片为裂解液和洗脱液加热，使其达到设定温度并基本保持不变。

导热块的温度虽不能完全准确代表采样板中溶液的温度，但由图2可知它们之间存在线性关系，所以监测导热块的温
度状态可以知道溶液中温度的基本状态，因此本系统为了精确测量导热块的温度，采用高精度热敏电阻Pt100作为温度传感器，实时监测导热块温度并通过串口传
送给上位机显示。

2.2 温度采集单元
本系统采用封装尺寸很小热敏感元件Pt100作为温度传感器实时监测导热块温度，Pt100温度范围为0～300℃，利用导热硅胶将其固化埋入导热块末端底部的小槽中。

再利用Pt100温度变送器将热敏电阻变化信号转换成5～20mA 的恒流源信号，通过100Ω 的采样电阻将电流信号转化为电压信号，此电压信号经过RC电路滤波后再经过电压跟随器后传输到单片机的模拟输入端，增大输入阻抗，使单片机的模拟输入端不存在灌电流，保证微控制器内部A／D 转换的准确性。

2.3 温度控制单元
陶瓷加热片的加热功率直接影响着温度效果，选用继电器作为执行元件，通过单片机输出PWM 波控制继电器的开合状态，PWM 波的占空比越大加热强度越大。

由于单片机输出的PWM 波不能直接驱动继电器，设计了继电器温控电路。

采用光电耦合元件TLP521实现了电气隔离，减小电路间干扰。

2.4 RS232串口通信单元
为了实现上位机与下位机之间的通信与控制，设计了RS232串口通信电路，采用MAX3232作为电平转换芯片，接入单片机的USART1＿RX 和USART1＿TX。

通过该串口通信电路可以将采集转化得到的导热块的温度传送到上位机，也可以将上位机的温度控制指令传送给下位机。

3 系统软件设计
系统温度控制软件界面如图4所示。

图4 温度控制软件界面图
该软件完成实验时对温度的设置，同时也完成温度控制知识库管理。

实验时，查看显示的温度设置列表，有与实验相符的温度设置，选择其前面的方形复选框，点击“确定”，这样系统就会将此信息传送给下位机进行温度控制。

另外点击进入“更新固定设置”页面可以添加已经实验好的温度控制方式的参数，丰富该温度控制系统的知识库。

可以选择前面的方形框，对不需要的温度控制知识库信息进行删除。

4 试验与结果
实验选取河南惠尔纳米科技公司试剂盒中裂解液及洗脱液加热，研究其裂解孔及洗脱孔的温度特性，从而验证本系统温度控制算法的精度及可行性。

4.1 裂解孔温度特性研究
根据磁珠法细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书，裂解需要在70℃下进行20～30 min，裂解液及样品的总体积约为350μL。

实验时，向深孔板第一列8 个裂解孔
中分别加入350μL 裂解液，然后放入深孔板基座中，设置裂解时间为40min。

选择知识库中实验参数进行温度控制，实验参数为第一阶段加热持续4 min，第二阶段以频率为1 Hz占空比为30%的PWM 信号控制加热。

测量8个孔的温度及裂
解列下面导热块的温度，温度变化如图5所示。

图5 裂解孔温度特性图
根据图5可知，导热块的温度快速升高到100℃，7 min后导热块的温度基本保
持在80℃左右，8个裂解孔在5min后温度基本保持稳定。

中间的四个孔（孔3、孔4、孔5、孔6）温度保持在70℃左右，孔2、孔7温度保持在67℃左右，孔1、孔8与其他孔温度差异略大保持在64℃左右。

各孔在进入温度稳定后自身的
温度波动在1℃以内。

由图5可知，该温度控制模式也完全能够满足裂解实验要求。

4.2 洗脱孔温度特性研究
根据试剂盒要求，洗脱时，加入200μL 洗脱液，65℃下进行10min。

实验时向深孔板第6 列8 个洗脱孔中分别加入200μL洗脱液，然后放入深孔板基座中，设置洗脱时间为15min。

选择知识库中相应选项进行温度控制，设置第一阶段持续加
热时间为2.5 min，第二阶段以频率为1 Hz占空比为25%的PWM 信号控制加热。

测量8个孔的温度变化及洗脱列下面导热块的温度，实验结果如图6所示。

图6 洗脱孔温度特性图
根据图6可知，导热块温度迅速升高到约85℃后缓慢下降，5min后一直保持在72℃左右。

8个洗脱孔的温度在3min后进入平稳期，中间位置的孔3、4、5、6
的温度保持在65℃左右，孔2、7的温度保持在63℃左右，最旁边的1孔8孔温度保持在60℃左右。

出现以上情况主要是由于两侧孔散热面积较大引起的，这也
间接导致孔2、7温度也与最中间的孔相差2℃。

这种每列中每个孔之间的温差现
象是采用深孔板进行核酸提取不可避免的，但是从核酸提取机理来看，洗脱温度与核酸提取试剂盒的要求略有差异，实验结果影响不大。

实验结果表明，所设计的温控系统可以满足磁珠分离法提取核酸中样品裂解和洗脱过程中的恒温要求，并且具有升温快、操作简单、性能稳定等优点。

5 结论
本文基于自主开发的磁珠法核酸自动提取系统进行了温度控制算法研究，设计了相应的硬件电路和软件程序。

分段加热控温模式，使得该温度控制系统能够满足使用市场上多种试剂盒进行核酸提取时的温度要求。

已经得到验证的温控参数可保存到系统知识库中，需要时可方便地调用。

使用河南惠尔纳米科技公司的酸提取试剂盒进行实验，研究裂解时和洗脱时裂解孔及洗脱孔的温度特性，实验表明每个孔的温度都稳定在实验要求温度的附近，裂解时8 个裂解孔的最大温度差异小于6℃，洗脱时8个洗脱的最大温度差异小于5℃，且此差异在允许范围内，并不会影响结果。

故本文开发的自动核酸提取仪温度控制系统基本达到了设计要求，对核酸自动提取
仪的开发起到了积极的作用。

【相关文献】
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