瓜尔胶酶解法制备半乳甘露低聚糖及其产物表征

瓜尔胶酶解法制备半乳甘露低聚糖及其产物表征
赵晓峰;姚评佳;魏远安
【摘要】用β-甘露聚糖酶水解瓜尔胶制备了半乳甘露低聚糖(Galacto-mannan-oligosaccharides,GMOS),用时间飞行质谱(MALDI-TOF)、13CNMR表征了产物结构.以底物酶解率为指标,通过L16(43)正交实验,确定在底物质量分数为0.3%、50℃下的最佳酶解条件为:pH值7.0、酶解时间10 h、加酶量40 U·(g瓜尔胶)-1.MALDI-TOF 质谱分析证明,GMOS主要由2～10个单糖组成;13CNMR分析证明,GMOS主链的D-甘露糖基C6上通过糖苷键连接有1个半乳糖残基支链.【期刊名称】《化学与生物工程》
【年(卷),期】2009(026)012
【总页数】4页(P37-40)
【关键词】瓜尔胶;半乳甘露低聚糖;β-甘露聚糖酶;表征
【作者】赵晓峰;姚评佳;魏远安
【作者单位】广西大学亚热带生物资源利用保护重点实验室,广西,南宁,530004;广西大学亚热带生物资源利用保护重点实验室,广西,南宁,530004;广西大学亚热带生物资源利用保护重点实验室,广西,南宁,530004
【正文语种】中文
【中图分类】Q814;TS244
β-甘露聚糖酶(β-Mannanase)是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露多
糖的水解内切酶，广泛应用于甘露低聚糖的工业化生产[1，2]。

其水解底物——
甘露多糖包括葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖两大类，前者以魔芋粉为代表，后者包括瓜尔豆胶、野皂荚胶、田菁胶和胡芦巴胶等。

其中魔芋粉的酶解产物是葡甘露低聚糖(Mannan-oligosaccharides，MOS)，文献报道较多[3，4]。

半乳甘露聚糖的主链与葡甘露聚糖相似，均由D-甘露糖通过β-1, 4-糖苷键连接而成，但是侧链则是不均匀地由单个D-半乳糖通过α-1, 6-糖苷键连接在主链的D-
甘露糖元的C6上。

近来，有关β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖的工艺条件和水
解产物的结构特点，陆续有所报道[5，6]，但对产物的表征手段仅限于TLC、IR、XRD等。

作者在此以瓜尔胶作为β-甘露聚糖酶(只对主链上的β-1, 4-糖苷键进行酶切，而
对α-1, 6-糖苷键不起作用)的酶解底物，优化了其酶解条件，并采用时间飞行质谱(MALDI-TOF)、13CNMR表征了产物结构。

1 实验
1.1 材料、试剂与仪器
瓜尔胶，北京瓜尔润公司；β-甘露聚糖酶，北京微科创业生物技术公司；甘露糖，捷瑞生物工程(上海)有限公司；甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖，Sigma公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酒石酸钠、3，5-二硝基水杨酸等均为国产分析纯。

UV-1700型紫外可见分光光度计，岛津公司；恒温培养摇床，上海智城分析仪器
制造有限公司；201DC型高效液相色谱仪，美国Waters公司；Freezone 6型冷冻干燥机，美国Labconco公司；高速冷冻离心机，美国Beckmann公司；AVANCE AV 500 MHz型超导核磁共振谱仪，瑞士Bruker公司；BIFLEX Ⅲ型MALDI-TOF 质谱仪，Bruker Daltonics 公司；JB90-S型数字显示电动搅拌机，
上海标本模型厂；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 酶解法制备半乳甘露低聚糖
以0.3%(质量分数，下同)的瓜尔胶液为底物，加入一定量的β-甘露聚糖酶[加酶量以U·(g瓜尔胶)-1计]，在50℃、pH=5.0的条件下摇床反应10 min，得到半乳
甘露低聚糖(GMOS)。

为了测定瓜尔胶的降解程度，将酶解液离心，取上清液适当稀释后用DNS法[7]测定酶解液中的还原糖(以甘露糖计)。

按式(1)计算瓜尔胶的酶解率。

酶解率
(1)
以每分钟酶解瓜尔胶产生1 μmol相当于甘露糖的还原糖的酶量定义为1个β-甘
露聚糖酶单位(U)。

1.3 酶解条件优化正交实验
由于β-甘露聚糖酶的最适温度为50℃，故选择50℃作为最适酶解温度，以0.3%瓜尔胶为底物，以底物的酶解率为指标，以加酶量(U·g-1)、pH值和酶解时间为影响因素，进行L16(43)3因素4水平正交实验，通过极差分析和实验结果确定最佳酶解条件。

1.4 半乳甘露低聚糖产率的测定
在最佳反应条件下进行酶解反应，反应完毕在沸水中将酶灭活，酶解液过滤，移至超滤装置中，在0.2 MPa的压力下，使用截留分子量为1000 Da的超滤膜截取分子量<1000 Da的寡糖。

收集超滤透过液，浓缩，冷冻，干燥，即得GMOS干粉，准确称取其质量。

按式(2)计算GMOS的产率。

产率
(2)
1.5 酶解产物的表征
用时间飞行质谱(MALDI-TOF)鉴定酶解产物的分子量和聚合度。

质谱仪的氮激光
器波长337 nm，采用延时引出(Delayed extraction)和反射(Reflection)的工作方式，加速电压19.5 kV, 反射电压20 kV，延时引出电压14.5～16.5 kV，延时时
间50～200 ns，正离子检测。

用核磁共振碳谱(13CNMR)对酶解产物进行结构表征。

并用高效液相色谱法(HPLC)检测酶解产物中各组分的含量，色谱条件：色谱柱NH2 Column (416 mm×250 mm)，柱温30℃，流速1 mL·min-1，进样量为20 μL，流动相乙腈∶水=
75∶25。

根据GMOS保留时间定性，色谱峰面积归一化法定量。

2 结果与讨论
2.1 正交实验结果与分析
按照L16(43)设计正交实验方案，测定了不同条件下瓜尔胶的酶解率，结果见表1。

从表1的极差分析可以看出,各因素对瓜尔胶酶解率的影响大小依次为：pH值>加酶量>酶解时间。

最佳酶解条件为：pH值7.0、酶解时间10 h、加酶量40 U·g-1。

2.2 半乳甘露低聚糖的产率测定
在上述最佳酶解条件下，对1000 mL 0.3%瓜尔胶液进行酶解反应，酶解液通过截留分子量1000 Da的超滤膜，透过液经浓缩，冻干，得到GMOS干粉1.27 g。

按式(2)计算，GMOS的产率为42.3%。

2.3 半乳甘露低聚糖的结构表征
2.3.1 MALDI-TOF分析
表1 正交实验结果与分析Tab.1 The results and analysis of orthogonal experiment实验号影响因素加酶量/U·g-1pH值酶解时间/h酶解率/%1204 0410．142205 0617．563206．580．504207 01021．945304 0612．606305 0421．127306．5105．928307 0823．109404 0814．6310405 01026．4011406．546．7912407 0621．3713504 01015．3014505 0814．4815506．566．3116507
0426．36k112．5413．1716．10k215．6919．8914．46k317．304．8813．17k415．6123．1917．39R(极差)4．7618．304．22
β-甘露聚糖酶酶解产品(未经超滤)的MALDI-TOF谱图见图1。

图1 半乳甘露低聚糖的时间飞行质谱图Fig.1 The MALDI-TOF spectrum of GMOS
由图1可看出,质谱峰的质核比分别是527.5、689.5、851.6、1013.7、1175.8、1337.8、1499.9、1662.0、1824.0、1986.1、2149.1，一共11个峰。

在GMOS分子中，每个结构单元是一个单糖(甘露糖或半乳糖)残基，其质量数是162，因此，质谱峰的荷质比(m/z)可表示为：m/z=18+162×n+Na+, 其中n表示单糖数目、Na+是与低聚糖结合的钠离子。

由于设备的最小量程是500 m/z，所以图谱中没有单糖和双糖的分子离子峰，该图的质谱峰值从527.5开始。

各峰之间相差162,与已知单元是一个单糖(甘露糖或半乳糖)残基相符合。

从第一个峰(527.5)开始，其聚合度为3(三糖)，此后每个峰递增1个聚合度，直至最后的质谱峰(2149.1)为十三糖。

2.3.2 13CNMR 分析
GMOS的13CNMR谱图如图2所示。

图2 半乳甘露低聚糖的13CNMR 谱图Fig.2 13CNMR spectrum of GMOS
为了区别不同类型的碳，其中甘露糖基用man表示，半乳糖基用gal表示，图2中各种碳的化学位移如表2所示。

表2 半乳甘露低聚糖的13CNMR数据Tab.2 13CNMR data of
GMOSδ/ppmC1⁃man100．080C1⁃gal98．877通过糖苷键与甘露糖连接的
C4⁃man79．429、79．300、79．063带OH的
C4⁃man75．658C5⁃man74．159C3⁃man72．507C5⁃gal70．382通过糖苷键与半乳糖连接的C6⁃man69．417C3，C4⁃gal68．508带OH的
C6⁃man61．197C6⁃gal58．236
GMOS的13CNMR谱图具有以下特点:
(1)显示了半乳糖环上各个C的化学位移，这是以魔芋胶(葡甘露聚糖)为原料的酶
解产物葡甘露低聚糖所没有的。

(2)降解产物的C6-man除了出现一个61.197 ppm信号峰外(带OH的C)，还有
一个69.417 ppm的信号峰，这是C6通过糖苷键与支链上的半乳糖相连后，其化学位移向低场移动的结果。

(3)降解产物的C4-man除了出现一个75.658 ppm信号峰外(带OH的C),还有一组79.429 ppm、79.300 ppm、79.063 ppm的信号峰，这是甘露糖基C4通过
糖苷键与甘露糖相连后，受支链上半乳糖的空间结构影响，其化学位移向低场移动的结果。

13CNMR谱说明酶解产物是一种在主链D-甘露糖基C6上通过糖苷键连接1个半乳糖残基支链的半乳甘露低聚糖，其结构与带有葡萄糖支链的葡甘露低聚糖不同。

而与Vieira等[8]的研究结果基本一致。

2.3.3 HPLC分析
用截留分子量为1000 Da的超滤膜处理过的GMOS的HPLC谱图如图3所示，
色谱数据见表3。

图3 半乳甘露低聚糖的高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of GMOS
表3 半乳甘露低聚糖的HPLC数据Tab.3 HPLC data of GMOS序号保留时间
/min组分含量/%峰面积16．833半乳甘露二糖24．6117493428．091半乳甘露三糖4．7082247539．663半乳甘露四糖38．3182813412．812半乳甘露
五糖13．865897515．611半乳甘露六糖18．5988756
甘露糖、甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖标准品的保留时间分别为5.225 min、6.822 min、8.102 min、9.678 min。

在降解产物HPLC谱图中没有甘露糖的峰，
说明酶解产物几乎没有单糖。

保留时间为6.833 min的峰与甘露二糖(6.822 min)相似，说明它是二糖，以此类推其后4个峰分别是三糖、四糖、五糖和六糖。

因为降解产物已经用截留分子量为1000 Da的超滤膜分离过，七糖以上的组分已被截留，因此，只有六糖以下的组分。

Emis等[9]和Shimahara等[10]研究证明，β-甘露聚糖酶作用于魔芋胶或槐豆胶的作用位点是多糖链的非还原端的第3或第4个糖分子。

虽然不同来源的β-甘露聚糖酶对底物的作用深度不同，但主要产物是甘露低聚糖，相对来说，很少产生单糖。

本研究的结果与其相似。

3 结论
用β-甘露聚糖酶酶解瓜尔胶制备了功能性低聚糖——半乳甘露低聚糖。

通过正交实验得到了在底物浓度0.3%、50℃下的最佳酶解条件为：pH值7.0、酶解时间10 h、加酶量40 U·(g瓜尔胶)-1。

在此条件下进行酶解实验，经超滤分离，得到聚合度2～10的产品，产率为42.3%。

通过MALDI-TOF 质谱分析证明，酶解液超滤之前的GMOS组分主要由2～10个单糖组成，但经过截留分子量为1000 Da的超滤膜处理后，酶解液的组分主要由二糖、三糖、四糖、五糖、六糖组成。

通过13CNMR确定，本实验酶解产品是一种在主链D-甘露糖基C6上通过糖苷键连接1个半乳糖支链的半乳甘露低聚糖，其结构与葡甘露低聚糖有所不同。

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