罗氏qpcr程序中体系设置

罗氏qpcr程序中体系设置
一、实验操作
qPCR的实验操作可谓说是比较简单，有一套详细的说明书各位小伙伴们都不在话下，但是还有一些小tip！
1.试剂耗材准备：qPCR的操作简单但是要严谨！建议小伙伴们提前备好耗材和试剂！耗材保证：无酶无菌，个人建议尽量选择进口枪头，减少液体挂壁，更为准确。

（使用过很多厂家的八连管，进口的不管是做工还是结果上，本人都觉得更好，也欢迎小伙伴们好货推荐！）镊子提前高压，加样所用金属托架提前放置冰箱降温。

2.RNA提取和反转录：低温操作！Trizol提取时注意蛋白质层的分离！Mix配置后切忌不可反复冻融！注意空气中小片段核酸污染！RNA提取后不可久放尽快反转录。

3.体系配制：注意避光！首先口罩戴起，头发扎好；每个样品设置3个平行孔，保证数据真实可用；反转录时可能同一样本核酸有多个小EP管分装，建议配体系时尽量转移一个管中混匀后加样，保证平行孔间数据稳定；没有排枪的小伙伴们加样只要手法稳定也是能保证结果的。

（建议新手们提前在实验记录本上规划好加样安排，操作时不易出错，整理数据时也清晰明了。

）
4.上机操作：上机前首先离心，如果管内有“顽固”气泡可以用手指轻轻弹就能完美解决！加完的样本不能久置，须立刻上机。

二、曲线分析
qPCR结果的分析主要就是对曲线的分析，这次我们主要了解扩增曲线和熔解曲线。

扩增曲线：随着PCR反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度检测扩增产物量的变化。