中国药典无菌检查法

试验菌
②菌 液 制 备
培养基
培养温度 （℃）
培养时间 （小时)
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
生孢梭菌 白色念珠球菌 黑曲霉
营养肉汤
30-35
硫乙醇酸盐流体 改良马丁培养基 23-28 改良马丁琼脂斜面
18-24
24-48 5-7天
③培 养 基 接 种
试验菌
培养基
每管装量 接种管数 接种量
⑵ 灵敏度检查
①菌种
金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）[CMCC（B）
26003]
铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）
10104]
枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis)「CMCC(B)63501」 生孢梭菌 （Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941] 白色念珠菌 （Candida sporogenes）[CMCC（B）98001] 黑曲霉 （Asperjillus niger）[CMCC（F）98003]
(ml)
(支) （ml）
金黄色葡萄球菌 硫乙醇酸盐
12
2
1
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
生孢梭菌
白色念珠球菌 改良马丁培养基 9
2
1
黑曲霉
其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1支不接种作为空白
接种量 1ml含菌＜100cfu
培养时间 （天）
3
5
④ 结果判断
? 空白对照管应无菌生长，若加菌的培 养基管均生长良好，判该培养基的灵 敏度检查符合规定。
供试品的组分或原检验条件发生改
变时，检查方法应重新验证，并对每一 株试验菌逐一进行验证。
（1）菌种及菌液制备同培养基灵敏度试验方法 （2）方法
验证方法 培养基
接种菌
加菌量
（cfu）
直接接种法 硫乙醇酸盐 金黄色葡萄球菌 ＜100
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
枯草芽孢杆菌
改良马丁 白色念珠菌
＜100
黑曲霉
薄膜过滤法
⑵直接接种法
取规定量培养基分别接入小于 100 cfu的试验菌（6种菌）各2 管，其中 1管接入规定量供试品， 另1管作为对照。培养 3～5天。
（3） 结果判断
与对照管比较如含供试品各管中的 试验菌均生长良好，则供试品的该检验 量在该检验条件下无抑菌作用。按此法 进行供试品的无菌检查。
? 缩小与先进国家药典的无菌检查法 的差别
二、无菌检查法概念
系指用于检查药典要求无菌的药 品、医疗器具、原料、辅料及其 他品种是否无菌的一种方法。
同时指出：若供试品符合无菌 检查法的规定，仅表明了供试品 在该检验条件下未发现被微生物 污染。
三、增、修订内容
无菌检查法的设施及环境、培养基 名称、培养基种类及用途、培养基 制备及装量、培养基灭菌及贮藏、 培养基的适用性检查、试验用菌株、 最小检验量、 方法验证 、培养时间、 结果判断
⑵.改良马丁培养基（用于培养真菌） ⑶.选择性培养基 按硫乙醇酸盐流体培养基或改
良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使 用前加入适量的中和剂或表面活性剂。中和剂和 表面活性剂要经验证 如对氨基苯甲酸--用于磺胺类供试品
聚山梨酯80--用于非水溶性供试品 β－内酰胺酶（新增加的选择性培养基）
--用于β－内酰胺类供试品 0.5%葡萄糖肉汤培养基—用于硫酸链霉素等 抗生素的无菌检查
1、无菌检查的设施及环境
⑴试验环境应在洁净度10000级下的局部 洁净度100级的单项流空气区域内或隔离系 统中进行、其全过程必须严格遵守无菌操 作。
规定应定期按《医药工业洁净室（区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》 的现行国家标准进行洁净级的检测。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内 部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
⑵ 隔离系统的应用
应用隔离系统重要的两方面：一是 保护产品免受外源性污染，包括操 作人员、操作环境及外包装等的污 染，保证无菌实验结果的可靠性， 实现一次检出的要求;二是保护操作 人员免受实验过程中的有害物质带 来的污染。
2、培养基的名称、种类、用途
⑴.硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌和厌 氧菌）
2019年版《中国药典》 无菌检查
辽宁省药品检验所
抗生素室 李冰
2009.7
一、2019年版无菌检查法特点 二、无菌检查法概念 三、 2019年版增、修订内容 四、供试品的无菌检查法 五、菌种
一、2019年版无菌检查法特点
? 完善检查方法 ? 增加试验的可操作性
? 方法更具科学性，提高检出率，保 证检验结果的准确性
同直接接种法
接种管数 （支） 2 2 2 2 2 2
培养天数 （天Leabharlann 3-53-5 3-5接种2管中其中1管接规定量的供试品，另1管作为对照
⑴薄膜过滤法
将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤， 冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于 100 cfu的试验菌、过滤。取出滤膜接 种至相应的培养基中，或将培养基加至 滤筒内。另取一装有同体积相同培养基 的容器，加入等量的试验菌，作为阳性 对照，按规定温度培养3～5天。各试验 菌同法操作。
7、 稀释液、冲洗液
0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
如需要可加入表面活性剂或中和剂 应经方法验证证明其有效性，并对细菌 存活无影响。
修改原因：增加检出率，使受损的微 生物复苏
8、方法验证试验
在建立供试品的无菌检查方法时，
需对供试品的抑细菌和抑真菌特性及无 菌检查方法的可靠性进行验证
3、 培养基的制备、装量
? 培养基可按处方制备，亦可使用按该处 方生产的符合规定的脱水培养基。
? 硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高 度的比例应符合培养结束后培养基氧化 层（粉红色）不超过培养基深度1/2。 供试品接种前，培养基氧化层颜色不得 超过培养基深度的1/5，否则，须经 100℃水浴加热至粉红色消失（不超过 20分钟），迅速冷却，只限加热一次。
4、灭菌
?所有培养基、稀释液及冲洗液的灭 菌程序均应验证，方可采用。防止 灭菌不彻底或过渡灭菌
5、 培养基的贮存
? 制备好的培养基应在2-25℃、避光保存 ? 保存在非密闭容器中，应在3周内使用
(一般指配制的）。 ? 保存在密闭容器中，可在1年内使用
（一般指商品化的）。
6、培养基的适用性检查
⑴ 无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支， 培养14天应无菌生长。试验可 与供试品无菌试验同时进行。