D5020说明书（中文）_GAOQS

北京天漠科技开发有限公司（ZYMO RESEARCH 中国总代理）
ZYMO RESEARCH
The Beauty of Science is to Make Things Simple
EZ DNA Methylation-Direct Kit™EZ DNA 甲基化试剂盒- Direct
Catalog No. D5020 & D5021
操作手册
•亚硫酸氢盐直接转化来源于血液，组织或者细胞中的DNA •可很好的兼容小样品量的输入，如10个细胞或50pg的DNA
•尤其适用于FFPE（石蜡包埋组织）和LCM（激光捕获显微切割）样品
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EZ DNA Methylation-Direct Kit™
产品简述
EZ DNA Methylation-direct kit 是EZ DNA Methylation kit 和EZ DNA Methylation-gold kit的改进版，EZ DNA Methylation-direct kit可对来自血液、组织和细胞中的DNA直接进行亚硫酸氢盐转化,而不需要提取或纯化DNA，这个试剂盒的敏感性非常强，可对少至10个细胞或50pg的DNA进行修饰。

此试剂盒与EZ DNA Methylation-gold kit一样都是将DNA变性和转化过程合二为一（见下图），而且在处理和纯化的过程中，可以减少模版降解和DNA的损失，以便完全转化未甲基化的C。

回收的DNA对于PCR扩增，限制性内切酶消化，测序，微阵列等下游操作都是非常理想的。

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试剂制备
在使用前添加260μl (D5020)或1040μl (D5021)的Proteinase K Storage Buffer 到Proteinase K 管中。

使得Proteinase K 的终浓度为20 mg/ml，完全溶解后储存在-20°C。

添加790μl的M-Solubilization Buffer和300μl的M-Dilution Buffer到CT Conversion Reagent中混合，然后再添加160μl的M-Reaction Buffer混合。

制备好的CT Conversion Reagent对光很敏感，所以尽量减少在光下的暴露，CT Conversion Reagent应当在制备后立刻使用，其保存条件为隔夜使用室温保存，一周内使用4°C保存，一个月内使用-20°C保存。

添加24ml 100%的乙醇到6 ml M-Wash Buffer 中（D5020）,或者添加96ml 100%的乙醇到24 ml M-Wash Buffer 中（D5021）以配置成最终的M-Wash Buffer。

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EZ DNA Methylation-Direct Kit™
无论是血液、组织、细胞或者纯化的DNA，都可以作为此试剂盒的输入样品。

如果使用纯化的DNA，请直接参看第Ⅱ部分。

如果是血液、组织或细胞，参看附录I，对于特别推荐的样品（如，石蜡包埋组织和激光捕获显微切割样品）为了获得理想结果，虽然细胞数量可以在10-105，但每次处理的细胞数量最好在1x103 - 8x104 之间，如果使用比推荐的更多的细胞数量会导致DNA不完全的亚硫酸氢盐转化。

第I部分
用Proteinase K消化的样品
无论使用A还是B方案，消化都应当是在一管中进行（如PCR管），A和B的选择主要是根据细胞的数量或组织的类型。

1. 方案A 对于细胞数为2 x 103的样品采用此公式
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对于比较难消化的样品在消化后会出现沉淀，这种情况应当使用B方案
方案B 对于细胞数为1 x 105的样品采用此公式，此公式适用于所有难消化的样品
2. 在50℃下孵育样品20分钟。

注意：如是石蜡包埋组织、激光捕获显微切割样品等“固定"的组织 ，将孵育时间调整到4个小时（看附录I)
3. 如果是按照方案A，请直接参阅第II部分
如果是按照方案B，将反应体系混合，并且在10，000Xg的速度下离心5分钟。

使用20μl的上清液来进行亚硫酸氢盐的转化（第II部分会用谈到具体细节）
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EZ DNA Methylation-Direct Kit™
第II部分
操作步骤
1. 在PCR管中，添加20μl的样品（第I部分的第3步）到130μl的CT Conversion Reagent溶液。

混合样品并且离心以确保管盖和管壁上没有液滴。

注意：如果使用纯化的DNA，添加20μl的DNA到130μl的CT Conversion Reagent溶液中，如果DNA 的体积少于20μl，用水来补充至20μl。

2. 将PCR管放置到温度循环变温器中并按照以下步骤设置： ① 98℃ 8分钟 ② 64℃
3.5小时
③ 4℃ （最长不要超过20小时）
3. 添加600μl的M-Binding Buffer到套在collection tube 中的Zymo-Spin TM IC Column 中。

4. 将样品（步骤2）移置含有M-Binding Buffer的Zymo-Spin TM IC Column中。

盖上盖子颠倒几次来混合。

5. 在>=10,000 x g的速度下全速离心30秒。

去除滤出液。

6. 添加100μl的M-Wash Buffer到柱中。

全速离心30秒。

7. 添加200μl的M-Desulphonation Buffer到柱中并在室温下（20-30℃）放置15-20分钟。

孵育后，全速离心30秒。

8. 添加200μl的 M-Wash Buffer到柱中。

全速离心30秒，再添加200 μl 的 M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒。

9. 将柱子放置在1.5ml的离心管中。

直接添加10 μl的M-Elution Buffer到柱基质中。

全速离心30秒来洗脱DNA。

DNA可立刻使用或存储在-20℃下以便以后使用。

对于每次的PCR我们推荐使用1 - 4μl洗脱的DNA，如果有必要的话也也可以使用10μl，根据自身实验的需要，洗脱体积可以大于10μl，但少量的洗脱体积可以得到更纯的DNA。

附录I
仅当样品是特定细胞和组织的时候可以采用以下操作步骤。

最重要的是对于亚硫酸氢盐处理所使用的理想的DNA（第II部分）的量应当在1x103 – 8x104个细胞之间，虽然小到10或大到105细胞也可以使用。

注意：如果使用比推荐的更多的细胞数量会导致DNA不完全的亚硫酸氢盐转化。

重点！“难消化”的样品在消化后会产生肉眼可见的沉淀，此样品应按照方案B来操作。

造成此情况的原因主要是样品太大或阻碍了Proteinase K的消化。

包括连接组织（如软骨），脂肪组织和一些其它的固定组织等。

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EZ DNA Methylation-Direct Kit™
如果沉淀不能通过离心来去除，可能会影响转化过程导致DNA不完全的亚硫酸氢盐转化。

全血：使用0.5 μl全血针对每次Proteinase K消化（方案A或B），当样品量较多可调整Proteinase K 的体积。

例如，添加2.5μl全血到50μl M-Digestion Buffer、42.5μl水、5μl的Proteinase K。

固体组织（新鲜或冻存）：每次 Proteinase K消化（方案A或B），使用0.1mg 或 0.1μl 组织。

但是，Proteinase K消化的体积可以根据样品的量来适当调整。

例如，如果样品的体积增加到5次方来进行方案B的消化：添加0.5 mg 或 0.5 μl 的组织到 65 μl M-Digestion Buffer, 59.5μl水, 和 5μl 的 Proteinase K。

培养细胞和其它含有细胞的液体：悬浮液中的单层和细胞可从培养容器中或在收获后直接进行操作。

小量的培养基不会对整个方案产生影响但要尽量保持最小的量。

理想的来说，在Proteinase K消化前要把细胞在PBS或Tris缓冲液中悬浮。

其它含有细胞的液体（例如，从FACS或血沉棕黄层衍生来的）可作为样品直接使用。

如果液体的成分不确定，首先应当先通过离心来沉淀细胞并且去除上清。

然后将细胞在PBS或Tris缓冲液中重悬。

一般，来自体液的细胞可通过Proteinase K直接消化。

FFPE（石蜡包埋组织）和其它“固定”的组织：包埋组织应当在使用前脱腊，此步骤可通过经典的xylene-ethanol protocols来完成。

Proteinase K消化的时间应当从20分钟延长到4个小时。

LCM（激光捕获显微切割）:来自LCM的组织样品应当先在在PBS或Tris缓冲液中悬浮，并且Proteinase K消化的时间应当从20分钟延长到4个小时。

附录II
亚硫酸氢盐转化和PCR条件设置
1. PCR引物设计：一般24到32个碱基的引物可以扩增亚硫酸氢盐转化的DNA。

对于大部分的真核细胞，所有非甲基化的C都被转化为U在亚硫酸氢盐处理过程中。

针对于引物的设计，这些C应转化为T。

例如，对于序列5’-AACCTTACAGGCAC-3’, 所对应的引物为5’- AATTTTATAGGTAT-3’。

2. 亚硫酸氢盐转化所需的DNA的量：针对于PCR扩增，所有亚硫酸氢盐处理的最小的人或鼠DNA的量应当是 50 pg，理想的每次亚硫酸氢盐转化所需的DNA的量为200-500ng,虽然高达2 μg的DNA也可以作为初试输入量，但高输入量会导致富含GC区域的不完全亚硫酸氢盐转化。

3. PCR条件的设置：对于成功的PCR扩增35到40个循环是很关键的。

理想的扩增子大小应当在150-300bp之间退火温度最好设置在55-60℃之间。

当大部分非甲基化的温度转化为U时，亚硫酸氢盐处理的DNA一般是富含大量AT的，组成中很少有GC。

所以减少退火温度是非常必要的。

由于AT的特性所以处理亚硫酸氢盐转化的DNA，非特异性PCR扩增就相对比较普遍，推荐使用“热启动”聚合酶。

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EZ DNA Methylation-Direct Kit™
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北京天漠科技开发有限公司（ZYMO RESEARCH 中国总代理）
P r o d u c t D e s c r i p t i o n
C a t . N o . S i z e
D N A 纯化与浓缩系列-5
（D N A C l e a n & C o n c e n t r a t o r - 5™）
2分钟完成，6 μl 洗脱体积，5 μg D N A 。

D 4013 50 p r e p s
凝胶D N A 回收试剂盒
（Z y m o c l e a n G e l D N A R e c o v e r y K i t ™）
在15分钟内从琼脂糖凝胶中纯化到75 b p -23 K b 的D N A （回收率70-95%）。

D 4001 50 p r e p s
基因组D N A 提取试剂盒（离心柱）
（Z R G e n o m i c D N A K i t I I ™）
在15分钟内从全血、组织培养细胞、固体组织和液体样品中提取到基因组 D N A 。

D 3024 D 3025 50 p r e p s 200 p r e p s
植物D N A 提取试剂盒
（Z R P l a n t /S e e d D N A K i t ™）
简单、快速地从植物或种子样品中分离到h u m i c -f r e e , P C R -q u a l i t y 的 D N A 。

整个过程仅15分钟。

D 6020
50 p r e p s
土壤微生物D N A 提取试剂盒
（Z R S o i l M i c r o b e D N A K i t ™）
简单、快速地从土壤微生物中分离到h u m i c -f r e e , P C R -q u a l i t y 的 D N A 。

整个过程仅15分钟。

D 6001 50 p r e p s
真菌/细菌D N A 提取试剂盒
（Z R F u n g a l /B a c t e r i a l D N A K i t ™）简单、快速地从难裂解的真菌和细菌中分离到h u m i c -f r e e , P C R -q u a l i t y 的D N A 整个过程仅10分钟。

D 6005 50 p r e p s
粪便D N A 提取试剂盒 （Z R F e c a l D N A K i t ™）简单、快速地从粪便样品中分离到 P C R -q u a l i t y 的D N A ，整个过程仅15分钟。

D 6010 50 p r e p s
质粒小量提取试剂盒 P e l l e t -F r e e ™ （Z y p p y ™ P l a s m i d M i n i p r e p I K i t ）
在8分钟内，从 40 μl 洗脱液中分离到 25 μg 的 质粒 D N A 。

D 4036 D 4019
50 p r e p s 100 p r e p s
Z y m o p r e p ™ 酵母质粒抽提试剂盒I
（Z y m o p r e p I , Y e a s t P l a s m i d M i n i p r e p ）
有效分离酵母质粒D N A ：很好的从两种杂交筛选物中回收质粒（异丙醇沉淀法）。

D 2001100 p r e p s
Z y m o p r e p ™ 酵母质粒抽提试剂盒I I
（Z y m o p r e p I I , Y e a s t P l a s m i d M i n i p r e p ） 有效分离酵母质粒D N A ：很好的从两种杂交筛选物中回收质粒（离心柱法）。

D 2004 50 p r e p s
病毒D N A 提取试剂盒 （Z R V i r a l D N A K i t ™）从 c e l l -f r e e 体液或浓度小于 100,000 c e l l s /m l 的样品混合物中提取到病毒 D N A 。

D 3015
50 p r e p s
F r o z e n -E Z 酵母转化试剂盒I I ™ （F r o z e n -E Z Y e a s t T r a n s f o r m a t i o n I I ™）120 r e g u l a r o r 600 m i c r o s c a l e t r a n s f o r m a t i o n s
T 2001
E Z D N A 甲基化试剂盒-G O L D (E Z D N A M e t h y l a t i o n -G o l d K i t ™)
3小时内简单, 精确，快速的甲基化检测！
D 5005
50 p r e p s
E Z D N A 甲基化试剂盒-D I R E C T
(E Z D N A M e t h y l a t i o n -D i r e c t K i t ™)
直接来自细胞的D N A 甲基化检测！
D 5020 50 p r e p s
更多产品信息及资料详见公司网站：w w w . z y m o . c o m . c n
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