青刺果总黄酮对四氧嘧啶致糖尿病小鼠肾组织形态学的影响

青刺果总黄酮对四氧嘧啶致糖尿病小鼠肾组织形态学的影响吕程;吴小兰;殷中琼;景波;李正文;戴书俊
【摘要】目的：观察青刺果总黄酮对四氧嘧啶导致的糖尿病小鼠肾组织形态学的
影响，探讨其对肾脏的保护作用。

方法腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型，连续4周给予青刺果总黄酮灌胃治疗。

2周及4周后分别处死小鼠，测血糖，称肾
重和计算肾脏脏器指数。

取部分肾做切片，分别在光镜和电镜下观察肾脏病理变化。

结果糖尿病模型小鼠经青刺果总黄酮治疗后，在光镜和电镜下均可观察到由四氧嘧啶导致的肾脏病变的减轻。

经青刺果总黄酮治疗的糖尿病小鼠其肾小球体积减小，基底膜无明显增厚；肾小管内糖原沉积减少，间质纤维减少；细胞器损伤较模型组轻微。

结论青刺果总黄酮能有效的改善糖尿病小鼠肾脏的病变，控制肾脏肥大，对糖尿病肾病有一定的保护作用。

%Aim To investigate the effect of flavonoids from Prinsepia utilis Royle( FPR) on the histomorphol-ogy of kidney in diabetic mice, and to investigate its protective mechanism. Methods Diabetic mice in-duced by alloxan were given FPR orally each day for four weeks. After the administration for two and four weeks, ten mice in each group were randomly sacri-ficed. The kidneys were removed and weighed. The extracted renal tissue was embedded with paraffin and sectioned, the sections were stained with Hematoxylin and Eosin(HE)、Periodic acid Schiff(PAS) and Go-mori, and then observed under the microscopy. 1mm3 of renal cortex fixed with glutaral in four centi-degree , and then the ultrastructure of each group was observed under the electron microscope respectively after four weeks′ treatment. Results Compared with the model control group, in the treatment group, observation un-der the microscopy
showed that glomerular volume and mesangial cells reduced, FPR could relieve thickening of the glomerular basement membrane ( GBM ) , little inflammatory cells infiltrated in the interstitium,tubular epithelial cells almost became normal, renal tubule had little glucogen, fiber decreased in the interstitium of renal tubule. Observation under the electron micro-scope indicated that foot process in podocytes lined up in order, mitochondria of the renal tubule’ s epithelial cell almost recovered. Conclusion FPR can relieve the changes of renal pathology,improve renal function, and delay the progression of pathologic changes of kid-ney in diabetic mice partly through reducing the blood glucose and the blood lipid.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2014(000)005
【总页数】4页(P672-675)
【关键词】青刺果总黄酮;糖尿病;血糖;肾脏;肾小球;组织形态
【作者】吕程;吴小兰;殷中琼;景波;李正文;戴书俊
【作者单位】四川农业大学动物医学院药学系，四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院药学系，四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院药学系，四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院药学系，四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院药学系，四川雅安 625014;四川农业大学动物医学院药学系，四川雅安625014
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R284.1;R322.61;R5871;R692.39
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）病人最重要的合并症之一，它是糖尿病病人致残、致死的重要原因。

如何及时预防DN发生，延缓慢性肾衰进程，成为医学界攻克的重点方向。

近年来大量研究证明，许多黄酮类化合物在治疗糖尿病及其并发症方面疗效明显，如芦丁、杨梅酮、淫羊藿苷、水飞蓟素、硫磺菊素、儿茶素等植物黄酮提取物［1－6］。

青刺果（Prinsepia utilis Royle）为蔷薇科扁核木属植物总花扁核的果实，我国主要产于四川、西藏、云南、贵州等地区。

前期研究表明青刺总果黄酮（flavonoids from Prinsepia utilis Royle，FPR）含有黄酮类、黄酮醇类和查耳酮类［7］，其对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠具有降血糖和降血脂的作用［8］。

因此本实验用FPR对四氧嘧啶致糖尿病模型小鼠进行干预，以明确FPR对糖尿病小鼠肾脏是否
具有保护作用。

1 材料与方法
1.1 药品、试剂及仪器FPR，总黄酮含量306 mg·g－1，由本室从青刺果中提取，临用前用2 g·L－1的羧甲基纤维素钠配成15 g·L－1的FPR混悬液；四氧嘧啶（ALX，Sigma公司），临用前用生理盐水配成75 g·L－1的注射液。

阿卡波糖（AR，拜耳医药保健有限公司，批号：国药准字H19990205），临用前用2 g·L －1的羧甲基纤维素钠配成1 g·L－1的混悬液。

Lelca切片机（德国）；Nikon生物显微镜及照相机（日本）；LKB-Ⅴ型超薄切片机（瑞典）；H-600型投射电镜（日本）。

1.2 实验动物 ICR小鼠80只，♂♀各半，体质量（23±2）g，分笼饲养，室温
（22±1）℃，相对湿度（60±5）%，自由采食和饮水。

1.2.1 糖尿病模型的建立小鼠禁食12 h，以200 mg·kg－1的剂量腹腔注射ALX
制作DM模型。

d 4测空腹血糖，保留血糖值大于10.00 mmol·L－1的小鼠作为DM模型鼠。

1.2.2 动物分组及给药将DM模型小鼠随机分为：模型对照组（DM组）、青刺
果总黄酮组（FPR组）、正常组（NC组）、阳性药物治疗组（AR组）。

每组20只小鼠，♀♂各半。

FPR组以300 mg·kg－1、AR组以20 mg·kg－1的剂量每天灌胃给药 1次。

DM组和NC组每天灌胃生理盐水1次，连续4周，隔天称重1次。

1.3 样品的采集和处理于给药第2、4周末各处死一半数量（10只）的小鼠，测
血糖并剖腹取肾，测肾重。

剥离4周末肾脏的包膜和结缔组织，将肾脏纵向剖开，部分肾置于400 g·L－1多聚甲醛中固定用于做石蜡切片；再取1 mm3大小肾皮
质置于0.25 mol·L－1的戊二醛中4℃下固定用于做电镜切片。

石蜡切片酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，厚5μm的切片，分别进行HE、PAS和Gomori
染色，光镜下观察肾脏病理变化。

电镜切片用pH 7.2的磷酸缓冲液清洗后，用
0.04 mmol·L－1的四氧化锇后固定，再用pH 7.2的磷酸缓冲液清洗后，依次用
丙酮梯度脱水，然后将脱水组织块放入Epon环氧树脂812与纯丙酮以1∶1的混合液置换（40℃温箱内过夜）后，用浸透液浸透，Epon环氧树脂812包埋，温
箱中硬化，切片，醋酸双氧铀－柠檬酸铅双重染色，电镜下观察肾脏病理变化。

1.4 统计学处理数据以表示，应用SPSS 13.0统计软件处理。

组间比较采用方差
分析。

2 结果
2．1 FPR对糖尿病小鼠血糖、肾重及肾脏指数的影响 FPR对DM小鼠血糖、肾
重及肾脏指数的影响见Tab 1。

经FPR治疗的小鼠血糖和肾脏指数较DM组明显
降低（P＜0.01）。

FPR组小鼠的肾重至治疗的第二周和第四周均相较于DM组明显降低（P＜0.05）。

但FPR组的肾重和肾脏指数与NC组和AR组相比无明显差异。

2.2 青刺果总黄酮对糖尿病小鼠肾组织形态学的影响
2.2.1 HE染色 4个实验组小鼠的肾组织形态在光镜下观察到的HE染色结果见Fig 1。

其中，NC组结构正常（Fig 1-A1）；DM组与NC组比较，肾小球体积明显
增大，肾小球系膜细胞增多（Fig 1-A2），肾小管上皮细胞变性、脱落和坏死，
蛋白管型形成，间质大量炎性细胞浸润，纤维细胞增生（Fig 1-A3）；FPR组与DM组比较，肾小球体积轻微肿大，系膜细胞轻度增生，肾小管上皮细胞呈颗粒变性（Fig 1-A4）；AR组的肾小球体积轻微肿大，系膜细胞轻度增生，间质少量纤维细胞浸润（Fig 1-A5）。

2.2.2 PAS染色 4个实验组小鼠的肾组织形态在光镜下观察PAS染色结果见Fig 2。

其中NC组结构正常（Fig 2-B1）；DM组与NC组比较，肾小球毛细血管基底
膜弥漫性增厚（Fig 2-B2）；肾小管间质和肾小管内大量糖原沉积（Fig 2-B3）；与DM组比较，FPR组小鼠肾小球毛细血管基底膜较薄，糖原沉积减轻（Fig 2-
B4）；AR组基底膜轻度增厚，肾小管内未见糖原沉积（Fig 2-B5）。

Fig 1 Effects of FPR on morphology of renal tissues in diabetic m ice by HE stainingobserved under the microscope（×400）
2.2.3 Gomori染色 4个实验组小鼠的肾组织形态在光镜下观察Gomori染色结果见Fig 3。

其中NC组为正常肾组织（Fig 3-C1）；DM组与NC组比较，肾小管间质纤维化，网状纤维和胶原纤维明显增加（Fig 3-C2、3-C3）；FPR组与DM
组比较，肾小管间质的网状纤维数量较少（Fig 3-C4）。

AR组肾小管间质网状纤维较少（Fig 3-C5）。

2.2.4 电镜观察 4个实验组小鼠的肾组织形态在电镜下观察结果见Fig 4。

其中NC
组肾小球毛细血管基底膜结构正常，细长的足突从球囊脏层上皮细胞表面伸出，贴附于基底膜之外并保持一定的距离（Fig 4-D1，×17 000）。

DM组与 NC组比较，肾小球毛细血管基底膜增厚并不均匀，足细胞次级突起融合消失，线粒体基质深染（Fig 4-D2，×12 000）；肾小管间质处的胶原纤维可见明显增多（Fig 4-
D3，×25 000）；肾小管上皮细胞内大量空泡形成，线粒体嵴减少或消失，核内染色质浓缩、边集（Fig 4-D4，×5 000）。

FPR组相较于DM组，肾小球毛细血管基底膜变薄，足细胞突起排列整齐（Fig 4-D5，×17 000），肾小管上皮细胞内线粒体嵴较明显，排列整齐（Fig 4-D6，×20 000）。

Tab 1 Influence of FPR on GLU，kidney weight and renal index of diabeticm icerenal index＝kidney weight（mg）／body weight（g）；*P＜0．05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0.01 vs model groupGroup Second week GLU／mmol·L－1 Kidney weight／g Renal index ／mg·g－1 Fourth week GLU／mmol·L－1 Kidney weight／g Renal index／mg·g－1 NC Group 5.10±0.28 0.34±0.04 12.04±0.94 5.21±0.41
0.42±0.04 13.15±0.48 DM Group 11.32±0.13** 0.45±0.10** 18.99±0.78** 11.38±0.51* 0.51±0.02* 18.90±0.24**FPR Group 8.68±0.62*＃＃
0.38±0.05＃14.89±0.55*＃＃7.02±0.39＃＃0.42±0.03＃13.78±0.49＃＃AR Group 8.42±0.21*＃＃0.39±0.09＃14.89±0.55*＃＃6.80±0.54＃＃0.43±0.08＃14.37±2.52＃＃
Fig 2 Effects of FPR on morphology of renal tissues in diabetic m ice by PAS staining（×400）
Fig 3 Effects of FPR on morphology of renal tissues in diabeticm ice by Gomori staining（×400）
3 讨论
Fig 4 Effects of FPR on morphology of renal tissues in diabetic m ice
实验结果表明，FPR可明显降低血糖，有效控制DM小鼠的肾脏肥大，并且明显
缓解肾脏的各种病理变化，可有效治疗糖尿病肾脏病变。

早期糖尿病肾脏病变在糖代谢正常后可防止或逆转，血糖控制不良是发生糖尿病肾脏损害的重要原因。

FPR 能明显降低血糖水平，使高糖对肾小球内皮细胞的刺激作用减弱，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）生成减少，参与炎性反应的物质减少［9］，内皮生长因子水平降低［10］，转化生长因子β（TGF-β）［11－12］分泌减少，糖尿病肾脏的血管损伤、肾小球硬化和纤维化降低和缓解。

并且FPR还可通过降低血糖，来对抗高糖
刺激产生的活性氧簇（ROS）［13－14］的明显增加。

在糖尿病状态下，肾皮质
线粒体内氧化应激的增加可能是造成DM小鼠肾脏足细胞足突的消失、融合，足
细胞数量减少的原因之一。

本研究证明了FPR能有效维持DM小鼠肾小球足细胞
结构的完整性，即FPR通过维护肾小球滤过屏障的完整性，减少蛋白尿的排出，
从而保护了DM小鼠的肾脏。

综上所述，FPR能明显减轻DM小鼠肾组织病变，有效改善DM引起的肾脏的损伤，对DM小鼠肾具有保护作用。

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