最新酶工程-重点整理总结

第一章绪论
1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。

答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。

（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。

（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。

2、酶有哪些显著的催化特性？
答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（107~1013倍）；（3）酶催化作用条件温和。

3、简述影响酶催化作用的主要因素。

答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。

酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。

（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。

（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。

一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。

（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。

（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。

（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。

如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。

5、简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。

答：概念：在特定条件下（温度可采用25°C，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位（IU）。

或在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1Kat. 测定方法：化学测定法，光学测定法，气体测定法。

6、*酶的发展历史：①我国在4000多年前的夏禹时代就已经掌握了酿酒技术；②在3000多年前的周朝，就会制造饴糖、食酱等食品，2500多年前的春秋战国时期，就懂得用麥菊来治疗消化不良等疾病；③1833年。

佩恩和帕索兹从麦芽的水抽提物中用乙醇沉淀得到一种可使淀粉水解生成可溶性糖的物质称之为淀粉酶；④19世纪中叶，巴斯德对酵母的乙醇发酵进行大量研究，认为活酵母细胞内有一种可以将糖发酵成乙醇的物质。

1878年昆尼首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称之为酶；⑤1896年，巴克纳兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成乙醇；⑥1902年亨利根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出了中间产物学说；⑦1913年，米彻利斯和曼吞根据中间产物学说，推导出酶催化反应的基本动力学方程——米氏方程；⑧1926年，萨姆纳首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它有蛋白质的性质；⑨1960年，雅各和莫诺德提出操纵子学说；⑩1982年切克发现SsRNNA前体具有自我剪接功能，认为RNA也具有催化活性，将这种有催化活性的RNA成为核酸类酶；1983年，阿尔特曼等发现核酸酶。

7、*2种命名法：国际酶学委员会与1961年在“酶学委员会的报告”中提出了酶的分类与命名方案，获得了“国际生物化学与分子生物学联合会”的批准。

此后经过多次修订，不断得到补充和完善。

根据国际酶学委员会的建议，每一种具体的酶都有其推荐名和系统命名：①推荐名是在惯用名称基础上，加以选择和修改，一般由两部分组成：底物名称+催化反应的类型+酶，不管酶催化的反应是正反应还是逆反应，都用一个名称，对于水解酶类，可省去“水解”；②系统命名法更详细、更准确的反映出该酶所催化的反应，系统命名包括了酶的作用底物、酶作用的基团及催化反应的类型。

8、*（1）蛋白类酶分为六大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶或连接酶。

（2）核酸类酶：①分子内催化R酶：自我剪切酶、自我剪接酶；②分子间催化R酶：RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪接酶、氨基酸酯剪切酶、多功能酶。

9、*固定化酶的活力测定方法：振荡测定法、酶柱测定法、连续测定法、固定化酶的比活力测定、酶结合效
率与酶活力回收率的测定。

10、*酶的生产方法：提取分离法、生物合成法、化学合成法。

第二章微生物发酵产酶
1、试述酶生物合成的基本过程。

答：（1）RNA的生物合成—转录：转录的起始、RNA链的延伸、RNA链合成的终止、RNA前体的加工；（2）蛋白质的生物合成—翻译：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止、蛋白质前体的加工。

2、何谓酶生物合成的诱导作用？简述其原理。

答：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用。

能够引起诱导作用的物质称为诱导物，诱导物一般是酶催化作用的底物或底物类似物。

原理：一般来说，不同的酶有各自不同的诱导物，但有些诱导物可以诱导同一酶系的若干种酶，如β半乳糖苷可以同时诱导β半乳糖苷酶、透过酶和β半乳糖乙酰化酶3种酶，而一种酶往往有多种诱导物，可以根据需要进行选择。

当培养基中以乳糖为惟一碳源时，细胞吸收乳糖为别乳糖。

别乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的结构发生改变，从而使它与操纵基因的结合力减弱，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，就使RNA聚合酶可以与启动基因结合，进行转录而合成结构基因所对应的酶。

3、什么是酶生物合成的反馈阻遏作用？简述其原理。

答：又称产物阻遏作用，指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。

引起反馈阻遏作用的物质称为阻遏物，阻遏物一般是酶催化反应的产物或是代谢途径的末端产物。

原理：当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物达到一定程度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其结构发生改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因的结合力增强。

阻遏蛋白与操纵基因结合，就排挤RNA聚合物与启动基因的结合，使转录无法进行，酶的生物合成因此受到阻遏。

4、简述分解代谢物阻遏作用的原理和解除方法。

答：指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。

原理：某些物质经过分解放出能量，有一部分能量储存在ATP中。

ATP是由AMP和ADP通过磷酸化作用产生的。

细胞内的ATP浓度增加，ADP浓度降低，存在于细胞内的cAMP就通过磷酸二酯酶的作用水解生成AMP。

同时腺苷酸环化酶的活化受到抑制而使cAMP 的生成受阻，从而导致细胞内cAMP的浓度降低。

这就必然使
cAMP-CAP的复合物浓度降低，结果启动基因的相应位点上没有足够的cAMP-CAP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到其在启动基因的相应位点上，转录无法进行，酶的生物合成收到阻遏。

解除方法：分解代谢物阻遏作用以及该阻遏作用的解除，实质上是cAMP通过启动基因对酶生物合成进行调节控制。

在培养环境中控制好某些降解物质的量，或在必要时添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。

5、酶的生物合成有哪几种模式？
答：（1）同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步进行。

（2）延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后酶还可以延续合成一段较长时间。

（3）中期合成型：酶在细胞生长一段时间以后才开始，而细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停止。

（4）滞后合成型：在细胞生长一段时间或进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累，又称为非生长偶联型。

6、如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？
答：（1）细胞活化与扩大培养；（2）培养基的配制；（3）pH的调节控制；（4）温度的调节控制；（5）溶解氧的调节控制：调节通气量、调节氧分压、调节气液接触时间、调节气液接触面积、改变培养液性质。

7、提高酶产量的措施有哪些？
答：（1）添加诱导物（2）控制阻遏物的浓度（3）添加表面活性剂（4）添加产酶促进剂。

10、简述固定化微生物细胞发酵产酶的特点。

答：①提高产酶率；②可以反复使用或连续使用较长的时间；③基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；④发酵稳定性好；⑤缩短发酵周期，提高设备利用率；⑥产品容易分离纯化；⑦适用于胞外酶等胞外产物的生产。

（固定化细胞发酵产酶的工艺条件及其控制：①固定化细胞的与培养；②溶解氧的供给；③温度的控制；④培养基组分的控制。

）
11、固定化微生物原生质体发酵产酶的特点。

答：①变胞内产物为胞外产物；②提高产酶率；③由于有载体的保护作用，稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间；④易于分离纯化（固定化原生质体发酵产酶的工艺条件极其控制：①渗透压的控制；②防止细胞壁再生；③保证原生质体的浓度。

）。

12、*优良的产酶微生物应当具备的条件：①酶的产量高；②产酶稳定性好；③容易培养和管理；④利于酶的分离纯化；⑤安全可靠、无毒性。

13、*酶的发酵根据微生物培养方式不同：固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物细胞发酵、固定化微生物原生质体发酵。

14、*酶生物合成的调节：分解代谢物阻遏作用、酶生物合成的诱导作用、酶生物合成的反馈阻遏作用。

15、*组成型酶：在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大。

适应型酶/调节型酶：在细胞中含量变化大，其合成速率明显受到环境因素的影响。

16、*在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有4种：①结构基因：与多肽链有各自的对应关系。

②操纵基因：可以与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。

③启动基因：决定酶的合成能否开始，有两个位点，RNA聚合酶结合位点和cAMP-CAP结合位点。

④调节基因：可以产生一种阻遏蛋白。

结构基因、操纵基因、启动基因一起组成操纵子。

17、*常用的产酶微生物：①细菌：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌：（最广泛）α淀粉酶、蛋白酶、β葡聚糖酶、5’-核苷酸酶和碱性磷酸酶。

②放线菌：链霉菌：葡萄糖异构酶。

③霉菌：红曲霉可用于生产α淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶；黑曲霉；米曲霉；青酶；木霉；根酶；毛酶。

⑤酵母：啤酒酵母；假丝酵母。

18、*常用的保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法。

19、*培养基：碳源、氮源、无机盐、生长因子。

20、*最适pH：细菌、放线菌6.5~8.0；酵母、霉菌4~6 偏酸；植物细胞5~6.
21、*诱导物一般分为三类：酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物。

22、*发酵动力学包括：细胞生长动力学、产酶动力学/产物生成动力学、机制消耗动力学。

产酶动力学主要研究发酵过程中细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响规律。

产酶动力学模型/产酶动力学方程：
R E=dE/dt=(αμ+β)·X 其中X为细胞浓度，μ为细胞比生长速率，α为生长偶联的比产酶系数，β为非偶联的产酶速率，E为酶浓度。

第三章动植物细胞培养产酶
2、何谓抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。

答：抗体酶又称催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。

制备抗体酶的主要方法有①修饰法：对抗体进行分子修饰，在抗体与抗原的结合部位引进催化基团而成为抗体酶；②诱导法：是利用特定的抗原诱导抗体酶合成的方法（主要），有半抗原诱导法和酶蛋白诱导法。

3、植物细胞培养产酶有何特点？
答：①提高产率；②缩短周期；③易于管理、减轻劳动强度；④提高产品质量；⑤其他：对剪切力敏感、生长周期长（缺点）。

5、试述植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制。

答：（1）植物细胞培养的工艺流程：①外植体的选择与处理；②植物细胞的获取：直接分离法、愈伤组织诱导法、原生质体再生法；③细胞悬浮培养；④分离纯化。

（2）植物细胞培养的培养基：①特点：需要大量无机盐、多种维生素和植物生长激素、无机氮源、蔗糖为碳源；②常用：MS培养基（无机盐浓度较高，为较稳定的离子平衡溶液，营养成分的种类和比例较适宜，可以满足植物细胞的营养要求，其中硝酸盐的浓度比
其他培养基高，故广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养）、B5培养基、White培养基、KM-8P培养基。

（3）温度的控制，通常不低于20度不高于35度。

（4）pH的控制：培养基一般是5.5~5.8之间。

（5）溶解氧的调节控制。

（6）光照的控制。

（7）前体的添加。

（8）刺激剂的应用。

6、动物细胞培养过程中要注意哪些工艺条件。

答：（1）动物细胞培养基的组成成分：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等。

（2）动物细胞培养基的配制。

（3）温度的控制。

（4）pH的控制。

（5）渗透压的控制。

（6）溶解氧的控制。

7、举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。

答：以人黑色素瘤细胞培养产生组织纤溶酶原活化剂（tPA）为例：（1）配制人黑色素瘤细胞培养基；（2）人黑色素瘤细胞培养：①将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理，细胞分散后，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤，技术，稀释成细胞悬液；②在消毒好的反应器中装入一定量的培养液，将上述细胞悬浮液接种至反应器中，浓度为（1~3）*103个细胞/mL，于37度的CO2培养箱中，通入5%CO2的无菌空气，培养至长成单层致密细胞；③倾去细胞液，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤细胞2~3次；④换入一定量的无血清Eagle培养液，继续培养；⑤每隔3~4天，取出培养液进行tPA的分离纯化；⑥再向反应器中加入新鲜的无血清Eagle 培养液，继续培养，以获得大量tPA。

（3）组织纤溶酶原活化剂的分离纯化。

8、*动物细胞可以采用离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术等获得。

动物细胞培养方式有悬浮培养、贴壁培养和微载体培养。

动物细胞培养的主要目的是获得疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质。

9、*植物细胞可以通过机械捣碎或酶解的方法直接从外植体中分离得到。

植物细胞培养方式有固体培养、液体悬浮培养等，在次级代谢物的生产中常用液体悬浮培养。

植物细胞培养主要用于生产色素、药物、香精、酶等次级代谢产物。

10、*动植物细胞中酶生物合成的调节：①细胞分化改变酶的生物合成；②基因扩增加速酶的生物合成；③增强子促进酶的生物合成；④抗原诱导抗体酶的生物合成。

11、*端粒是真核生物染色体的末端结构，作用是保护真核生物的染色体免遭破坏，是通过端粒酶的催化作用而成的。

端粒酶是催化端粒合成和延长的酶。

12、*动物细胞培养的特点：①主要用于各种功能蛋白质和多肽的生产；②动物细胞生长较慢，③为防止微生物污染，在培养过程中要添加抗生素（青霉素、链霉素）；④动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感，在培养过程中，必须严格控制温度、pH、渗透压、通风搅拌等条件以免破坏细胞；⑤大多数动物细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养，部分细胞可采用悬浮培养。

⑥培养基成分复杂，一般要添加血清或其代用品，产品的分离纯化过程较繁杂，成本较高、适用于高价值药物生产；⑦原代细胞继代培养50代后，即会退化死亡，要重新分离细胞。

第四章酶的提取与分离纯化
1、细胞破碎的方法主要有哪些？各有何特点？
答：细胞破碎是通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。

分类细胞破碎方法细胞破碎原理
机械破碎法捣碎法
通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎研磨法
匀浆法
物理破碎法温度差破碎法
通过各种物体因素的作用，使组织、细胞的外层结构破
坏，而使细胞破碎
压力差破碎法
超声波破碎法
化学破碎法
添加有机溶剂
通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎添加表面活性剂
酶促破碎法
自溶法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，是细胞
外层结构受到破坏，从而达到细胞破碎
外加酶制剂法
特点：①机械破碎法：处理量大，破碎效率高，速度快。

②物理破碎法：处理条件比较温和，有利于目标产物的高活力释放回收，但破碎效率低，产物释放速度快，处理时间长，不适合大规模细胞破碎的需要。

多局限于实验室规模的小批量使用。

③化学破碎法：优点：比机械破碎法的选择性高，胞内产物总释放率低，料液黏度小，有利于后处理。

缺点：通透性差，时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过5%，有些化学试剂有毒。

④酶促破碎法：优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。

2、试述酶提取的主要方法。

答：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液的过程，也称为酶的抽提。

主要影响因素有：温度、pH、提取液的体积。

提取方法使用的溶剂或溶液提取对象
盐溶液提取0.02~0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶
酸溶液提取pH2~6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶
碱溶液提取pH8~12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶
3、简述酶沉淀分离方法的原理与特点。

答：沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离的技术过程。

（最多的是硫酸铵）
沉淀分离方法分离原理
盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度的条件下溶解度不同的特征，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离。

等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。

有机溶剂沉淀法利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。

复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离。

选择变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀而不影响所需的酶，从而使酶
与杂质分离。

特点：①盐析沉淀法：不同浓度的蛋白质浓度产生沉淀所要求的临界浓度不同；蛋白质浓度大时，中性盐极限沉淀低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少，蛋白质溶解损失小；蛋白质浓度低时相反，中性盐极限沉淀高，共沉作用弱，分辨率高，但用盐量增大，蛋白质回收率低。

②等电点沉淀法：在溶液的pH等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来；由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全；在实际使用时，等电点沉淀法往往与其他方法一起使用；有时单独使用等电点沉淀法主要是用于粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。

③有机溶剂沉淀法：一般比盐析法析出的沉淀易于离心或过滤分离，不含无机盐，分辨率也比较高；但是有机溶剂沉淀法容易引起酶的变性失活，所以必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。

4、何谓膜分离技术？在酶的生产中有何应用？
答：借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术成为膜分离技术。

薄膜的作用是选择性的让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。

根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同，膜分离可以分为三类：加压膜分离（微滤、超滤、反渗透）、电场膜分离（电渗析、离子交换膜电渗析）、扩散膜分离（透析）。

应用：（用于酶液或其他溶剂的脱盐，用于酶的分离纯化，酶的浓缩）①超滤：酶的分离纯化、酶液浓缩、液体酶制剂的生产；②反渗透：无离子
水的制备、海水淡化；③电渗析：酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备、其他带电荷小分子的分离；
④离子交换膜电渗析：酶液脱盐、海水淡化、从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸等带有电荷的小分子发酵产物；
⑤透析：酶等生物大分子的分离纯化、从中去除无机盐等小分子物质。

5、简述双水相萃取和超临界萃取的概念与特点。

答：（1）双水相萃取：双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。

利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同达到分离。

双水相萃取中使用的双水相一般由按一定百分比组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成（如硫酸铵和聚乙二醇）。

在双水相系统中，蛋白质、RNA等。

特点：含水量高，适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。

不存在有机溶剂残留问题。

易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。

但分离后的酶浓度较低，需要经过浓缩等提高浓度。

（2）超临界萃取：又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。

在温度和压力超过某物质的超临界点时，该物质成为超临界流体，最常用CO2。

特点：具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；临界温度在室温附近或操作温度附近；萃取剂选择性好，易制得高纯度的制品；溶解度高，减少溶剂的循环量。

可分为：等压分离、等温分离、吸附分离6、试述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点。

答：（1）凝胶层析：凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种运动。

①随着溶液流动而进行的垂直向下的移动②无定向的分子扩散运动（布朗运动）。

大分子物质由于直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。

较小的分子能进入凝胶微孔内，使小分子物质向下移动的速度比大分子的慢，从而使混合液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，达到分离的目的。

操作过程一般包括装柱、上柱、洗脱等过程。

（2）亲和层析：原理：亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的的可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的层析技术。

当酶液流经亲和层析试剂时，酶分子与其配基分子结合留在柱内，而其他杂质不与配基结合，可洗涤流出，然后用适当的洗脱液进行洗脱，达到酶的分离纯化。

方法：分子对亲和层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、疏水层析、金属离子亲和层析、染料亲和层析、凝集素亲和层析。

（3）离子交换层析：原理：离子交换层析是用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析方法。

离子交换剂是含有若干活性基因的不溶性高分子物质，通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。

带电量小，亲和力小的先被洗脱下来，带电量多，亲和力大的后被洗脱下来。

操作过程一般包括：装柱、上柱、洗脱和收集、再生。

7、简述凝胶电泳的分类及其原理。

答：凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术，凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，具有很高的分辨率。

主要有（琼脂糖凝胶电泳和）聚丙烯酰胺凝胶电泳，分为（1）连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的pH和相同的缓冲液。

此法配制凝胶时较为简便，但是分离效果稍差，用于组分较少的样品的分离。

（2）不连续凝胶电泳：采用2或3层性质不同的凝胶重叠起来使用，采用2种不同的pH和不同的缓冲液，能使浓度较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。

（样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8、分离胶ph8.8~8.9）（3）梯度凝胶电泳：采用由上而下浓度逐渐升高、孔径逐渐减小的梯度凝胶进行电泳。

梯度凝胶用梯度混合装置制成，主要用于测定球蛋白类组分的分子质量。

（4）SDS—凝胶电泳：（负电荷）主要用于蛋白质相对分子质量的测定。

8、酶结晶的主要方法有：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法。

9、*酶的提取分离纯化技术
细胞破碎细胞破碎法捣碎法、研磨法、匀浆法
物理破碎法温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法化学破碎法
添加有机溶剂、添加表面活性剂
酶促破碎法
自溶法、外加酶制剂法。