DNA聚合酶简介
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DNA Polymerase activities
Polymerization： 从模板链的3‘末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNA pol 逐个将 寡核苷酸加上去，就是DNA pol 的聚合作用。dNTP进入结合位点后，聚合酶 促进3‘-OH与5’-PO4结合生成磷酸二酯键，这一过程使酶的构象发生变化。
2. dNTP 每种dNTP摩尔浓度一般在200～250umol/L。总dNTP浓度高至4～6mmol/L 时, 酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
3. 有机溶剂 对聚合酶活力影响视不同浓度有所不同 4. 金属离子螯合剂 可以抑制DNA Polymerase的活性。
Solution /en/buffer_for_restriction_enzymes
Thanks!
DNA聚合酶的改造方法：
1. 酶活性中心稳定化：通过定向结构修饰来提高酶活性中心区域的刚性 保持酶活性中心原有骨架基础上，提高其内部二级结构稳定性 2.延伸因子和特异Priming： 人工合成酶-延伸因子复活物，在复活物的前端加上特异的priming区域 提升延伸性和反应速度，提高特异性的priming
Miguel Garcia-Diaz, CRC Crit Rev Plant Sci. 2007 March ; 26(2): 105–122.
specific action
translesion synthesis
跨损伤修复：跨损伤修复( translesion synthesis, TLS)是一类复制后修复; 最先发现于原 核细胞中。当DNA链在复制过程中遇到损伤而使复制停顿时; 机体启动跨损伤修复系统 以忽略存在的损伤; 继续进行DNA复制。
sso7denzymeactivitydeterminationenzymeunits1生物发光技术dna聚合酶催化dna分子的聚合过程中伴随着焦磷酸ppi的生成利用atp硫酰化酶将焦磷酸定量转化成atp再利用虫荧光素酶系统发光检测atp的量从而确定ppi的量以pcr反应体系中ppi的量来反映聚合酶的活性商业化试剂盒2荧光标记法每一个dntp被聚合sybrgreeni嵌入双链产生荧光
3.热启动抗体： 通过制备酶抗体，形成抗原抗体复合物，使得酶在较高的温度得以释放发挥聚合 活性，实现热启动PCR. 是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一.
4.蛋白Sso7d的DNA结合域融合到DNA聚合酶中 Sso7d蛋白为嗜热硫化裂片菌中的一种耐热的DNA结合蛋白，其对双链DNA 有较强的亲和力，可识别PCR退火后的双链DNA，协助DNA聚合酶快速识别 延伸位点，增强了延伸速率，并使DNA聚合酶在DNA双链上移动速度加快， 且能提高聚合酶对PCR抑制剂的抵抗能力。
Sso7d
Enzyme Activity detห้องสมุดไป่ตู้rmination
1、生物发光技术 DNA聚合酶催化DNA分子的聚合过程中伴随着焦磷酸（PPi）的生成，利用ATP 硫酰化酶将焦磷酸定量转化成ATP，再利用虫荧光素酶系统发光检测ATP的量， 从而确定PPi的量，以PCR反应体系中PPi的量来反映聚合酶的活性 商业化试剂盒 2、荧光标记法 每一个dNTP被聚合，SYBR GREEN I嵌入双链，产生荧光。根据荧光值的增强曲 线计算酶活性
DNA Polymerase families（human）
families α: 定位于胞核，参与复制引发，不具5‘－3’外切酶活性 families β: 定位于核内，参与修复，不具5'－3'外切酶活性 families γ：定位于线粒体，参与线粒体复制，不具5‘－3’外切酶 活性，有3‘－5’外切酶活性 families δ：定位核，参与复制，具有3‘－5’外切酶活性，不具5‘－ 3’外切酶活性 families ε：定位于核，参与损伤修复（translesion synthesis，TLS)， 具有3‘－5’外切酶活性，不具5‘－3’外切酶活性 商品化的DNA polymerase：主要是从嗜热古细菌中分离 Taq酶：有5‘－3’外切酶活性，错配率取决于dNTP浓度，可在3’末 端加A Pfu:具有3‘－5’外切酶活性,高保真。人工体外构建体系成熟，可 直接进行改造。
DNA polymerase moves along the old strand in the 3'-5' direction, creating a new strand having a 5'-3' direction.
Structure of human DNA polymerase
Structure of human DNA polymerase complexed TTP with manganese in the active site
Enzyme Units
特定温度30分钟时间内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所 需的酶量定义为1个活性单位。 其他指标：耐热性，延伸速率，扩增片段长度，抑制剂抵抗力
聚合酶的活力的影响因素 1. Mg2+离子的影响。 Mg2+是DNA聚合酶的必需激活剂 dNTP和寡核苷酸都能结合镁离子，是聚合酶活性必需的辅助因子。 用鲱精DNA为模板，总dNTP浓度0.7～0.8mmol/L,Mg2+为2.0mmol/L时激活能力 最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力达40%～50%。 dNTP能与Mg2+结合，故游离Mg2+只是结合后剩余的量。 所以PCR扩增实验，需要根据实际情况，摸索适宜的Mg2+浓度.其浓度可影响 酶的活性和保真度，还影响退火温度，引物二聚体的形成及非特异性产物的 扩增
DNA Polymerase activities
3′-5′ exonuclease activity: proofreading activity: 校正作用：新进入的脱氧核苷酸必须 与模板DNA配对时才有催化作用。若 是错误的核苷酸进入结合位点，则不 能与模板配对，无法改变酶的构象而 被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除 之。其功能是保证DNA复制的精确性。
Priming效率：
DNA Polymerase在引物3’-末端形成酶/DNA复活体并开始DNA片段的延伸的过程称为 Priming。提高其效率可使扩增特异性大幅提升。
缺口平移（Nick translation）：
DNA聚合酶活性和5‘→3’外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即 没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。 当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNA poI 能从切口开始合成新的DNA 链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的 新链。
DNA Polymerase activities
5′-3′ exonuclease activity: 切除修复作用：从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱 氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上双链磷酸二酯键有切割活力作用，方向是 5'→3'。DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。这种酶活性在 DNA损伤的修复中可能起着重要作用。Taq酶的5''-3''外切核酸酶活性只能在 链延伸过程中降解遇到的双链DNA，例如，Taqman探针结合到DNA链上会被 Taq酶切除。
NEB Taq: Supplied in: 100 mM KP04 or KCl (pH 6.5), 1 mM DTT, 50% glycerol. Reaction Conditions: 50 mM NaCl or KCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT pH 7.9 at 25°C 无机离子：ICP-MS，荧光/紫外分光光度仪 酶（蛋白质）：圆二色谱仪，高效液相色谱 PCR反应促进剂： DMSO,甘油，formamide，TMAC，PEG 可降低碱基错配率或提高扩增效率
Polymerization： 从模板链的3‘末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNA pol 逐个将 寡核苷酸加上去，就是DNA pol 的聚合作用。dNTP进入结合位点后，聚合酶 促进3‘-OH与5’-PO4结合生成磷酸二酯键，这一过程使酶的构象发生变化。
2. dNTP 每种dNTP摩尔浓度一般在200～250umol/L。总dNTP浓度高至4～6mmol/L 时, 酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
3. 有机溶剂 对聚合酶活力影响视不同浓度有所不同 4. 金属离子螯合剂 可以抑制DNA Polymerase的活性。
Solution /en/buffer_for_restriction_enzymes
Thanks!
DNA聚合酶的改造方法：
1. 酶活性中心稳定化：通过定向结构修饰来提高酶活性中心区域的刚性 保持酶活性中心原有骨架基础上，提高其内部二级结构稳定性 2.延伸因子和特异Priming： 人工合成酶-延伸因子复活物，在复活物的前端加上特异的priming区域 提升延伸性和反应速度，提高特异性的priming
Miguel Garcia-Diaz, CRC Crit Rev Plant Sci. 2007 March ; 26(2): 105–122.
specific action
translesion synthesis
跨损伤修复：跨损伤修复( translesion synthesis, TLS)是一类复制后修复; 最先发现于原 核细胞中。当DNA链在复制过程中遇到损伤而使复制停顿时; 机体启动跨损伤修复系统 以忽略存在的损伤; 继续进行DNA复制。
sso7denzymeactivitydeterminationenzymeunits1生物发光技术dna聚合酶催化dna分子的聚合过程中伴随着焦磷酸ppi的生成利用atp硫酰化酶将焦磷酸定量转化成atp再利用虫荧光素酶系统发光检测atp的量从而确定ppi的量以pcr反应体系中ppi的量来反映聚合酶的活性商业化试剂盒2荧光标记法每一个dntp被聚合sybrgreeni嵌入双链产生荧光
3.热启动抗体： 通过制备酶抗体，形成抗原抗体复合物，使得酶在较高的温度得以释放发挥聚合 活性，实现热启动PCR. 是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一.
4.蛋白Sso7d的DNA结合域融合到DNA聚合酶中 Sso7d蛋白为嗜热硫化裂片菌中的一种耐热的DNA结合蛋白，其对双链DNA 有较强的亲和力，可识别PCR退火后的双链DNA，协助DNA聚合酶快速识别 延伸位点，增强了延伸速率，并使DNA聚合酶在DNA双链上移动速度加快， 且能提高聚合酶对PCR抑制剂的抵抗能力。
Sso7d
Enzyme Activity detห้องสมุดไป่ตู้rmination
1、生物发光技术 DNA聚合酶催化DNA分子的聚合过程中伴随着焦磷酸（PPi）的生成，利用ATP 硫酰化酶将焦磷酸定量转化成ATP，再利用虫荧光素酶系统发光检测ATP的量， 从而确定PPi的量，以PCR反应体系中PPi的量来反映聚合酶的活性 商业化试剂盒 2、荧光标记法 每一个dNTP被聚合，SYBR GREEN I嵌入双链，产生荧光。根据荧光值的增强曲 线计算酶活性
DNA Polymerase families（human）
families α: 定位于胞核，参与复制引发，不具5‘－3’外切酶活性 families β: 定位于核内，参与修复，不具5'－3'外切酶活性 families γ：定位于线粒体，参与线粒体复制，不具5‘－3’外切酶 活性，有3‘－5’外切酶活性 families δ：定位核，参与复制，具有3‘－5’外切酶活性，不具5‘－ 3’外切酶活性 families ε：定位于核，参与损伤修复（translesion synthesis，TLS)， 具有3‘－5’外切酶活性，不具5‘－3’外切酶活性 商品化的DNA polymerase：主要是从嗜热古细菌中分离 Taq酶：有5‘－3’外切酶活性，错配率取决于dNTP浓度，可在3’末 端加A Pfu:具有3‘－5’外切酶活性,高保真。人工体外构建体系成熟，可 直接进行改造。
DNA polymerase moves along the old strand in the 3'-5' direction, creating a new strand having a 5'-3' direction.
Structure of human DNA polymerase
Structure of human DNA polymerase complexed TTP with manganese in the active site
Enzyme Units
特定温度30分钟时间内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所 需的酶量定义为1个活性单位。 其他指标：耐热性，延伸速率，扩增片段长度，抑制剂抵抗力
聚合酶的活力的影响因素 1. Mg2+离子的影响。 Mg2+是DNA聚合酶的必需激活剂 dNTP和寡核苷酸都能结合镁离子，是聚合酶活性必需的辅助因子。 用鲱精DNA为模板，总dNTP浓度0.7～0.8mmol/L,Mg2+为2.0mmol/L时激活能力 最高。浓度超过此值产生抑制。10mmol/l MgCl2抑制活力达40%～50%。 dNTP能与Mg2+结合，故游离Mg2+只是结合后剩余的量。 所以PCR扩增实验，需要根据实际情况，摸索适宜的Mg2+浓度.其浓度可影响 酶的活性和保真度，还影响退火温度，引物二聚体的形成及非特异性产物的 扩增
DNA Polymerase activities
3′-5′ exonuclease activity: proofreading activity: 校正作用：新进入的脱氧核苷酸必须 与模板DNA配对时才有催化作用。若 是错误的核苷酸进入结合位点，则不 能与模板配对，无法改变酶的构象而 被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除 之。其功能是保证DNA复制的精确性。
Priming效率：
DNA Polymerase在引物3’-末端形成酶/DNA复活体并开始DNA片段的延伸的过程称为 Priming。提高其效率可使扩增特异性大幅提升。
缺口平移（Nick translation）：
DNA聚合酶活性和5‘→3’外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即 没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。 当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNA poI 能从切口开始合成新的DNA 链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的 新链。
DNA Polymerase activities
5′-3′ exonuclease activity: 切除修复作用：从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱 氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上双链磷酸二酯键有切割活力作用，方向是 5'→3'。DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。这种酶活性在 DNA损伤的修复中可能起着重要作用。Taq酶的5''-3''外切核酸酶活性只能在 链延伸过程中降解遇到的双链DNA，例如，Taqman探针结合到DNA链上会被 Taq酶切除。
NEB Taq: Supplied in: 100 mM KP04 or KCl (pH 6.5), 1 mM DTT, 50% glycerol. Reaction Conditions: 50 mM NaCl or KCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT pH 7.9 at 25°C 无机离子：ICP-MS，荧光/紫外分光光度仪 酶（蛋白质）：圆二色谱仪，高效液相色谱 PCR反应促进剂： DMSO,甘油，formamide，TMAC，PEG 可降低碱基错配率或提高扩增效率