秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究

秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究
周光现;常馨月;阚靖博;张恩平
【摘要】试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白.提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上BamH I和Xho I酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经BamH I和Xho I双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达.结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致；成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta(DE3)菌中成功的进行融合蛋白表达.%This experiment was conducted to obtain the recombinant myostatin by technique of gene engineering.The primers were designed and produced according to Herefords myostatin gene sequence.BamH I and Xho I enzyme cut sites and protective bases were added at the end of the primer respectively.The full fragment gene was cloned by RT-PCR from Qinchuan cattle muscle,and PCR product was cloned into the pMD18-T vector.The recombinant plas-mid pMD18-T was identified with BamH I and Xho I restriction enzyme, and the fragment were collected by agarose gel fraction method.After purification the fragment was ligated to the pGEX4T-l express vector, the recombinant pGEX4T-l express vector was constructed.After transformation, the engineered strain E.coli Rosette (DE3)/GST-M was
expressed by the induction of IPTG.Sequencing analysis showed that the nucleotide sequence was the same as the published myostatin cDNA sequence 1 128 bp.The express vector pGEX4T-l-M was successfully constructed.The specific approximate 69 ku band was obtained by analysis of SDS-PAGE and GST-tag Western-blotting.The result indicated that myostatin protein had been expressed successfully in Rosetta(DE3) expressing system.
【期刊名称】《家畜生态学报》
【年(卷),期】2012(033)003
【总页数】6页(P13-18)
【关键词】秦川牛;肌肉生长抑制素;克隆;原核表达;蛋白印迹
【作者】周光现;常馨月;阚靖博;张恩平
【作者单位】西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大
学动物科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌712100
【正文语种】中文
【中图分类】S811.6
肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)又称GDF-8，属TGF-β( transforming growth factor beta转化生长因子-β) 超家族，是一类在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白,其功能和表达量的变化可能会通过调节靶基因的表达，改变肌肉的纤维组成(红、
白肌的比例)及造成肌肉重量的变化[1]。

其活性的丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，表现为双肌性状[2]。

McPherron等[3]发现的一种骨骼肌生长发育的
负调控因子，对小鼠进行了该基因的敲除，发现小鼠的骨骼肌重量大幅度增加，同年，又发现著名双肌牛比利时蓝牛和皮埃蒙特牛就是因为该基因突变所致[4,5]。

Ji 等[6] 研究发现猪出生体重低与猪出生前肌肉生长用 RT-PCR从秦川牛胸肌中扩增了肌肉生长抑制素基因，并在大肠杆菌中特异性融合表达，从而为下一步的肌肉生长抑制素蛋白抗体制备，通过免疫调控基因表达量以及蛋白生物学功能的研究提供技术方法[7]。

1 材料与方法
1.1 质粒、菌株及组织样品
克隆载体pMD18-T Simple、原核表达载体PGEX-4T-1均购自TaKaRa公司；
鼠Anti-GST抗体、羊抗鼠IgG-HRP均购自洛阳华美生物工程公司；大肠杆菌TOP10、Rosetta(DE3)以及秦川牛肌肉组织样品由国家肉牛改良中心实验室提供。

1.2 酶和试剂
所用限制酶(BamHⅠ、XhoⅠ)、KOD聚合酶、2×Taq PCR Mix、T4DNA Ligase、总RNA提取试剂盒均购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提
取试剂盒、核酸分子量标准、蛋白分子标准均购天恩泽(TIANDZ)公司；异丙基硫
代半乳糖苷( IPTG)、氨苄青霉素均为Sigma公司产品;HRP-DAB显示试剂盒购自TIANGEN公司；其他常用化学试剂均为国产分析纯。

1.3 总 RN A 提取
取秦川牛骨骼肌样品100 mg 加入液氮并研磨成粉，1.5 mL Eppendorf 管(RNase-free)管中，用TRIZOL法提取总的RNA[8]。

1.4 RT反应
按照TaKaRa公司RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0试剂盒进行RT反应。

用从骨骼肌
中提取的总RNA作为模板进行RT反应。

反应体系：RNA酶抑制剂0.5 μL、MgCl2 2 μL、Oligod(T)18引物1 μL、dNTP Mixture 1 μL、总RNA3 μL、
10XRT缓冲液2 μL、反转录酶0.5 μL，总体积为10 μL。

反应程序：30 ℃ 10 min、42 ℃ 2 h、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。

反应结束后立即进行PCR或者-20 ℃保存备用。

1.5 目的片段的扩增与克隆
1.5.1 引物的设计与合成根据海福特牛肌肉生长抑制素基因序列
(GenBank :NM_001001525.2)利用primer 5软件进行设计，引物由金斯瑞公司
合成。

上游引物F1的核苷酸序列为: 5'-CGCGGATCCGCCACCATGCAAAAACTGCAAATCT-CTGT-3'含BamHⅠ酶切位点；下游引物R2的核苷酸序列为: 5'-CCGCTCGAGCCTCATGAACACCCACAGCGAT-3'含XhoⅠ酶切位点。

1.5.2 PCR 反应体系与程序反应体系：cDNA模板1.2 μL、MgCl2(25 mM)1.2
μL、dNTPs(2 mM)2 μL、10×Buffer 2 μL、上游引物和下游引物各0.6 μL、KOD酶0.4 μL、ddH2O 12 μL。

反应总体积20 μL。

反应程序：95 ℃变性5 min，然后95 ℃ 30 s、65 ℃ 32 s、72 ℃ 70 s，共30个循环，最后72℃再延
伸10 min。

反应结束后，立即进行电泳。

1.5.3 目的基因加A程序和加A后目的片段纯化PCR产物取10 μL，再加入20
μL Taq 2×PCR m ix，在72 ℃水浴锅中保温30 min。

用PCR高通量纯化试剂盒
纯化加A后的PCR产物备用。

1.5.4 克隆质粒的构建取加A后的纯化PCR产物3.5 μL，加入pMD18-T体系5 μL ，1.5 μL灭菌超纯水, 构成10 μL反应体系, 16 ℃过夜连接,并转化至感受态TOP10中。

通过菌落 PCR 扩增、质粒大小、酶切分析鉴定重组克隆,获得重组质
粒pMD18-T-M , 并送往上海英俊公司测序进行测序。

1.6 表达载体的构建和表达
1.6.1 表达载体构建对质粒pMD18-T-M和载体PGEX-4T-1用BamHⅠ和
XhoⅠ双酶切,经1.2%琼脂糖电泳检查，切胶回收纯化后,以T4DNA连接酶连接。

连接产物转化至感受态TOP10中,小量法提取质粒进行酶切鉴定与PCR鉴定,并送往上海英俊公司测序,测序结果正确后, 提取质粒转化入Rosetta(DE3)中。

1.6.2 诱导表达含重组质粒PGEX-4T-1-M的大肠杆菌Rosetta(DE3) 在LB液体
培养基中37 ℃ 200 r/min 震荡培养过夜,用鲜培养基按1∶100稀释,继续培养2 h 至OD600为0.6～0.8,加 IPTG ,继续诱导培养,取1 mL培养液(同时做空载体对照组及未诱导对照组)离心收集菌体,加入100 μL 1×SDS Loading Buffer, 100 ℃煮
沸3 min ,10 000 r/min离心5 min,取溶液15 μL经10% SDS-PAGE电泳,考马
斯亮蓝染色进行检测。

成功诱导表达后根据IPTG浓度诱导时间筛选最佳诱导条件。

1.6.3 融合蛋白表达的Western blotting检测取诱导表达的菌体裂解液进行
SDS- PAGE,将蛋白转移至NC膜, TBST 清洗后用5%脱脂乳+TBS封闭37 ℃封闭1 h, TBST洗膜3次，每次10 min。

加入用封闭液稀释一抗鼠Anti-GST ( 1 000：1) , 4 ℃过夜孵育, TBST洗膜3次，每次10 min。

再加入用5%脱脂乳+TBS稀释的羊抗鼠HRP-IgG (2 000：1) , 37 ℃ 孵育1 h, TBST洗膜3次，每次10 min。

采用HRP-DAB试剂盒进行显色。

2 结果与分析
2.1 肌肉生长抑制素cDNA的RT-PCR
提取骨骼肌总RNA经测定纯度,在260 nm和280 nm处的OD值的比值达到
1.8～
2.0 ,因此可以进行RT-PCR。

PCR扩增后, 取适量样品进行琼脂糖凝胶电泳,
可见到1 128 bp的目的条带(在图中标出条带),与预期大小相符,如图1所示。

图1 PCR 扩增电泳图Fig.1 PCR amplification of myostatinM.DL2 000 标准分
子量; 1.秦川牛Myostatin基因的PCR产物M.DL2 000 molecular weight；1-
2.PCR products of myostatin gene of Qinchuan Cattle
2.2 肌肉生长抑制素cDNA的克隆及序列分析
将PCR产物克隆到pMD18-T载体中,得到含MSTN基因的重组质粒pMD18-T-M,酶切分析(图2)及PCR扩增鉴定均获得了预期大小的目的条带。

测序结果(表1)表明,本试验克隆的MSTN基因序列与GenBank: NM_001001525.2一致,其编码区的长度为1 128 bp,编码375个氨基酸残基的蛋白质。

有一处T突变成C(图3)，经查证氨基酸突变类型为同义突变，不改变氨基酸构成。

图2 重组质粒限制性内切酶酶切分析Fig.2 Characterization of pMD18-T-M by restriction enzyme analysisM.DL2 000标准分子量；1-2.pMD18-T-M 双酶切M. DL2 000 molecular weight；1-2.pMD18-T-M cut by restriction enzyme BamHⅠ/XhoⅠ
2.3 肌肉生长抑制素重组表达质粒的鉴定
小量提取质粒PEGX-4T-1-M ,经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切(图4)及菌落PCR 扩增, 1.2% 琼脂糖凝胶电泳显示片段长度约1 128 bp均符合目的基因分子量。

重组质
粒测序结果证实,已经成功的将肌肉生长抑制素成熟蛋白的全长基因完全正确的插
入到表达载体的目的位点上。

图3 同义突变(T→C)Fig.3 Synonymous mutation (T→C)表1 序列比对Table 1 Alignment
MSTN1a t g c a a a a a c t g c a a a t c t c t g t t t a t a t t t a c c t a t t t a t g
c t g a t t g t t g c t g g c c c a 测序
55. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .MSTN61g t
g g a t c t g a a t g a g a a c a g c g a g c a g a a g g a a a a t g t g g a a a a a g a g g g g c t g t g t a a t测序
115. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .MSTN361a
t g c c c a c g g a g t c t g a t c t t c t a a c g c a a g t g g a a g g a a a a c c c a a a t g t t g t t t c t t t测序
415 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .c . . . . . .MSTN10 21a c t c c t a c a a a g a t g t c t c c a a t t a a t a t g c t a t a t t t t a a t g g
c g a a g g a c a a a t a a a测序
1075. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .MSTN10 81t a c g g g a a g a t t c c a g c c a t g g t a g t a g a t c g c t g t g g g t g t t c a t g a测序1135. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
注：MSTN.海福特牛mstn基因mRNA的CDs序列；测序为pMD18-T-M中的
克隆基因
Note：MSTN. CDs sequence of Hereford cattle MSTN gene mRNA；Cloned gene in the pMD18-T-M
2.4 肌肉生长抑制素融合蛋白的诱导表达
将重组质粒PGEX-4T-1-M转化到 Rosetta(DE3)菌种，阳性菌经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE电泳分析,诱导重组菌比对照菌明显地多出1条相对分子质量约为69 ku的特异的表达蛋白条带,与预期大小的融合蛋白一致。

而非重组的PGEX-
4T-1质粒菌诱导培养物样品未出现明显条带(图5)。

2.4.1 不同诱导时间重组菌的表达加IPTG至终浓度1 mmol/ L ,分别于诱导1、2、
3、4、5、6、7 h取样收集菌体, SDS-PAGE分析(图4) ,根据表达量确定诱导表达的最佳时间为5 h。

2.4.2 不同IPTG浓度的诱导表达按 0 、0.2、0.4、0.6 、0.8、1、1.2、1. 4 mmol/L浓度梯度分别加入IPTG ,培养5 h ,离心收集菌体超声波破碎重悬沉淀, SDS-PAGE分析可见(图6) IPTG的浓度对重组菌表达量影响显著, 确定使用IPTG
的浓度为0.4 mmol/L。

2.4.2 不同温度的诱导表达及低温下融合蛋白表达形式按22 ℃、30 ℃、37 ℃温度梯度，加IPTG终浓度为0.4 mmol/L，诱导培养5 h，离心收集菌落超声波破碎，SDS-PAGE分析可见(图7A)37 ℃时蛋白表达含量较高，这与菌生长温度有直接关系。

图7B显示在低温环境下表达，融合蛋白仍以包涵体的形式存在。

2.5 肌肉生长抑制素融合蛋白鉴定
将诱导的重组菌裂解物进行SDS-PAGE 电泳后转印至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉TBST(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；150 mmol/L NaCl；吐温-20)封闭，以小鼠抗Anti-GST为一抗，羊抗小鼠IgG-HRP为二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色进行western blotting鉴定。

1、2、3、4均具有特异性反应(图8)，1、2为带GST标签的融合蛋白，3、4为GST标签蛋白。

说明融合蛋白成功表达。

图4 菌落PCR验证(A)及重组质粒限制性内切酶酶切分析(B)Fig.4 Characterization of recombinant colonies(A)and PGEX-4T-1-M by restriction enzyme analysis(B)M1. DL2 000标准分子量; 1-2.重组菌落PCR
M2.1 kb ladder标准分子量；a，b，c.PGEX4T-1-M双酶切(BamHⅠ和
XhoⅠ)M1.DL2 000 molecular weight；1,2. PCR amplification of recombinant colonies; M2.1 kb ladder molecular weight; a, b, c. PGEX4T-1-M cut by restriction enzyme BamHⅠ/XhoⅠ
图5 诱导时间对MSTN重组蛋白表达量的影响Fig.5 Effect of the different time on MSTN recombinant protein expression1.含有空质粒pGEX4T-1的大肠杆菌对照;2.低分子量蛋白标准; 3.未加IPT G诱导的重组菌4-10.加IPTG诱导
1 、
2 、
3 、
4 、5、6、7 h 后的重组菌1.Control E. coli with plasmid of pGEX4T-1;2.Protein molecular weight markers;3.The expressed E.coli with plasmid of pGEX4T-1-M that hadn't been induced by IPTG 4-10.The expressed E.coli with plasmid of pGEX4T-1-M that had been induced by
IPTG for 1 ,2，3，4，5，6，7 h
图6 IPTG浓度对MSTN重组蛋白表达量的影响 Fig.6 Effect of the different concentrations of IPTG on MSTN recombinant protein expression1.含有空
质粒pGEX4T-1的大肠杆菌对照; 2.低分子量蛋白标准;3.未加IPT G诱导的重组菌;4-10.加IPTG浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4 mmol/L诱导5 h后的重组菌1.Control E.coli with plasmid of pGEX4T-1;2.Protein molecular weight markers;3.The expressed E.coli with plasmid of pGEX4T-1-M that hadn't been induced by IPTG;4-10.MSTN expression when the concentration of IPTG is 0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4 mmol/L
图7 诱导温度对MSTN重组蛋白表达的影响(A)及22 ℃表达情况(B)Fig.7 Effect
of the different induction temperature on MSTN recombinant protein expression(A) and expression at 22 ℃M.蛋白Marker；1. 37 ℃；2. 30 ℃；3.
22 ℃；a.超声波破碎上清；b.超声波破碎陈定；c.20倍浓缩的培养基M.Protein marker;1-3.MSTN expression in precipitate at 37,30,22 ℃a.Ultrasoni c supernatant；b.Ultrasonic deposition；c.20 times concentrated medium
图8 蛋白印迹验证图Fig.8 Western blottingM.预染低分子蛋白标准；1-2.融合
蛋白；3-4.谷胱甘肽标签蛋白M.Prestained protein molecular weight marker；1-2.Recombination protein；3-4.GST-tag protein
3 讨论
本试验所得到的秦川牛肌肉生长抑制素基因序列与GenBank上海福特牛该基因的序列99%的相似性，从该基因起始密码子开始计算，第414 bp处发生了T→C突变。

经验证该处突变为同义突变(UCU→UCG)编码氨基酸均为丝氨酸，不影响蛋白质氨基酸结构组成，体现了密码子的简并性。

在原核细胞中进行外源基因的表达, 主要有以下几个因素影响目的蛋白的表达效率: (1) 启动子的强弱; ( 2) 核糖体结合
位点的翻译功能; (3) 表达载体的拷贝数; (4)宿主细胞对表达载体和表达产物的适应性;(5)外源基因密码子的使用效率。

本试验的目的基因来至于真核生物，而Rosetta(DE3)菌是BL21衍生菌，能明显增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。

该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。

这样Rosetta菌株实现了“万能”的翻译[9,10]。

故本试验采用Rosetta(DE3)表达菌株。

一般说来，在大肠杆菌中不加标记，外源
蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。

为了让外源蛋白融合表达与一个高度可溶的多肽联合一起表达，本试验采用含有谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferase, GST)标签的载体[11]。

本研究采用Tac启动子、GST标签的表达载体pGEX4T-1
与目的基因连接,成功构建表达载体pGEX4T-1-M,对其进行酶切鉴定和测序,与预
期结果相一致,而且目的片断保持其正确的开放阅读框。

本试验所选用的表达载体pGEX4T-1为融合表达载体, 根据基因序列推测融合蛋白的分子量约为69 ku,由目的基因表达的蛋白42.7 ku和pGEX4T-1载体编码的27.8 ku两部分组成。

将重组表达载体pGEX4T-1-M转化大肠杆菌Rosetta(DE3), IPTG诱导表达,电泳图片出现特异性条带, 且分子量符合预期大小,重组蛋白得到成
功表达。

表达载体pGEX4T-1上带有GST标签,该标签可以增加目的蛋白的溶解度，能很便利地对目的蛋白进行表达、纯化和检测。

融合蛋白可以很方便地从细菌细胞裂解液中用Glutathione Sepharose等柱料吸附纯化。

但本试验可溶性表达量并
不理想,在22 ℃条件下诱导，融合蛋白仍以包涵体的形式存在。

对该融合蛋白序列用DNASTAR软件分析，疏水性氨基酸占整个氨基酸组成的32%，另有分析表明在肌肉生长抑制素氨基酸序列靠近 N 末端有一个疏水中心是分泌信号[12,13],有资料表明[14,15],信号肽序列对基因在大肠杆菌中的表达有影响,而且由于GDF-8分
子的复杂折叠方式和独特的二硫键结构,均影响重组肌肉生长抑制素基因在大肠杆
菌中的可溶性表达。

4 结论
本试验建立的克隆表达体系，成功扩增了MSTN基因生长CDNA序列(1 128 bp),并通过诱导表达获得大小为69 ku生长抑素融合蛋白。

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