一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510112445.3
(22)申请日 2015.03.13
A01N 1/02(2006.01)
(71)申请人深圳普若赛斯生物科技有限公司
地址518000 广东省深圳市盐田区盐田街道
洪安三街国际公寓4栋1401
(72)发明人林小贞 吴洁 常海龙
咖博·瓦吉塔
(74)专利代理机构深圳市科吉华烽知识产权事
务所(普通合伙) 44248
代理人
王雨时 许建
(54)发明名称
一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液
(57)摘要
本发明提供了一种干细胞快速冷冻方法及其
使用的冷冻液，所述干细胞快速冷冻方法包括以
下步骤：将干细胞在冷冻基础液中平衡；将干细
胞转至1号冷冻液中平衡；将干细胞转至2号冷
冻液中平衡后，将干细胞转移到载体管中；将载
体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，并以载体管
任一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮
液面，使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮
中。

本发明的技术方案能够在进行快速玻璃化冷
冻时更好地保护干细胞，有效地提高干细胞经过
玻璃化冷冻后的复苏存活率，并且保持冷冻复苏
后干细胞的生长分化和表达能力等全能性不受影
响；特别是对于一些很敏感的干细胞，复苏存活
率可以提高到95%以上。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书8页 附图1页
(10)申请公布号CN 104738028 A (43)申请公布日2015.07.01
C N 104738028
A
1.一种干细胞快速冷冻方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：将干细胞在36~39℃预热的冷冻基础液中平衡1~5分钟；
步骤B：将干细胞转至36~39℃预热的1号冷冻液中平衡2~5分钟；
步骤C：将干细胞转至36~39℃预热的2号冷冻液中平衡20~60s后，提取含有干细胞的混合液转移到载体管中；
步骤D：将装载了干细胞的载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，至距离液氮液面5~10mm，将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，并使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中，旋转时间不大于5s；
其中，所述1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于所述2号冷冻液中冷冻基础液的浓度。

2. 根据权利要求1所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤D中，
将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30~45度，停留0.5~2s，然后旋转成垂直于液氮液面。

3. 根据权利要求1所述的干细胞快速冷方法，其特征在于：所述步骤D中，将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30~45度，停留0.5~1.5s，然后继续旋转至与水平面夹角60~70度，停留0.5~1.5s，最后旋转成垂直于液氮液面。

4. 根据权利要求1至3任意一项所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤D的载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中后，将载体管在液氮中保持2~5s，然后将载体管沉入到液氮中保存。

5. 根据权利要求4所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤D的载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中后，将载体管在液氮中划动2~5s，然后将载体管沉入到液氮中保存。

6. 根据权利要求1至3任意一项所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于，还包括步骤E：将载体管密封，然后沉入到液氮中保存。

7. 根据权利要求1所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤B中，将干细胞转至1号冷冻液平衡时，将干细胞放在1号冷冻液的液面或液滴顶部，让干细胞自然下沉。

8. 根据权利要求1至3任意一项所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤C中，将干细胞转至2号冷冻液中进行分步平衡，所述2号冷冻液分成第一2号冷冻液和第二2号冷冻液，先将干细胞转至第一2号冷冻液中混合，第一混合时间为10~60s；然后将干细胞转至第二2号冷冻液中混合，第二混合时间为10~60s。

9. 根据权利要求8所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述第一混合时间为15~25s，所述第二混合时间为15~30s。

10. 一种如权利要求1~9任意一项所述干细胞快速冷冻方法中使用的冷冻液，其特征在于：所述冷冻液包括冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液；所述冷冻基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液15-25%， Hepes-TCM199缓冲液75-85%；
所述1号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇5-15%、二甲基亚砜5-15%和冷冻基础液75-85%；
所述2号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇15-25%、二甲基亚砜15-25%和含有0.5mol/L蔗糖的冷冻基础液55-65%。

一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞快速冷冻的方法及其使用的冷冻液。

背景技术
[0002] 现有的干细胞冷冻方法通常是采用慢速冷冻法，也就是依靠程序式降温仪进行程序降温，慢速冷冻，这个冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，并伴随造成生物性损伤，采用这种方法即使干细胞成功复苏但是其全能性也会受损害。

[0003] 近几年随着科学技术的发展，玻璃化冷冻因为在降温冷冻过程中不形成冰晶而受到大家的关注。

玻璃化是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程。

玻璃态固体分子之间的关系和液态无明显区别，在降温冷冻过程中不形成冰晶，细胞结构不会受到破坏从而细胞得以存活，是一种理想的冷冻保存途径。

[0004] 目前，在干细胞的玻璃化冷冻领域，很多企业和研发人员主要关注冷冻液，而对于干细胞的快速冷冻方法关注很少，实际上，干细胞经过玻璃化冷冻后复苏的存活率除了与冷冻液有很大的关系之外，其与整个干细胞玻璃化冷冻和复苏的方法也有很大的关系；现有本技术领域使用的干细胞玻璃化冷冻的方法与程序降温冷冻的方法相比，复苏后干细胞的存活率已有很大的提高，但是对于一些数量极少的干细胞，复苏存活率还不够，使其在后续使用复苏后的干细胞时因为数量小，也起不到很好的作用。

发明内容
[0005] 针对以上技术问题，本发明提供了一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液，进一步提高了干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

[0006] 对比，本发明提供了一种干细胞快速冷冻的方法，主要包括以下步骤：
[0007] 步骤A：将干细胞在36～39℃预热的冷冻基础液中平衡1～5分钟；让干细胞与冷冻基础液充分接触。

[0008] 步骤B：将干细胞转至36～39℃预热的1号冷冻液中平衡2～5分钟；[0009] 步骤C：将干细胞转至36～39℃预热的2号冷冻液中平衡20～60s后，提取含有干细胞的混合液转移到载体管中；
[0010] 步骤D：将装载了干细胞的载体管进行玻璃化冷冻：将装载了干细胞的载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层至距离液氮液面5～10mm，将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，并使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中，旋转时间不大于5s；
[0011] 其中，所述1号冷冻液和2号冷冻液均为包含相同冷冻基础液的冷冻液，所述1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于所述2号冷冻液中冷冻基础液的浓度，即所述1号冷冻液中其他物质的浓度小于所述2号冷冻液中其他物质的浓度，这样，干细胞在1号冷冻液中平衡后，转移到浓度较高的2号冷冻液中平衡，逐步适应和平衡，这个过程更利于使干细胞中
的水分子游离出来进入到冷冻液中，在后续干细胞的玻璃化冷冻时，减少对干细胞的损害，更好的提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

[0012] 所述冷冻基础液可以采用现有技术中已知的预冻液，所述1号冷冻液和2号冷冻液可以采用现有技术中已知的冷冻液，满足1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于2号冷冻液中冷冻基础液的浓度即可；可以为1号冷冻液和2号冷冻液中的组成物质相同，只是配比不同，1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于2号冷冻液中冷冻基础液的浓度，1号冷冻液中其他物质浓度小于2号冷冻液中其他物质的浓度。

[0013] 所述步骤A中，冷冻基础液的用量为每个干细胞群不小于5μL；所述步骤B中，1号冷冻液的用量为每个干细胞群不小于5μL；所述步骤C中，2号冷冻液的用量为每个干细胞群不小于10μL。

较优的，所述冷冻基础液的用量为每个干细胞群5～25μL，所述1号冷冻液的用量为每个干细胞群10μL～50μL；所述2号冷冻液的用量为每个干细胞群10μL～100μL。

[0014] 所述步骤D中将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转时，优选以载体管口径较大的一端为圆心向液氮液面进行旋转；进一步优化，载体管为OPS，以大口径端为圆心向液氮液面进行旋转。

[0015] 所述载体管较优为一端为毛细管开口的麦管，这样便于干细胞快速的载入到载体管中。

进一步优化，所述载体管为OPS。

[0016] 上述步骤，较优在环境温度为25～27度下操作。

[0017] 采用上述技术方案，将干细胞在冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液进行分步平衡，使干细胞与冷冻液之间逐渐缓慢平衡，缩小两者之间的浓度差，能更好的保护干细胞，使其尽可能的减少损害；采用步骤D的方法让装载了干细胞的载体管旋转，使其先接触液氮蒸汽，然后再渐渐的接触液氮液面，直至完全浸入到液氮中，让干细胞逐渐适应低温的液氮环境，减少对干细胞的损害，有利于提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

[0018] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D中，将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30～45度，停留0.5～2s，然后旋转成垂直于液氮液面。

采用此技术方案，先将装载了干细胞的载体管旋转至更接近液氮液面的状态，在温度更低的液氮蒸汽中停留0.5～2s，逐步适应低温环境，然后再旋转直到浸入到液氮中，再适应更低温度的液氮，采用这种阶梯式的逐渐适应液氮，减少对干细胞的损害，更好的提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

[0019] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D中，将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30～45度，停留0.5～1.5s，然后继续旋转至与水平面夹角60～70度，停留0.5～1.5s，最后旋转成垂直于液氮液面。

采用更进一步的阶梯式旋转，逐渐适应液氮，减少了对干细胞的损害，更好的提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。

[0020] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D，载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中后，将载体管在液氮中保持2～5s，然后将载体管沉入到液氮中保存。

较优的，将载体管在液氮中保持2～3s。

采用此技术方案，可以更进一步的适应液氮环境，提高降温速度，减少接触液氮后与液氮温度平衡的时间，达到快速玻璃化的目的，更好的保护干细胞，提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，使复苏后干细胞全能性不受影响。

[0021] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D，载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中后，将载体管在液氮中划动2～5s，然后将载体管沉入到液氮中保存。

较优的，将载体管在液氮中划动2～3s。

采用此技术方案，可以更进一步的适应液氮环境，提高降温速度，减少接触液氮后与液氮温度平衡的时间，达到快速玻璃化的目的，更好的保护干细胞，提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，使复苏后干细胞全能性不受影响。

[0022] 作为本发明的进一步改进，还包括步骤E：将载体管密封，然后沉入到液氮中保存。

采用此技术方案，可以避免干细胞在冷冻保存时受到污染，更好的冷冻保存干细胞；较优的，可将载体管装入到保护管中密封，然后沉入到液氮中保存。

[0023] 作为本发明的进一步改进，所述步骤B中，将干细胞转至1号冷冻液平衡时，将干细胞放在1号冷冻液的液面或液滴顶部，让干细胞自然下沉。

采用此技术方案，让干细胞自然下沉、慢慢地接触冷冻液，减少对干细胞的刺激，更有利于保护干细胞，提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，使复苏后干细胞全能性不受影响。

[0024] 作为本发明的进一步改进，所述步骤C中，将干细胞转至2号冷冻液中进行分步平衡，所述2号冷冻液分成第一2号冷冻液和第二2号冷冻液，先将干细胞转至第一2号冷冻液中混合，第一混合时间为10～60s；然后将干细胞转至第二2号冷冻液中混合，第二混合时间为10～60s。

采用此技术方案，使干细胞在冷冻液中逐步平衡，使干细胞的水分子进一步游离出来进入到冷冻液中，使得在后续干细胞的快速玻璃化冷冻中，不易形成冰晶，更好的保护干细胞，提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，并使复苏后干细胞全能性不受影响。

其中，所述第一2号冷冻液和第二2号冷冻液为相同的冷冻液分别放置在两个不同的培养装置中，或者相同的冷冻液在同一个培养装置的两个不同位置，其中之一命名为第一2号冷冻液，另外一个命名为第二2号冷冻液，也可采用其他的名称进行命名，仅仅为了在后续操作中进行区分。

[0025] 作为本发明的进一步改进，所述第一混合时间为15～25s，所述第二混合时间为15～30s。

采用此技术方案，进一步保护干细胞，使得在后续干细胞的快速玻璃化冷冻中，不易形成冰晶，更好的保护干细胞。

[0026] 本发明还提供了一种如上所述的干细胞快速冷冻方法中使用的冷冻液，所述冷冻液包括冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液；所述冷冻基础液所包含的组分及体积含量为：血清替代补充液15-25％，Hepes-TCM199缓冲液75-85％。

[0027] 所述1号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇5-15％，二甲基亚砜(DMSO)5-15％和冷冻基础液75-85％；
[0028] 所述2号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇15-25％，二甲基亚砜(DMSO)15-25％和含有0.5mol/L蔗糖的冷冻基础液55-65％。

[0029] 较优的，所述Hepes-TCM199缓冲液为含有0.22g/L丙酮酸钠(Sodium pyruvate)和0.0461g/L左旋谷氨酰胺(L-Glutamin)的Hepes-TCM199缓冲液。

[0030] 采用此技术方案的冷冻液，可以为干细胞提供全面的营养，而又不给干细胞造成污染，更好的保护干细胞，使经玻璃化冷冻的干细胞复苏存活率得到提高，使复苏后干细胞全能性不受影响。

[0031] 上述冷冻液的制备方法为：在室温下，分别将上述冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液包含的组分混合，并搅拌均匀即可。

[0032] 本发明还的另一个方面涉及一种用于干细胞冷冻试剂盒，其包含本发明上述冷冻液，较优的，还包括冷冻基础液。

[0033] 关于干细胞的复苏方法可以采用常规的细胞复苏液和复苏方法，也可按照本发明如下提供的复苏液和复苏方法，本发明提供的复苏液包括复苏基础液、1号复苏试剂和2号复苏试剂；所述基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液15-25％，75-85％TCM199缓冲液；
[0034] 所述1号复苏试剂包含的组分及其体积含量为：0.2mol/L蔗糖的复苏基础液；[0035] 所述2号复苏试剂包含的组分及其体积含量为：0.1mol/L蔗糖的复苏基础液；[0036] 较优的，所述TCM199缓冲液为含有0.22g/L丙酮酸钠(Sodium pyruvate)和0.0461g/L左旋谷氨酰胺(L-Glutamin)的Hepes-TCM199缓冲液75-85％；
[0037] 采用此技术方案，可以为干细胞提供全面的营养，而又不会给干细胞造成污染，更好的保护干细胞。

[0038] 复苏过程包括以下步骤：
[0039] 步骤A)：预热试剂，将2号复苏试剂预热达到25-27℃，注入到培养装置A中得到为2号复苏试剂A；然后将预热达到25-27℃的复苏基础液注入到培养装置B和培养装置C 中，得到复苏基础液B和复苏基础液C。

[0040] 其中，所述培养装置A、培养装置B和培养装置C可以为不同的培养装置，为了区分，命名为培养装置A、培养装置B和培养装置C；所述培养装置A、培养装置B和培养装置C也可以为相同一个培养装置的不同容腔位，为了区分，命名为培养装置A、培养装置B和培养装置C；此处的命名仅仅为了区分的作用，可以采用其他的命名。

[0041] 所述培养装置优选为四孔板，所述培养装置A、培养装置B和培养装置C分别为四孔板中的其中三孔。

[0042] 步骤B)：将1号复苏试剂保持密封进行预热，并将培养装置预热，预热温度均为36～39度，预热时间大于30min；将预热好的试剂注入到预热好的培养装置中，并将装好试剂的培养装置放在显微镜下；采用显微操作可以减少错误。

[0043] 步骤C)：取出载体管，进行复温；
[0044] 将载体管从液氮中取出，如果载体管是密封的，则打开密封装置；如果载体管是放入到保护管再密封的，则将保存管从密封状态开启，取出载体管。

[0045] 然后将载体管含有细胞的一端置于1号复苏试剂上方2～5s，然后浸入到1号复苏试剂中，并使载体管含有细胞的一端完全浸入到复苏试剂中，载体管的浸入角度为20°至30°(相对于水平面)，整个浸入操作在显微镜下操作。

所述显微镜优选立体显微镜或解剖镜。

[0046] 步骤D)：取出载体管中的细胞；
[0047] 对于载体管为OPS的，将载体管的另一端堵住，载体管里的溶液就从载体管中流出到装有1号复苏试剂的培养皿中；或者采用移液装置从载体管的另一端加入空气排除含有干细胞的溶液。

[0048] 步骤E)：进行细胞恢复；
[0049] 将干细胞转至2号复苏试剂A中，停留1分钟；
[0050] 然后将干细胞转至2号复苏试剂B中，停留5分钟；
[0051] 再将干细胞转至2号复苏试剂C中，停留5分钟；
[0052] 最后将干细胞放入到新鲜的培养基中。

所述培养基为常规用于细胞培养的培养基。

[0053] 在本发明中，如果没有特殊说明，术语“含量”均为体积含量。

[0054] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0055] 本发明的技术方案能够在进行快速玻璃化冷冻时更好地保护干细胞，有效地提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，并且保持冷冻复苏后干细胞的生长分化和表达能力等全能性不受影响；特别是对于一些很敏感的干细胞，复苏存活率可以提高到95％以上。

附图说明
[0056] 图1是本发明实施例2中装载了干细胞的冷冻管旋转浸入液氮的示意图。

具体实施方式
[0057] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

[0058] 实施例1
[0059] 用于干细胞快速冷冻的冷冻液制备：
[0060] 所述冷冻液包括冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液；
[0061] 所述冷冻基础液所包含的组分及体积含量为：血清替代补充液15％，含有0.22g/ L丙酮酸钠(Sodium pyruvate)和0.0461g/L左旋谷氨酰胺(L-Glutamin)的Hepes-TCM199缓冲液85％；
[0062] 所述1号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇5％，二甲基亚砜(DMSO)15％，上述冷冻基础液80％；
[0063] 所述2号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇15％，二甲基亚砜(DMSO)25％，含有0.5mol/L蔗糖的冷冻基础液60％。

[0064] 在室温下，分别将上述冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液包含的组分混合，并搅拌均匀，预热到36～39℃，待用。

[0065] 实施例2
[0066] 以下操作均在25～27度的环境温度下进行操作。

[0067] (1)干细胞玻璃化冷冻：
[0068] 载体管采用OPS麦管，所述OPS麦管包括冷冻管和保护管，所述冷冻管一端为大口径端，另外一端为小口径端；冷冻液采用上述实施例1制备好的冷冻液，干细胞的玻璃化冷冻采用以下步骤：
[0069] 步骤A：将干细胞在冷冻基础液中平衡5分钟；
[0070] 步骤B：将干细胞转至1号冷冻液平衡，采用将干细胞放在1号冷冻液的液滴顶部，让干细胞自然下沉，等待5分钟。

[0071] 步骤C：将干细胞转至2号冷冻液中进行分步平衡，在培养皿上分开放置两份2号冷冻液，分别得到第一2号冷冻液和第二2号冷冻液，先将干细胞转至第一2号冷冻液中混合，混合时间为15～25s；然后将干细胞转至第二2号冷冻液中混合，混合时间为15～30s；
提取含有干细胞的混合液转移到冷冻管中；
[0072] 上述步骤A、步骤B和步骤C均在25～27度的室温环境下进行。

[0073] 步骤D：将装载了干细胞的冷冻管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，至距离液氮液面5～10mm，将冷冻管以冷冻管的大口径端为圆心向液氮液面进行旋转，如图1所示，先旋转至冷冻管与水平面夹角为30～45度处，停留0.5～1s；然后继续旋转至与水平面夹角60～70度，停留0.5～1s，最后旋转成垂直于液氮液面，并使装载了细胞的冷冻管小口径端浸入到液氮中，将冷冻管在液氮中划动2～3s；
[0074] 步骤E：将冷冻管装入到保护管中，将保护管的管口用密封钳进行加热密封，然后沉入到液氮中保存。

[0075] (2)干细胞复苏过程：
[0076] 复苏液准备：
[0077] 本例中复苏液包括复苏基础液、1号复苏试剂和2号复苏试剂；
[0078] 所述复苏基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液15％，含有0.22g/ L丙酮酸钠(Sodium pyruvate)和0.0461g/L左旋谷氨酰胺(L-Glutamin)的Hepes-TCM199缓冲液85％；
[0079] 1号复苏试剂包含的组分及其体积含量为：0.2mol/L蔗糖的基础液；
[0080] 2号复苏试剂包含的组分及其体积含量为：0.1mol/L蔗糖的基础液；
[0081] 干细胞复苏操作包括以下步骤：
[0082] 步骤A)：预热试剂，将2号复苏试剂预热达到25-27℃，注入到四孔板的孔2中，得到2号复苏试剂A；然后将预热达到25-27℃的复苏基础液注入到四孔板的孔3和孔4中，得到复苏基础液B和复苏基础液C，四孔板的孔1空置；
[0083] 步骤B)：将1号复苏试剂保持密封进行预热，并将培养装置预热，预热温度均为36～39度，预热时间60min；将预热好的试剂注入到预热好的培养装置中，并将装好试剂的培养装置放在显微镜下；
[0084] 步骤C)：取出载体管，进行复温；
[0085] 将保护管从液氮中取出，剪开密封端，将冷冻管取出；然后将冷冻管含有细胞的的小口径端置于1号复苏试剂上方2s，然后以相对于水平面20°至30°的角度浸入到1号复苏试剂中，并使冷冻管中含有细胞的部分完全浸没到1号复苏试剂中；上述整个浸入操作在立体显微镜下操作；
[0086] 步骤D)：取出载体管中的细胞；
[0087] 步骤C完成后，冷冻管中的玻璃化的物质融化后，培养皿中的试剂倒流进入冷冻管中，此时，将冷冻管的大口径端堵住，冷冻管里的溶液就从冷冻管中流入到装有1号复苏试剂的培养皿中；或者采用移液装置从冷冻管的大口径端打入空气排除含有干细胞的溶液；
[0088] 步骤E)：进行细胞恢复；
[0089] 将干细胞转至四孔板的2号复苏试剂A中，停留1分钟；
[0090] 然后将干细胞转至复苏基础液B中，停留5分钟；
[0091] 再将干细胞转至复苏基础液C中，停留5分钟；
[0092] 最后将干细胞放入到新鲜的培养基中。

所述培养基为常规用于细胞培养的培养。