荧光光谱知识剖析

荧光光谱教程
一、化学发光反应的类型
1．直接化学发光和间接化学发光
化学发光反应可分直接发光和间接发光。

直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。

表示如下：
式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射出光子hv。

间接发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始态C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F处于激发态，当F*跃迁回基态时，产生发光。

如下式表示
式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。

例如，用罗丹明B－没食子酸的乙醇溶液测定大气的O3，其化学发光反应就属这一类型。

没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗丹明B，并使罗丹明B分子激发，处于激发态的罗丹明B分子回到基态时，发射出光子。

该光辐射的最大发射波长为584nm。

2. 气相化学发光和液相化学发光
按反应体系的状态来分类，如化学发光反应在气相中进行称气相化学发光，在液相或固相中进行称液相或固相化学发光，在两个不同相中进行则称为异相化学发光。

本节主要讨论气相和液相化学发光，其中液相化学发光在痕量分析中更为重要。

（1）气相化学分光
主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。

☆臭氧与乙烯的化学发光反应机理是O3氧化乙烯生成羰基化合物的同时产生化学发光，发光物质是激发态的甲醛。

这个气相化学发光的最大波长为435nm，发光反应对O是特效的，线性响应范围为1ng·mL-1～1μg·mL-1。

☆一氧化氮与臭氧的气相化学发光反应有较高的化学发光效率，其反应机理为：
这个反应的发射光谱范围为600～875nm，灵敏度可达1ng·mL-1。

若需同时测定大气中的NO2时，可先将NO2还原为NO，测得NO总量后，从总量中减去原试样中NO的含量，即为NO2 的含量。

☆SO2、NO、CO等都能与氧原子进行气相化学光反应，他们的反应分别为：
此反应的最大发射波长为200nm，测定灵敏度可达1ng·mL-1。

发射光谱范围为400～1400nm，测量灵敏度可达1ng·mL-1。

发射光谱范围为300～500nm，测定灵敏度可达1ng·mL-1。

这些反应的关键是要求有一个稳定的氧原子源，一般可由O3在1000℃的石英管中分解为O2和O而获得。

☆火焰化学发光，氮的氧化物（如NO2、NO等）及挥发性的硫化物（如SO2、H2S、CH3SH等）富氢火焰中燃烧都会发生化学发光。

（2）液相化学发光
用于这一类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱等，其中鲁米诺（Lominol）化学发光反应机理研究得最久，其化学发光体系已用于分析化学测量痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg和Th等金属离子。

鲁米诺是3-氨基苯二甲酰肼，它产生化学发光反应的为0.01～0.05。

鲁米诺在碱性溶液中形成叠氮醌（a），叠氮醌在碱性溶液中与氧化剂如H2O2作用生成不稳定的桥式六员环过氧化物中间体（b）。

然后再转化为激发态的氨基邻苯二甲酸根离子（c），其价电子从第一电子激发态的最低振动能级层跃迁回基态中各个不同振动能级层时，产生最大发射波长为425nm的光辐射，整个反应历程可表示如下：
以上的化学发光反应的速率很慢，但某些金属离子（如在本节开始所提到的金属离子）会催化这一反应，增强发光强度。

利用这一现象可以测定这些金属离子。

还可将分析物通过酶的转化，生成化学发光反应物，然后再进行化学发光反应，根据化学发光强度间接测定被分析物。

例如，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下进行氧化反应，反应产物H2O2可通过鲁米诺化学发光反应进行测定，从而间接测定葡萄糖。

氨基酸的测定也一样：
H2O2使鲁米诺发光。

如果使酶促反应的底物浓度一定，则上述反应可用于酶测定或酶动力学研究。

二、化学发光的基本原理
某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发到激发态，受激分子由激发态去激化跃迁回基态时以辐射形式发射出一定波长的光。

这种吸收化学能使分子激发并发光的过程，称为化学发光。

利用化学发光建立起来的分析方法称为化学发光分析法。

化学发光也发生在某些生物体系内，称为生物发光。

化学发光分析法的特点是，灵敏度高，选择性好，仪器设备简单，分析速度快。

但是目前可供发光用的试剂还不多，应用还有限，发光机理有待进一步研究。

化学发光是基于化学反应所提供的化学能使分子激发而发射光的，任何一个化学发光反应都包含有化学激发和发光两个关键过程，它必须满足下列条件：
1．化学反应必须提供足够的激发能，激发能的主要来源是反应焓，能在可见光范围内发生化学发光的物质，其激发能ΔE通常是在150～400KJ·mol－1范围。

许多氧化还原反应的反应焓与此相当，因此大多数化学发光反应为氧化还原反应。

2．要有有利的化学反应历程，使反应产生的化学能用于不断地产生激发态分子。

对于有机化合物的液相化学发光来说，芳香族化合物和羰基化合物更容易生成激发态的产物。

3．激发态分子跃迁回基态时，要能释放出光子，或激发态分子能将能量转移给另一种分子，使该分子受激后发射光子。

总之，激发态分子不能以热的形式损失能量。

化学发光反应的化学发光效率，又称为化学发光的总量子产率。

它决定于生成激发
态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。

定义为：
化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。

每一个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率。

化学发光反应的发光强度I Cl以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度有关。

可以下式表示：
式中表示t时刻的化学发光强度，是与分析物有关的化学发光效率，d c/d t是分析物参加反应的速率。

如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度与该时刻的分析物浓度成正比，就可以通过检测化学发光强度来定量测定分析物质。

在化学发光分析中通常用峰高表示发光强度，即峰值与被分析物浓度成线性关系。

另一种分析方法是利用总发光强度与分析物浓度的定量关系。

就是在一定的时间间隔里对化学发光强度进行积分，得到：
如果取t1=0，t2为反应结束所需的时间，则得到整个反应产生的总发光强度，它与分析物浓度存在线性关系。

三、化学发光分析的应用
化学发光分析最大的特点是灵敏度高，对气体和痕量金属离子的检出限都可达ng·mL－1级。

在环境检测中化学发光法比吸收光谱法和微库仑法具有更高的灵敏度，又能进行快速连续分析，因此气相化学发光反应已广泛用于空气中有害物质如O3、氮氧化物、CO、SO2、H2S等的监测。

其测定灵敏度可达1～3ng·mL－1。

液相化学发光反应，如鲁米诺、光泽精、没食子酸等发光体系可测定天然水和废水中的金属离子。

在医学、生物学、生物化学和免疫学研究中，化学发光分析也是一种重要的手段。

表4.8～4.10列举了一些实例。

四、荧光和磷光分析法的基本原理
第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，他于1575年提到，在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色。

以后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象，但对其本质及含义的认识都没有明显的进展。

直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧光是光发射的概念，并提出了“荧光”这一术语，他还研究了荧光强度与荧
光物质浓度之间的关系，并描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝灭现象。

可以说，他是第一个提出应用荧光作为分析手段的人。

1867年，Goppelsr?de应用铝一桑色素配位化合物的荧光测定铝，这是历史上首次进行的荧光分析工作。

进入二十世纪以来，荧光现象被研究得更多了，在理论和实验技术上都得到极大的发展。

特别是近几十年来，在其他学科迅速发展的影响下，随着激光、计算机和电子学的新成就等一些新的科学及技术的引入，大大推动了荧光分析法在理论上及实验技术上的发展，出现了许多新的理论和新的方法。

在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作者从事荧光分析方面的研究工作。

到了七十年代以后，已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍。

目前，研究内容已从经典的荧光分析方法扩展到新近发展起来的一些新方法和新技术。

磷光也是某些物质在紫外光照射下所发射的光，早期并没有与荧光明确的区分。

1944年Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光，它有别于从激发单重态跃迁回基态所发射的荧光。

磷光分析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也不断得到发展。

五、荧光和磷光的产生
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。

处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。

激发态是很不稳定的，它将很快地释放出能量又重新跃迁回基态。

若分子返回基态时以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量，就称为“发光”。

如果物质的分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。

现从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理。

每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。

分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1 。

根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。

若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0，M=1，该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。

大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。

基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1，M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。

图14.1为电子重态示意图。

处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪特规则)，因此在同一激发态中，三重态能级总是比单重态能级略低。

图14.2为能级及跃迁示意图，其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态；T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。

V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。

图14.1 单重态系三重态激发示意图
图14.2 荧光和磷光体系能级图
处于激发态的分子是很不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式去活化(去激发)释放出多余的能量而返回基态。

辐射跃迁主要涉及到荧光，延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部转移、系间跨越及外部转移等过程。

图14.2表示分子激发和去活化的能量传递过程：
1．振动弛豫（Vibration relaxation ，简写为VR ）
当分子吸收光辐射(为图14.2中的λ1、λ2)后可能从基态的最低振动能级(V =0)跃迁到激发单重态S n (如图中S 1、S 2)的较高振动能级上。

然后，在液相或压力足够高的气相中，分子间的碰撞几率很大，分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围环境，而自身从激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的最低振动能级上，这个过程称为振动弛豫。

发生振动弛豫
的时间为10－12s数量级。

2．内部转移（Internal conversion，简写为IC）
当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。

如图14.2中，S2和T2中的低振动能级与S1和T1中的高振动能级重叠，电子可以通过振动能级的重叠从S2跃迁至S1，或从T2跃迁至T1。

这个过程称为内部转移。

内部转移的时间为10－11s～10－13s数量级。

振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低(第一)激发单重态的最低振动能级。

3．荧光发射（Fluorescence emission，FE）
处于激发单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态(S1)的最低振动能级(V=0)后，以辐射的形式跃迁回基态(S0)的各振动能级，这个过程为荧光发射，发射的荧光波长为。

由于经过振动弛豫和内部转移的能量损失，因此荧光发射的能量比分子吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长，即。

第一激发单重态最低振动能级的平均寿命约为10－9～10－4s，因此荧光寿命也在这一数量级。

4．系间跨跃（Intersystem Crossing，ISC）
系间跨跃是指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。

如由第一激发单重态S1跃迁至第一激发三重态T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对。

这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选律)，但如果两个能态的能层有较大重叠时，如图14.2中S1的最低振动能级与T1的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道耦合等作用实现这一跃迁。

系间跨跃的速度较慢，经历的时间较长。

5．磷光发射（Phosphorescence emission，PE）
激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。

磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。

磷光的寿命为10－4～100s。

因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。

由于经过系间跨跃及T1中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长，即
必须指出的是，T1还可能通过热激发而重新跃回S1即T1S1，然后再由S1经辐射跃迁回S0，即S1S0，发出荧光，这种荧光称为延迟荧光，其寿命与磷光相近，但波长比磷光短。

6．外部转移（External convertion，EC）
激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。

外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为猝灭或熄灭。

六、激发光谱和发射光谱
荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉及到两种辐射，即激发光(吸收)和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。

它们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数及依据。

1. 激发光谱
通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(即强度)随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。

激发光谱的具体测绘方法是，通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体，发出的荧光(磷光)通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光(磷光)强度，最后通过记录仪记录光强度对激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。

通过激发光谱，选择最佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用λex表示。

2. 发射光谱，也称荧光光谱或磷光光谱
通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(强度)随发射光波长的变化而获得的光谱，称为发射光谱。

其测绘方法是，固定激发光的波长，扫描发射光的波长，记录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。

通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用λem表示。

磷光发射波长比荧光来得长，图14.3为萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱。

图14.3 萘的激发光谱、荧光和磷光光谱
3. 荧光激发光谱和发射光谱的特征
★斯托克斯位移
在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长，λem>λex。

Stokes于1852年首次发现这种波长位移现象，故称Stokes位移。

斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能量损失。

激发态分子由于振动弛豫及内部转移的无辐射跃迁而迅速衰变到S1电子激发态的最低振动能级，这是产生其位移的主要原因；其次，荧光发射时，激发态的分子跃迁到基态的各振动能级，此时，不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失；第三，溶剂效应和激发态分子可能发生的某些反应，也会加大斯托克斯位移。

★荧光发射光谱的形状与激发波长无关
由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到哪种激发态，都将经过迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级，然后发射荧光。

因此除了少数特殊情况，如S1与S2的能级间隔比一般分子大(如)及可能受溶液性质影响的物质外，荧光光谱只有一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关。

★荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似，荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系物质的分子只有对光有吸收，才会被激发，所以，从理论上说，某化合物的荧光激发光谱的形状，应与它的吸收光谱的形状完全相同。

然而实际并非如此，由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些影响，使得绝大多数情况下，“表观”激发光谱与吸收光谱两者的形状有所差别。

只有在校正仪器因素后，两者才非常近似，而如果也校正了环境因素后，两面的形状才相同。

如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱相比较低，便会发现两者之间存在着“镜像对称”关系。

如图14.4分别表示苝的苯溶液和硫酸奎宁的稀硫酸溶液的吸收光谱和荧光发射光谱。

为什么两种光谱会互为镜像关系呢？
这不难由荧光发射光谱和吸收光谱的成因来解释。

吸收光谱中的第一吸收带(波长较长的吸收带)是由于基态分子吸收光能量被激发到第一电子激发态的各不同振动能级，所以，其形状取决于第一电子激发态中各振动能级的分布情况(即能量间隔情况)，而荧光光谱是激发态分子从第一电子激发单重态的最低振动能级跃回基态中的各不同振动能级所致，所以荧光光谱的形状取决于基态中各振动能级的分布情况。

一般情况下，基态和第一电了激发单重态中振动能级的分布情况是相同的，所以荧光发射光谱与吸收光谱的形状是类似的。

图14.5 镜像对称规则
另一方面，吸收时由基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态的各振动能级，振动能级越高，所吸收的能量越大，即吸收峰的波长越短；而相反，
荧光发射是由第一电子激发单
重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级，振动能级越大，所释放的能量越小，即发射的荧光峰波长越长。

另外，由于电子跃迁的速率非常之快，以致于跃迁过程中分子中原子核的相对位置没有明显发生变化，其结果是，假如吸收时由S0的V=0与第一激发态S1的V=2 之间的跃迁几率最大(即强度最大)，那么在荧光发射时，由S1的V=0跃回S0的V=2的几率也应该最大，如图14.5所示。

基于上述原因，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称关系。

七、有机化合物的荧光
在已知大量的有机化合物当中，仅有一小部分会发射强的荧光，这与有机化合物的结构密切相关。

能发射强荧光的有机化合物通常具有以下的结构特征√：
1. 具有电子跃迁类型的结构
实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由或跃迁激发，然后经过振动
弛豫等无辐射跃迁，再发生或跃迁而产生荧光。

而其中吸收时跃迁
的摩尔吸光系数比跃迁的大102～103倍，跃迁的寿命(10－7～10－9)比
跃迁的寿命(10－5～10－7)短，因此荧光发射的速率常数K f值较大，荧光发射的效率高。

因此，跃迁发射荧光的强度大。

此外，在跃迁过程中，通过系间跨跃从单重态跃迁至三重态的速率常数K ISC也比较小，有利于荧光的发射。

总之，跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。

2. 具有大的共轭π键结构
发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共轭双键(π键)的结构体系。

共轭体系越大，电子的离域性越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。

大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光(或磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。

例如苯和萘的荧光位于紫外区，蒽位于蓝区，丁省位于绿区，戊省位于红区,见表14.1。

同一共轭环数的芳族化合物，线性环结构者的荧光波长比非线性者要长，如蒽和菲，其共轭环数相同，前者为线性环结构，后者为“角”形结构，前者λem为400nm，后者λem 为350nm。

3. 具在刚性平面结构
实验发现，多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量外部转移的损失，有利于荧光的发射。

而且平面结构可以增大分子的吸光截面，增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。

酚酞与荧光黄(亦称荧光素)的结构十分相近(下图所示)，只是由于
荧光黄分子中的氧桥使其具有刚性平面结构，因而在溶液中呈现强烈的荧光，在0.1mol·L-1的NaOH溶液中，荧光效率达0.92，而酚酞却没有荧光。

又如芴与联二苯(下图所示)，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于1，后者仅为0.18。

萘与维生素A都具有5个共轭π键(下图所示)，而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的5倍。

八、无机化合物的荧光
无机化合物的荧光有无机盐类的荧光和金属螯合物的荧光两种：
★某些无机盐类的荧光
无机化合物本身能发荧光(或磷光)的不多，常见的主要有镧系元素(Ⅲ)的化合物，U(Ⅵ)化合物，类汞离子化合物Tl(Ⅰ)、Sn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、As(Ⅲ)、Sb(Ⅲ)、Bi(Ⅲ)、Se(Ⅳ)、Te(Ⅳ)等，以及某些过渡金属离子，如Cr(Ⅲ)等。

这些化合物在低温(液氮)下都有较高的荧光效率和选择性，因此常用低温荧光法进行测定。

★金属螯合物的荧光
不少不发荧光的无机离子与具有吸光结构的有机试剂发生配合作用，生成会发荧光的螯合物，可以进行荧光测定。

这种能发荧光的螯合物可能是螯合物中配位体的发光，也可能是螯合物中金属离子的发光。

●螯合物中配位体的发光。

这一类螯合物中金属离子的外电子层具有与惰性气体相同。