Mr基因组提取

空斑实验及基因组的提取
汇报人：马锐
1.空斑或蚀斑形成试验（原理）
空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。

一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。

不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。

可进行病毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可进行病毒的鉴定基因组的提取原理。

⏹真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

提取DNA 的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

⏹蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。

在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来
2.仪器及试剂
1. 仪器：
恒温水浴锅、台式离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）
2. 试剂：
（1）细胞裂解缓冲液： 10%SDS EDTA (pH 8.0) 0.5mol/L 蛋白酶K
（2）DMEM 10%DMEM 2倍DMEM 低熔点琼脂糖（1.5%-2%）
（4）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、
（5）异丙醇、70%乙醇、灭菌水。

3.空斑操作步骤（以伪狂犬重组病毒为例）
⏹将转染后收的毒液冻融2次后接6孔板。

⏹待6孔板细胞长至90%开始实验
⏹先将毒液稀释成10-1~10-6几个梯度
（用无血清的DMEM）
⏹接毒前用PBS把细胞洗两遍
⏹接毒量视毒价而定，接毒后于培养箱孵育1小时
⏹弃去病毒液，用PBS洗一遍，每孔加入2ml 2倍DMEM和低熔点琼脂糖的混合液（DMEM 1ml+低熔点琼脂糖1ml）
⏹待混合液室温冷却10分钟后于4度再放置5分钟，放入细胞培养箱培养24-48小时后挑斑接于24孔板。

4.操作步骤（提基因组）
⏹将已经病变收毒的24孔板反复冻融次后每孔依次吸取200 ul上清毒液。

⏹每孔加入10ul 10%SDS ，10ul 0.5M EDTA，1.3 ul蛋白酶K,50℃作用1小时或37℃作用6小时以上。

⏹加等量的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）振荡混匀，离心12000 rpm，10min。

⏹取上层溶液至另一管，加入0.1体积的3M NaAC和2体积的乙醇，-80℃沉淀2小时。

⏹离心12000 rpm，10min，弃上清，沉淀用500ul 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，10min。

⏹小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

⏹每管加20 ul灭菌双蒸水溶解。

5.注意事项
⏹1、低熔点琼脂糖的使用及储存
⏹2、空斑接毒时要注意毒量，最好不要太多，待两天后挑斑
⏹3、加入混合液时要迅速
⏹4、挑斑时尽量挑取单个斑落，于高滴度的孔中挑取
⏹1、用枪吸酚时注意
⏹2、酚：氯仿：异戊醇比例要严格
⏹3、加入混合液混匀要充分
⏹4、干燥要充分，加水溶解时不要剧烈重悬以免基因组断裂。

⏹5. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。

沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

6.基因组的大量提取
（以PRV基因组的提取为例）
1.取6到8吹散大瓶病变的细胞（IB或PK），弃去培养基，每瓶用10ml PBS吹散，离心5000 rpm，5min晾干。

2.加入10ml Lcm悬浮，冰浴15min
3.加入1ml 氟利昂，涡旋5min（压力极大，盖紧）
4. 4℃ 2500 rpm，10min取上清加1ml氟利昂，继续涡旋5min
5. 4℃ 2500 rpm，10min取上清至一新的50ml离心管中。

6.超速离心管中依次缓慢加入45%甘油16ml，5%甘油12ml，上清。

7.超速离心，4℃ 25000 rpm，2h。

8.弃上清，加10ml TEN重悬沉淀，反复吹打后转移至一新的50ml离心管中。

9.加入SDS，使其终浓度为0.5%，作用5min，使病毒粒子裂解。

为防止基因组断裂，以下步骤均用断枪头
10.分别用酚（10ml）和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），氯仿（10ml）抽提一次，每次轻轻上下颠倒混匀4℃ 10000 rpm，10min。

11.吸上清，加入2倍无水乙醇沉淀，-20℃2h以上
12. 4℃ 10000 rpm，15min弃上清，75%乙醇洗涤，37 ℃烘干。

13.200ul TE或双蒸水溶解沉淀（断枪头轻轻吹打），入50×Rnase，37 ℃作用2h。