兔抗人多发性骨髓瘤细胞多克隆抗体的制备与鉴定

兔抗人多发性骨髓瘤细胞多克隆抗体的制备与鉴定
母波;赵春艳;梁素华;章欢;申跃武;陈保峰;杨俊宝
【摘要】To prepare polyclonal antibody of rabbit anti-human multiple myeloma. Method:The New Zealand white rabbits were immunized with human multiple myeloma ARH-77 cell line at the back skin intradermal injection for the first time, he primary inoculation was with Freund's complete adju- vant (Sigma) ,follow by three boosts with Freund's incomplete adjuvant (Sigma) on the 14,28 and 38day. The serum was extracted after 4 ℃ settlement overnight. Polyclonal antibodies were isolated using affinity chromatography system. Purified polyclonal antibodies was analyzed by ELISA, Westem blot and Immunofluorescence stain. Results:polyclonal antibody titer was up to 1 : 20 000 by ELISA. Western blot showed that the antibody had a high specificity. Immunofluorescence stain showed Poly- clonal antibodies could specificitily binding with ARH-77 cell surface proteins. Conclusion:We pro- duced polyclonal antibodies of rabbit anti-human multiple myeloma and it have high titer and speci- ficity, to providing a new method for diagnosis and therapy of multiple myeloma.%制备人多发性骨髓瘤全细胞兔多克隆抗体。

用人多发性骨髓瘤细胞系ARH-77全细胞和福氏完全佐剂通过背部皮内多点注射
首次免疫新西兰大白兔,第14 d用ARH-77全细胞和福氏不完全佐剂同样剂量加
强免疫,第28 d和38 d时再次免疫。

第45 d颈动脉采血80 mL,4℃静置过夜,收
集血清。

然后采用亲和层析系统纯化血清中的多克隆抗体。

用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测纯化多克隆抗体的效价;免疫印迹法和荧光免疫细胞化学检测纯化多
克隆抗体的特异性。

结果：ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶20 000,免疫印迹检测结果显示该抗体具有较高特异性,荧光免疫细胞化学检测多克隆抗体能够有效的结合细胞表面抗原。

实验获得了高效价的特异性的兔抗人骨髓瘤细胞多克隆抗体,为进一步研究多发性骨髓瘤诊断和治疗奠定了基础。

【期刊名称】《江西科学》
【年(卷),期】2012(030)005
【总页数】4页(P590-593)
【关键词】多克隆抗体;多发性骨髓瘤;制备
【作者】母波;赵春艳;梁素华;章欢;申跃武;陈保峰;杨俊宝
【作者单位】川北医学院生物学教研室,四川南充637000;川北医学院生化教研室,四川南充637000;川北医学院生物学教研室,四川南充637000;川北医学院生物学教研室,四川南充637000;川北医学院生物学教研室,四川南充637000;川北医学院生物学教研室,四川南充637000;川北医学院生物学教研室,四川南充637000【正文语种】中文
【中图分类】R733.3
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，简称MM)是骨髓内浆细胞异常增生的一种恶性肿瘤。

虽然常规的放化疗，干细胞移植等方案使患者的缓解率和无病生存期明显提高，但最终难免复发［1］。

近年来，肿瘤分子免疫学的快速发展为其治疗开辟了新途径，尤其是以靶向肿瘤特异性抗原的单克隆抗体治疗已显示出重要作用［2］。

比较具有前景的包括 Rituximab［3］，alemtuzumab［4］，atlizumab［5］和 atlezumab［6］。

但是，因为多发性骨髓瘤表达多种细胞表
面抗原CD38，CD45，CD138细胞粘附分子 VLA4［7］而呈现出高度异质性。

另外，不同病人之间的差异性，例如，CD20分子仅仅在13% ～22%患者表达［8］，以及多发性骨髓瘤内在遗传原因，呈现的药物耐受机制，使单克隆抗体治疗多发性骨髓瘤取得的效果有限。

因此，同时靶向多个抗原的多克隆抗体用于治疗多发性骨髓瘤也许是值得尝试的方式。

为此，本研究利用人多发性骨髓瘤全细胞免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。

经ELISA检测，Western blot分析和免疫荧光检测证实所制备的多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性，为多克隆抗体的研制及其在多发性骨髓治疗的研究奠定了基础。

人多发性骨髓瘤细胞系ARH-77购于ATCC，本实验室保存。

福氏完全佐剂、福
氏不完全佐剂和ELISA生色底物(购自 Sigma公司)，普通蛋白分子量标准和彩色
预染蛋白分子量标准(购自BMA公司)，十二烷基硫酸钠(SDS)(购自Sigma公司)，二抗(FITC标记羊抗兔IgG)购于北京中山金桥生物技术公司，Hochest55322(购
自Sigma公司)，Mabselect填料(购自 GE公司)。

其它试剂均为国产分析纯。

将2只雌性新西兰大白兔(购自四川大学华西实验动物中心)先适应性喂养1周。

每只动物免疫前先于一侧耳缘抽取2 mL静脉血，4℃静置过夜，取血清作阴性对照。

初次免疫用弗氏完全佐剂加ARH-77细胞(1×107－5×107)背部皮下注射免疫动物，每只新西兰大白兔注射2～3点，每点注射200 μL;第 14 d用弗氏不完全佐
剂加ARH-77细胞，同样剂量免疫新西兰大白兔加强免疫;第28 d和第38 d时再次加强免疫;第45 d颈动脉采血80 mL，4℃静置过夜，取血清。

多克隆抗体的纯化用亲和层析系统纯化(AKTA explore，GEUSA)，将含骨髓瘤细
胞多克隆抗体的血清上样于用10倍柱体积的BufferA(20 mM NaH2PO4，0．15 M NaCl，pH 7．2 pH 9．0)平衡的XK16/40柱子，填料为Mabselect，再用5倍柱体积的BufferA洗柱子;用Buffer B(0．1 M sodium citrate，pH 3．0)线性梯度洗柱，直至有洗脱峰的出现;收集洗脱峰液体，同时用中和
Buffer(1M Tris-HCl，pH8．0)调节洗脱液 pH7．2 左右;将收集的洗脱液用透析
袋置于PBS缓冲液(pH7．2)在4℃下透析，将透析的收集液冻干即得骨髓瘤细胞
多克隆抗体。

对照多克隆抗体按照上述方法纯化未免疫新西兰大白兔血清中免疫球蛋白。

将ARH-77细胞5×103加到用多聚赖氨酸预先包被的96孔板，4℃孵育过夜;5%脱脂牛奶室温封闭1 h;加入经倍比稀释(1∶2 000，1∶5 000，1∶10 000和
1∶20 000)的多克隆抗体，37℃孵育2 h;含体积分数为 0．5%Tween20的
PBS(PBST)缓冲液洗3次;加入1∶1 000稀释交联有辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔
二抗，37℃孵育2 h;PBST缓冲液洗3次;加入显色底物，室温避光放置15 min;加入1 mol/L HCl终止反应;用酶标仪490 nm测定光密度值(Oplical density，OD)。

取适量ARH-77细胞全蛋白煮沸后经10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将凝胶置转移Buffer中平衡30 min，恒压100 V，1 h在冰上湿法电转印蛋白到PVDF
膜上，5%脱脂牛奶封闭30 min，加入多克隆抗体和对照免疫球蛋白(1∶2 000)室温振荡孵育2 h，PBST缓冲液洗3次，每次10 min，然后加入按1∶1 000稀释的交联有 HRP的羊抗兔二抗，室温振荡孵育3 h，用TPBS缓冲液洗3次，每次10 min，PBS缓冲液洗1次，最后加入化学发光试剂用X线片显影，定影。

1．5．1 兔抗人多发性骨髓瘤全细胞多克隆抗体的免疫荧光细胞流式检测取对数
生长期的
ARH-77细胞，PBS洗涤细胞3次，5%脱脂牛奶封闭30 min，加入多克隆抗体
和对照免疫球蛋白(1
∶2 000)，冰上1 h，PBST洗涤细胞3次，完全去处上清，加入FITC标记的羊抗兔二抗(1∶500)，冰上1 h。

PBST洗涤细胞3次，每次5 min，完全去处上清，
上流式检测(500 μL PBS重悬细胞)。

1．5．2 兔抗人多发性骨髓瘤全细胞多克隆抗体的免疫荧光显微镜检测取对数生
长期的ARH-
77细胞，PBS洗涤细胞3次，用4%多聚甲醛固定细胞5 min，然后将细胞悬液
涂抹在载玻片上。

PBST洗涤细胞3次，5%脱脂牛奶封闭30 min，加入多克隆抗体和对照免疫球蛋白(1∶2 000)，4℃孵育过夜。

PBST洗涤细胞3次，加入FITC标记的羊抗兔二抗(1∶500)，冰上1 h。

PBST洗涤细胞3次，每次5 min，用荧光显微镜观察。

为了证明通过亲和层析纯化后所得抗体具有活性，通过用细胞ELISA测定抗体的
效价。

结果如图1显示，随着稀释倍数的增加多克隆抗体的结合能力与对照IgG
相比，结合特异性更强，当多克隆抗体效价达到20 000时，与对照IgG相比结合能力高出近10倍，证明制备的多克隆抗体具有较高的特异性(图1)。

进一步，为了证明纯化的多克隆抗体能否与骨髓瘤细胞特异性结合，通过免疫印迹实验发现(图2)，制备的多克隆抗体能够与ARH-77骨髓瘤细胞全蛋白特异性结合，在相对分子量为100KD，60KD，30KD附近显出特异性条带，而对照IgG未显示出特异性结合条带。

为了检测多克隆抗体是否与表达于ARH-77细胞表面抗原相结合，用细胞免疫荧
光染色结合细胞流式和荧光显微镜观察分析。

结果如图3所示，与对照抗体相比，用多克隆抗体孵育ARH-77细胞，细胞流式检测发现，荧光强度明显的左移，证
明多克隆抗体能够特异性的与ARH-77细胞结合。

同时，运用荧光显微镜观察发现，多克隆抗体能够有效地识别细胞膜表面抗原(绿
色荧光)，而对照IgG则几乎不能与细胞膜表面结合(图4)。

多发性骨髓瘤是一种难以治愈的血液肿瘤，占临床血液肿瘤10%［9］。

传统的放化疗，干细胞移植治疗都难以治愈。

随着生物学技术的发展，以抗体为基础的免疫治疗已经取得了令人激动的成果，特别是以单克隆抗体治疗多发性骨髓瘤取得了显著的进展。

自从1997年美国FDA批准第一个用于抗肿瘤的单克隆抗体用于临床
以来［10］，目前已有多个具有前景的抗体用于临床和临床前的抗多发性骨髓瘤
的研究，比如SGN-40(antihuCD40 MoAb)［11］，anti-CD52(alemtuzumab)［4］，MRA(atlizumab)，TRM-1(Full Human TRAIL-R1 MoAb)，AHM(anti-HM1．24 MoAb)［5］和 anti-CD126(atlezumab)［6］。

然而，由于多发性骨髓瘤的异质性，几乎没有普遍存在的组成性表达肿瘤抗原。

而且，多发性骨髓瘤病人的差异性限制了单克隆抗体的疗效。

与单克隆抗体相比，多克隆抗体不仅制备过程具有简单、周期短、成本低的优点，而且由于多克隆抗体能够同时识别多个肿瘤相关抗原，从而触发多条不同的细胞死亡的信号通路，因此，理论上运用多克隆抗体治疗肿瘤将是一项很有前景的治疗策略。

研究利用人骨髓瘤全细胞作为免疫原制备多克隆抗体，因此制备的多克隆抗体有可能更大程度的识别肿瘤相关抗原。

通过Western blot检测发现，多克隆抗体在分子量约30 kd，50 kd，60 kd，90 kd 处呈现特异性结合条带，表明所制备的多克隆抗体具有较好的抗体活性，可识别作为免疫原的ARH-77细胞蛋白。

进一步，通过细胞免疫荧光研究发现，多克隆抗
体能够较好识别表达于细胞膜上的抗原，证明多克隆抗体具有较高的特异性。

因此兔抗人多发性骨髓瘤细胞多克隆抗体的成功制备，为下阶段的研究提供了重要的实验材料，特别是有可能对多发性骨髓瘤治疗和诊断提供了新的途径。

致谢：本论文实验研究均在四川大学生物治疗国家重点实验室完成，实验过程得到魏于全院士，杨金亮教授的悉心指导，在此表示衷心感谢!
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