水稻白叶枯病研究进展

条斑 气孔
＋ ＋ － ＋
65.0%
Xco-1-/Xcocola+
表1
水稻黄单胞两个致病变种的遗传和生理生化特征
(二)小种分化 小种分化是指病原菌在不同 品种特异性互作关系。自60年代起，日本、 菲律宾国际水稻所和我国相继对水稻白叶 枯病菌的小种分化进行了研究。由于对水 稻百度文库叶枯病菌在水稻品种上特异性互作的 标准还存在不同的看法，各国间对水稻白 叶枯病菌小种的致病性分化分别表示为小 种和致病型(表2，3，4)。
表2 品种群
日本水稻白叶枯病病菌5个小种与水稻品种的关系 小 Ⅰ S R R R R Ⅱ S S R R R 种 Ⅲ S S S R R Ⅳ S S S S S Ⅴ S R R S R
金南风群 黄玉群 兰太艾玛斯 早生爱国 爪哇群 表3 品种群 IR24 IR20 Cas209 IR1545-339 DV85
(二)病原细菌致病性分子遗传学基础 关于 Xoo致病性分子遗传学研究已取得很大进展， 工作主要集中在无毒基因、毒性基因和调 控基因三个方面。 1．无毒基因 无毒基因(avr)是指病原细菌 中与寄主抗病基因(R)互作导致抗病反应的 基因。从细菌中克隆鉴定致病相关基因有 三条可能途径：a 异源基因克隆法；b 功能 互补法；c 转座子标签法。
Ⅱ S R R R R
种 Ⅲ
S S R R R
Ⅳ S S S S R
Ⅴ S S R R S
Ⅵ S R S R R
Ⅶ S R S S R
根据Flr的基因对基因理论，植物病原细菌 的小种是根据其无毒性命名的，即根据它 所不能克服的抗病基因来命名一个小种。 因此，为了国际间研究资料的可比性，日 本和菲律宾学者推荐国际标准水稻抗白叶 枯病菌单基因鉴别系统(表5 )以鉴别水稻白 叶枯病菌小种的分布和鉴定新小种。
一关于病原 (一)种的命名 水稻白叶枯病是由日本学者首先发 现的，随着幼苗分类系统的变更，曾用不同的学 名表示：Pseudomonas oryzae Uyeda and Ishiyama, 1922; Bacterium oryzae(Uyeda and Ishiyama) Nak, 1928; Phytomonas oryzae(Uyeda and Ishiyama)Magrou 1937.1943年由Dowson命名 为Xanthomonas oryzae. 70年代由于植物病原细 菌“大种化”趋势的影响，水稻白叶枯病菌被归 入野油菜黄单胞(X.campestris)中作为水稻致病变 种(X.c.pv.oryzae)。
(2)水稻白叶枯病菌的dsp基因 dsp基因突变体只 丧失对寄主植物水稻的致病性，但仍保留在烟草 上激发过敏反应的能力。本实验室以转座子诱变 和化学诱变方法均能从Xoo中获得dsp基因突变体。 以转座子诱变所获得的dsp基因突变体和化学诱变 突变体的生化表型有一定差异。我们曾以转座子 诱导突变体构建dsp基因探针，从JXOIII文库克隆 中鉴定出一个阳性克隆 pxo3113,该克隆能互补 Xoo JXOIII的dsp基因突变体的致病表型。在水稻 条斑病菌中所获得的一个dsp基因突变体，已证明 与EPS的生物合成有关，并从条斑病菌的基因文 库中筛选到能互补EPS产生和恢复突变体致病性 的阳性克隆。
因此认为 hrpXo和hrpXc具有同样的功能， 并在8个其它的致病变种中都保守的。对 hrpXo的序列分析表明1.452Kb的开放阅读 框架编码一个52.3Kb的蛋白。该蛋白中含 有一个共同结构域与寄主防卫反应和监察 系统识别有关
本实验室以转座子诱变获得Xoo菌株JXOIII 的hrp基因突变体，基因文库互补后获得 30Kb的粘粒克隆。亚克隆和转座子插入分 析表明其中9.2kb的pstI片段是 JXOIII(Xoo)hrp基因的功能片段。经过标记 交换所获得的缺失突变体丧失了在非寄主植 物烟草上激发过敏反应的能力，但在水稻上 仍具有一定诱导水稻防卫反应的功能, hrp基 因的功能除上述特征外，还有编码泌出通道 的功能，从而调节avr基因和dsp基因的表达。
水稻白叶枯病研究进展
白叶枯病是水稻上的重要病害，在全球五大洲 中，除欧洲外均有报道。环亚洲太平洋各国发生 较为频繁，其中亚洲，特别是南亚和东南亚各国 发生较高。在我国除新疆外，其它各省市都有报 道。尽管由于抗病品种的应用，水稻白叶枯病已 得到一定程度的控制，但每年尚有近1亿亩发病 面积，其中防治面积仍达3000万亩，所以该病在 我国仍是不容忽视的问题。 由于问题的重要性，世界各国，特别是亚洲国家 都特别重视对该病的研究。美国、日本、菲律宾 、印度和我国植物病理学家都对水稻白叶枯病的 研究做出重要贡献。
Toyonishiki IR24 IR-BB1 IR-BB2 IR-BB3 IR-BB4 IR-BB5 IR-BB7 IR-BB8 IR-BB10 IR-BB11 IR-BB21 BJ1 Taichung Native1 Asominori Optional differentials M41 XM XM6
症状 侵入途径 生化特征 丙酮产生 丙氨酸生长 0.001硝酸铜 无维生素的酪蛋白氨基酸 DNA－ｒRNA杂交 细胞蛋白SDS－PAGE电泳 DNA－RNA杂交 G＋C% RFLP分析不配带 两pv间 pv.oryzae之间 pv.oryzicola之间 脂肪酸分析 血清学分析（单抗）
叶枯 水孔
－ － ＋ － 均属于Deley Rrna二组 带型相似但有差别 致病变种间80%同源性 64.6% 84－93% 8－36% 8－69% 相似而有变异 Xco-1+/Xcocola-
水解酶类 .水稻白叶枯病菌除不产生淀粉酶 外，纤维素酶、蔗糖酶、木聚糖酶、磷酸 脂酶、卵磷脂酶和蛋白酶均能产生。这些 酶在病叶组织中的活性均高于健叶组织。 通过对用Tn5诱变的无毒菌株的生化行为的 研究，我们发现所有无毒突变体除淀粉酶 活性有质的变化(阴性变为阳性外)，蛋白 酶活性增强，EPS产量增加，大多数突变体 的果胶酶活性是从无到有，纤维素酶活性 基本不变，大多数突变体的脂酶活性有所 降低。这一研究结果表明Xoo的胞壁水解酶 和胞外多糖与其致病性并没有严格的相关 性。
我们用转座子标签法，首先获得日本系统 小 种 V 的 无 毒 基 因 突 变 体 XooM5203。 以 pUC19为载体构建了含Tn5插入位点旁侧序 列的无毒基因探针，从JXOV文库中钩到13 个含无毒基因的阳性克隆。亚克隆后以3Kb avrXa4功能片段测序表明，其中只有一个 完整的复制酶基因序列。复制酶在TMV中 已被认为是与N基因产物互作的无毒基因产 物。在植物病原细菌中还首次发现复制酶 的作用，但对其在不亲和互作中的功能尚 待进一步研究。
美国堪萨斯大学J.Leach以异源基因克隆法 用辣椒斑点病菌(X.c.pv.vesictoria)的无毒基 因avrBs3从菲律宾小种2的基因文库中克隆 鉴定出二个无毒基因avrXa7和avrXa10。 avrBs3是一个非常有趣的基因，研究中发 现黄单胞细菌的中的许多无毒基因avr和致 病基因pth都与其有同源性，因而组成黄单 胞细菌的avr/pth同源家族。在该家族中的 avr/pth基因均含有类似的结构即：a 具有一 个3Kb以上的同源片段；
一种细菌存在两类无毒基因的现象在其它病原细 菌中也有发现，如X.c.pv.vesictoria的无毒基因至 少分为两类属于或不属于avr/pth基因家族。多数 在染色体上，也存在质粒上。 2.毒性基因 植物病原细菌的毒性基因主要有hrp 基因和dsp基因两类，hrp基因是一类控制在非寄 主植物上诱导过敏反应和在寄主植物上决定致病 的基因即hypersensitive reaction and pathogenicity gene。Dsp基因只与致病性有关即disease specific gene。一旦dsp基因的编码产物明确后，这些dsp 基因就可以明确指出是胞外酶基因或胞外多糖基 因。
1990年比利时细菌分类学家Swings与菲律 宾国际水稻所的学者合作，根据295个表型 改善的数值分析，脂肪酸图谱的分析以及 基因型和DNA结合水平的研究认为水稻白 叶枯病菌和其它7种黄单胞不同并重新订为 独立的种。其中水稻黄单胞(X.oryzae)包括 两个致病变种即水稻白叶枯黄单胞致病变 种 ( pv.oryzicola) 和 水 稻 条 斑 致 病 变 种 (pv.oryzicola)。这两种致病变种在遗传和生 理系列化特性方面是近似的。(表1)
(1)水稻白叶枯病菌的hrp基因 现有的水稻 白叶枯病菌的hrp基因主要是根据异源基因 同源性的原理用青枯假单胞的hrp基因为探 针从水稻白叶枯病菌中鉴定出来的。美国 加州大学Kado(1993)以甘兰黑腐黄单胞 (X.c.pv.campesr=tris)hrp基因(hrpXc)为探针 从Xoo中获得同源片段，并证明其具有hrp 基因功能。水稻白叶枯病菌的hrpXo同样也 能互补甘兰黑腐黄单胞两个致病变种 (pv.campestris)和(pv.armoraciae)无毒突变体 在寄主植物上的致病性和在非寄主植物上 的过敏反应能力。
b 具有几乎一样的5’和3’端；c 所有成员 的中心部位都有一段102bp的DNA重复序列； d 该基因家族的预测蛋白质产物中具有特殊 的 核 位 信 号 序 列 ( Nuclear localization sequences, NLSs)。NLSs是细胞中亲核蛋白 的特殊组分，在亲核蛋白向核运输中起定 向和定位作用。水稻白叶枯病菌的无毒基 因avrXa7 含17.5个重复单位, avrXa10含15 个重复单位。
国内高必达等人的研究表明Xoo的EPS还能 在棉花、辣椒等非寄主植物上引起专化特异 性致萎作用。洗去EPS的致病菌可以减慢病 斑扩展速度。在本实验室对水稻白叶枯病菌 转座子诱变的研究，发现无毒突变体的EPS 合成增加，因此，EPS在致病中的作用尚需 进一步探讨。
国内邵敏等（1997）的研究发现细菌的培养 滤液和提纯的毒素对抗感水稻品种的作用不 同。细菌的培养滤液只对感病品种有致病作 用，而纯化毒素则对抗感品种都能造成为害， 这说明可能在培养滤液中还含有决定品种特 异性的物质－激发子。根据Tn5诱导的无毒 突变体的产毒素能力分析，突变体的单位细 胞产毒素能力只有野生菌株的1/4，而且薄层 层析结果的研究表明无毒菌株和野生菌株的 有机酸组分也有差异。
表5
日本与菲律宾国际水稻研究所推荐用以监测水稻 白叶枯病菌小种分布及新基因鉴定的国际鉴别品种
品 系 抗 性 基 因 Xa-18 Xa-16 Xa-1, Xa-2 Xa-2 Xa-3 Xa-4 Xa-5 Xa-7 Xa-8 Xa-10 Xa-11 Xa-21 Xa-5, Xa-13 Xa-14 Xa-17 Xa-15 Xa-19 Xa-20
二、水稻白叶枯病菌的致病性 (一)病原细菌致病的生理生化基础 根据国外 的研究与水稻白叶枯病菌致病有关的生化因 子有胞外多糖(EPS)，有机酸毒素和水解酶类 等。
根据日本学者的研究，EPS在致病中的作用 主要是由于木质部导管被阻塞的结果。用苯 酚品红染色可以观察到染料在叶片组织中运 输受阻。水稻切苗插于EPS水溶液中2 小时 后叶片即出现萎蔫，其萎蔫速度与EPS的浓 度有关。气相色谱分析仪表明Xoo的EPS由 葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖醛酸 内脂和阿拉伯糖醇组成。致病力强和弱的菌 株，其各种单糖的比例有差异。致病力强的 菌株EPS的分子量高于致病力弱的菌株。
菲律宾水稻白叶枯病病菌6个小种与水稻品种的关系 小 Ⅰ S R R R R Ⅱ S S R R R 种 Ⅲ S S S R R Ⅳ S MR S S S Ⅴ S R R S R Ⅵ S S S S MS
表4
小 品种群 Ⅰ
金刚30 Tetep 南梗15 Java14 IR26 R R R R R
中国水稻白叶枯病菌的菌群
与Xoo致病有关的有机酸类毒素已鉴定出7 种，它们是3-甲硫基丙烯酸、反式-甲硫基丙 酸、苯乙酸、异戊酸、α -甲基巴豆酸、琥 珀酸和延胡索酸，其中以反式-3-甲硫基丙烯 酸和苯乙酸毒性最强，3-甲硫基丙酸次之， 异戊酸和α -甲基巴豆酸的致萎作用与3-甲硫 基丙酸相当，但导致坏死的能力很弱，琥珀 酸和延胡索酸与诱导坏死有关，但致萎作用 很弱。