病毒保存液和细胞保存液的区别

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新冠病毒是如何用病毒保存液进行过程保存的

病毒保存液在核酸标本保存过程中起到了什么作用？核酸检测假阳性、假阴性的问题一直是专家们的心头病，而核酸标本的采集和保存成为影响检测结果的重中之重，很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本2019-nCoV核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本，为了提高检测阳性率，建议采集同一病人多部位标本，合并进行检测，下面我们来看看标本在采集、运输、保存过程中应该注意哪些问题。

口、咽拭子采集注意事项1.不要从鼻孔或扁桃体上采样2.不建议雾化导痰3. 下呼吸道标本（相对于上呼吸道标本）更可能呈阳性4.对于怀疑患感染新型冠状病毒的患者，特别是肺炎或严重疾病的患者，单个上呼吸道标本不能排除诊断，建议增加上呼吸道和下呼吸道标本。

病毒保存液标本采集方法：用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子，采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本。

如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后导致检测结果阴性。

标本运输及保存条件:2019-nCoV为RNA病毒，很容易被外源性或细胞破坏后所释放的RNA酶降解，而影响最后的检测效率。

严格来讲标本采集后应及时送到实验室（疾控中心、医院检验科、第三方实验室），尽快完成检测。

标本在常温条件下放置时间过长，也可能是造成最后检测结果假阴性的原因，如果因为特殊需要需要长时间保存的话，可以用病毒保存液来保存RNA病毒样本，此外还可以使用防止病毒核酸降解的标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果也需要进一步评价。

总的来说，标本采集后应及时送检，及时检测，如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将采样后的拭子放入病毒保存液中,病毒保存液是病毒采样管内添加的用于保护病毒样本的保护性液体！。

细胞培养的四个步骤

细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。

在显微镜下不同的细胞有不同的形态。

利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。

培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。

生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。

不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。

完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。

由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。

②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。

血清的分类最常用的是胎牛血清。

胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。

③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。

病毒保存液和细胞保存液的区别

病毒保存液和细胞保存液的区别一、病毒保存液病毒保存液适用于新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒等常见病毒样本采集保存运输工作，是采样管内浸末采样拭子病毒样本一种保护病毒的被检测物质的液体，可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本,储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。

通常分为两种，一种是非灭活型，能够保护病毒的蛋白和核酸，另一种是灭活型，通常含有灭活病毒的裂解盐，裂解蛋白而保护核酸。

1、灭活型：添加有裂解盐的病毒保存液就是灭活型的病毒保存液，里面含有的Tris、裂解盐、EDTA等主要目的是裂解核酸而释放出核酸，从而通过后续的实时荧光RT-PCR进行核酸检测，以此判断样本是否含有病毒特征核酸，即是否感染病毒。

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是生命的最基本物质之一。

病毒结构单一，就只含有一种核酸和蛋白质，因此检测出特征核酸就检测除了病毒。

病毒属于寄生生物，采样后体外无法存活，如果不能及时检测，就需要放入病毒保存液中。

为了保护病毒检测环境的安全性，就需要加入裂解盐来灭活病毒，释放出可以被检测的核酸即可。

2、非灭活型：除了灭活型的病毒保存液，德晟研发生产的还有非灭活型病毒保存液，不含裂解盐，但是保存的病毒完整性更好，检出率更高，除了核酸检测外还可以用于其他研究。

灭活型病毒保存液则使用上更安全，操作环境要求也不用那么严格，各有各的优势，目前研究的非灭活病毒保存液的成分主要为Hank's液基础，在Hank's液基础之上，德晟还添加了诸如庆大霉素、真菌抗生素、BSA（牛血清白蛋白第五组分）、生物缓冲剂HEPES、氨基酸、冷冻保护剂、甘油等多种组分：3、病毒样本采集方法：a .鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。

取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。

上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

病毒学检验

病毒的特点是：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。

2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染细胞培养技术：是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术二、单层细胞培养：用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞（二倍体细胞株和传代细胞系）三、鸡胚的接种途径：1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种四、间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有：空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。

50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。

LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量五、病毒纯化的一般原则：1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩六、病毒的保存：1、用低温（-60~25℃）、超低温（-70以下）冰箱或液氮罐（-196~150）保存2、冷冻干燥保存七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验中和试验：是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。

医院核酸检测实验室(PCR)消毒规范

PCR 实验污染来源PCR 实验室空气流向管理与环境消毒PCR 实验，即临床基因扩增实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。

它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。

就新冠病毒核酸检测来说， RT-PCR 是目前使用最广泛和较准确的筛选和确认方法，大规模核酸检测，必然会引起相关机构单位着力建设规范的临床 PCR 实验室。

但是，建立一个 PCR 实验室，其实就是在建设一个平台，考验的不仅仅是一个医疗机构的实验能力，也考验着整个医疗机构的整体能力。

实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是环绕同一个核心问题进行——“避免污染”，任何级别的医院在建设 PCR 实验室时，均需要提前考量各个因素，以保证标本的全环节质量及实验室的生物安全。

PCR 实验室的建设需要设置标准的“四区”：试剂准备区、标本制备区、 PCR 扩增检测区和扩增产物检测区。

每一个独立实验区设置有缓冲区，各区通过气压调节，使整个 PCR 实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染，并降低扩增产物对人员和环境的污染。

PCR 实验室，需要经过从基础理论、实验原理、规范操作、质量保证到注意事项等规范的培训，并获取 PCR 上岗证。

的震荡、离心都有可能产生气溶胶，有感染的风险。

4、防护要求。

必须按照生物安全三级实验室的个人防护要求进行。

PCR 实验污染来源1、样本间交叉污染：采集样本的容器被污染或者样本密封不严导致外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或者未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或者样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。

2、实验试剂污染：主要是在 PCR 组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或者阳性对照污染。

加样过程中，因为 PCR 试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得 PCR 试剂和PCR 板/管处于 02，但这个过程也充满污染风险。

病毒保存液和细胞保存液的区别

通常分为两种，一种是非灭活型，能够保护病毒的蛋白和核酸，另一种是灭活型，通常含有灭活病毒的裂解盐，裂解蛋白而保护核酸。

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是生命的最基本物质之一。

病毒结构单一，就只含有一种核酸和蛋白质，因此检测出特征核酸就检测除了病毒。

病毒属于寄生生物，采样后体外无法存活，如果不能及时检测，就需要放入病毒保存液中。

为了保护病毒检测环境的安全性，就需要加入裂解盐来灭活病毒，释放出可以被检测的核酸即可。

2、非灭活型：除了灭活型的病毒保存液，此外还有非灭活型病毒保存液，不含裂解盐，但是保存的病毒完整性更好，检出率更高，除了核酸检测外还可以用于其他研究。

灭活型病毒保存液则使用上更安全，操作环境要求也不用那么严格，各有各的优势，目前研究的非灭活病毒保存液的成分主要为Hank's液基础，在Hank's液基础之上，还添加了诸如庆大霉素、真菌抗生素、BSA（牛血清白蛋白第五组分）、生物缓冲剂HEPES、氨基酸、冷冻保护剂、甘油等多种组分：3、病毒样本采集方法：a .鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。

取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法釆集另一侧鼻孔。

上述两根拭子浸入同一含3成釆样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

核糖核酸RNA保存液的应用介绍

核糖核酸RNA保存液的应用介绍RNA保存液顾名思义，就是用于保护核糖核酸RNA延长其在细胞外的保存时间的溶液，对于不同的样本，不同的实验目的，RNA保存液的成分也会有差异，通常用于动物组织细胞的就不适用于植物细胞，本文这里主要指针对病毒的RNA保存液。

病毒的RNA保存液主要是用于病毒核酸检测或者病毒基因组测序等实验研究，病毒也仅仅只遗传物质核酸为RNA的病毒。

此RNA保存液属于灭活型病毒保存液，将采样拭子样本浸没，由于保存液中添加的裂解盐会很快裂解病毒的膜蛋白使病毒迅速灭活，保存液中的RNA酶抑制剂可以抑制RNA酶活性，保证病毒核酸RNA在一段时间内不降解。

从而，此款RNA保存液既能快速灭活病毒消除其感染性，又能释放病毒核酸，保证后续能通过检测核酸判断样本是否被感染。

产品特点：
通常来说，样本能够保存常温1周，37℃1天，4℃至少保存1个月，组织4℃浸泡过夜后-20℃或-80℃可长期保存。

再没有采样之前，室温可稳定保存1年以上。

低温贮存可能会产生沉淀或晶体析出，用之前需37℃完全溶解沉淀。

注意事项：
1.此RNA保存液只适用于RNA病毒的样本，不适用核酸为DNA的病毒；
2.此RNA保存液不适用植物组织样本的RNA；
3.采样拭子采样后的样本必须完全浸没于采样管中的病毒保存液内，且完全密封。

由于此款RNA病毒保存液主要是用于RNA病毒的核酸PCR、核酸检测的，不建议自己配制，如果需要的量比较大，建议直接找德晟这样的生产厂家，而且除了灭活型病毒保存液，还有非灭活型病毒保存液。

微生物基础知识

微生物学基础知识微生物广泛地存在于自然界，与我们共同生活在这个世界上，影响着我们生产和生活的方方面面，微生物对于大多数人来说既熟悉又陌生。

说熟悉，那是因为在我们的周围,如土壤、空气，直至我们身体无不存在着大量的微生物，我们所患的各种疾病如肝炎、痢疾、伤寒、肺炎、脑膜炎等无不与它们有关。

在制药行业，GMP对厂房的洁净度有着较为苛刻的要求：在100级洁净度下每立方米空气中的浮游菌不得多于5个，沉降菌不得多于1个；大容量注射剂必须做无菌检查，固体制剂必须做微生物限度检查。

不同的剂型不得检出相应的控制菌；在工艺用水中对细菌、霉菌、酵母菌也有要求。

这些控制指标所针对的对象都是微生物。

因此说，我们对它们是熟悉的。

说到不熟悉，那是因为我们大多数人对它们缺乏较深入的了解，如它们的外观形态、内部结构是什么样的？它们的生化特点有哪些？它们对整个生态系统有着怎么样的功与过？它们对我们制药行业会带来哪些有益或有害的影响，我们对它们应该怎样加以利用或防范？所有这些，对大多数人来说是不了解的。

因此说对它们是陌生的。

以下对微生物的一些基本知识作一简要介绍。

1、什么是微生物？微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。

它们都是一些个体微小，结构简单的低等生物，包括原核类的细菌（真细菌）、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次体；属于真核类的真菌（酵母菌、霉菌和蕈菌）、原生动物和微藻类以及属于非细胞类的病毒和亚病毒。

那什么是“原核类”和“真核类”呢？所谓原核，是指这类微生物的细胞中没有细胞核的结构，而且其它结构成份也比较简单；所谓真核，就是在它们细胞中有一明显的细胞核。

它们在繁殖的方式上也有所区别。

原核类微生物的繁殖靠细胞的一分为二、二分为四的分裂方式来实现，因此它们也被称为“裂殖菌；而真核微生物的繁殖方式比较复杂和多样，许多种类要通过不同细胞的交配，此外在细胞壁的结构上二者也有不同，有细胞壁的原核微生物其细胞壁的主要成份是一类含氨基酸的多糖，称肽聚糖；有细胞壁的真核生物其细胞壁中含有的主要成分是纤维素（例如高等植物细胞）或甲壳质（如霉菌）。

病毒检验基本技术——病毒的培养条件

病毒检验基本技术——病毒的培养条件[大] [中] [小]病毒检验基本技术——病毒的培养条件实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞都可以作为人工增殖病毒的基本工具。

而大量病毒的培养，又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。

1．组织培养病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过对“指示病毒”的干扰等方法加以识别。

组织培养用的玻璃器皿要求比较严格，要用硫酸和重酪酸钾溶液浸泡后再清洗应用。

常用于组织培养的人工综合营养液的主要成分有氨基酸、糖类、无机盐、维生素和辅助生长因子等，常用的人工综合营养液为MEM和RPMI1640。

用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和谷氨酰胺溶液，还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，加人碳酸氢钠溶液修正pH，根据情况还可加入HEPES 溶液可使生长液具有较强的pH缓冲能力。

能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可称之为Versen溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。

动物血清中具有细胞生长所必需的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，且有很强的酸碱缓冲能力。

细胞培养液在细胞培养过程中可分为细胞生长液和细胞维持液两种。

生长液是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；维持液用于延缓细胞代谢，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。

这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。

细胞生长适宜的pH范围是pH7.2～7.6。

细胞培养技术全过程的关键是防止污染。

2．细胞株的保存细胞株的保存是组织培养中一个十分重要的工作，二甲基亚砜是细胞低温保存的良好的保护剂，含10％二甲基亚砜的血清可以作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞。

病毒学上常用的细胞类型可分为原代细胞、二倍体细胞和传代细胞三大类，原代细胞培养和传代细胞培养的根本区别在于细胞是否能在体外无限传代。

非灭活型保存液工作原理

非灭活型保存液工作原理
非灭活型保存液是一种用于保存活性物质的液体，其工作原理主要包括以下几个方面：
1. 抗菌作用：非灭活型保存液中通常含有抗菌剂，如抗生素、抗菌肽等，可以抑制或杀灭细菌、真菌和其他微生物的生长，从而防止微生物污染。

2. 缓冲作用：保存液中的缓冲剂能够稳定液体的pH值，防止
变化过大，从而保护活性物质的稳定性。

3. 渗透压调节作用：非灭活型保存液中含有渗透剂，如甘油、蔗糖等，可以调节液体的渗透浓度，防止细胞膜破裂和组织细胞的流失。

4. 抗氧化作用：保存液中通常添加有抗氧化剂，如维生素C、
E等，可以减少氧气对活性物质的氧化破坏，延长其保存时间。

5. 低温保存：非灭活型保存液常在低温条件下保存，这有助于降低酶活性、代谢反应的速率，从而延缓活性物质的降解过程。

通过以上多种作用的综合发挥，非灭活型保存液能够保持活性物质的稳定性和活性，在一定条件下延长其储存寿命。

TCID50和PFU的换算公式

1、PFU:plaque forming unit，空斑形成单位：感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。

由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。

因此建议也可使用TCID50法。

2、MOI :multiplicity of infection，感染复数：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。

其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。

噬菌体的数量单位为pfu。

一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。

后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。

然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。

能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。

传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。

其公式为：P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。

其中：P 为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：P(0) = 1% = 0.01m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。

(一)原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。

经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。

从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。

但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。

对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。

采样管内病毒保存液介绍

采样管内病毒保存液介绍病毒采样拭子是常用的病毒采样方法与PCR相结合可以用于快速病毒性疾病的检测。

但是，并不是每个样品采集处都能进行PCR检测，因此需要对采集到的病毒拭子样品进行运输，于是拭子病毒保存液应运而生。

病毒由一种核酸分子与蛋白质构成或仅由蛋白质构成，个体微小、结构简单，常见的流行传染病通常是RNA病毒，如流感病毒、艾滋病毒、甲流病毒。

由于没有细胞结构，病毒自身不能复制，而是将基因侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统复制新的病毒。

病毒样本采集后，为了维持病毒样本的活性、延长样本中病毒存活时间，会将采样拭子放入保存液中保存、运输。

病毒保存液（灭活型）采用高浓度的胍盐可以快速对呼吸道病原体进行灭活、保存，使样品失去感染性。

已灭活的样品可配套使用多种病毒DNA/RNA提取试剂盒，M32/M96核酸提取仪快速提取核酸，同时配合呼吸道病原体PCR检测试剂盒实现快速检测，特异性灵敏度均不受影响。

病毒保存液具有许多功能：1.操作简单无需配液,体系内含有高效病毒裂解液,采样后即刻灭活病毒,有效防止二次感染风险。

2.内含核酸Rnase酶抑制剂,更大化程度保护病毒核酸稳定不被降解,大幅提高核酸提取效率。

3.产品采样前可常温保存12个月,采样后样本可常温保存一周,密闭性好,方便保存运输,节省运输成本。

除以上灭活型的病毒保存液外，还有非灭活的病毒保存液，含有Hanks液基础,庆大霉素,真菌抗生素,BSA(V),冷冻保护剂、生物缓冲剂及氨基酸等。

多种抗生素联合，具有抗细菌和抗真菌的作用；牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质稳定剂，可在病毒的蛋白质外壳形成一种保护膜，使其不易分解，保证病毒的完整性；Hanks缓冲液构建的中性环境，有助于增加病毒的生存时间和感染稳定性。

非灭活的病毒保存液通常用于临床流感、禽流感(如H7N9)、手足口病、麻疹等病毒标本及支原体、脲原体、衣原体等标本的采集及运送。

德晟科技自2005年以来一直致力于样品采集与体外诊断方面的研究与相关原料的生产销售，采血管添加剂、病毒保存液、生物缓冲剂等产品在国内外都广受好评！。

病毒检验基本技术

第五章病毒检验基本技术一、标本的采集、处理与运送一、标本采集：采集时间为病程初期或急性期；二、标本的处理：应进行预处理三、标本的运送：1、病毒抵抗力弱，室温会很快灭活，应立即送实验室2、不能立即检测，放入冻存液并加甘油或二甲亚砜（DMSO），并防止反复冻融二、病毒的培养条件培养工具：实验动物、鸡胚、体外培养的器官和细胞一、组织培养病毒在细胞内的增殖及对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象及对细胞的作用及通过对“指示病毒”的感染等法加以判断。

1、培养的玻璃器皿的要求：用硫酸和重铬酸钾溶液浸泡清洗后使用2、组织培养的营养液：成分：氨基酸、糖类、无机盐、维生素、辅助因子等常用的人工综合营养液：MEM、RPMI1640。

如用人工综合营养液配制细胞生长液要加如下物质：①、血清（适量）、谷氨酰胺溶液：动物血清含有细胞生长的各种营养因子，促进细胞贴壁和生长，具有很强的酸碱缓冲能力②、规定量的抗生素：防止细菌污染③、NaHCO3修正PH④、HEPES溶液（根据情况加入）:可使生长液具有较强的PH缓冲能力⑤、胰蛋白酶和EDTA溶液：使组织和成片细胞分散成单个细胞。

EDTA溶液又称为Versen溶液3、细胞培养液可分为细胞生长液（发育生长，营养丰厚）和细胞维持液（延缓代谢）生长液和维持液的区别：血清含量不同4、PH：7.2-7.65、全过程的技术关键：防止污染二、细胞株的保存含10%二甲亚砜的血清可作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞三、使用的细胞类型：原代细胞、二倍体细胞、传代细胞注：原代细胞核传代细胞的区别是是否能在体外无限传代四、细胞的纯化：细胞克隆技术三、病毒的常规实验室诊断一、病毒的分离与鉴定1、病毒增殖的判定2、细胞病变（CPE）:CPE的表现为细胞破坏、肿大、融合成合胞体、无明显变化等。

CPE常具有病毒种的特性，因此常作为病毒鉴定标准之一。

3、病毒蚀斑技术（空斑）：病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。

细胞保存液和使用该保存液的细胞保存方法[发明专利]

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1396951A [43]公开日2003年2月12日[21]申请号01804458.1[21]申请号01804458.1[22]申请日2001.11.28[30]优先权[32]2000.12.04 [33]JP [31]368290/2000[86]国际申请PCT/JP01/10389 2001.11.28[87]国际公布WO02/46368 JA 2002.06.13[85]进入国家阶段日期2002.08.02[71]申请人胡曼泰克有限公司地址日本茨城县[72]发明人马场宪三黑岩保幸关根晖彬[74]专利代理机构永新专利商标代理有限公司代理人林晓红[51]Int.CI 7C12N 1/04//(C12N1/04 C12R1:91)权利要求书 2 页说明书 9 页[54]发明名称细胞保存液和使用该保存液的细胞保存方法[57]摘要本发明涉及细胞保存液，在保存过程中既没有向其添加血清也没有添加培养基，但其仍表现出极好的保存性能。

不同于已用作含血清的细胞保存液中的添加剂的二甲基亚砜，上述细胞保存液含有白蛋白混合物，其作为主要试剂，任选地和辅助试剂如磷酸根离子、二价金属离子或单糖一起，包含于在保存生殖细胞中所采用的磷酸盐缓冲溶液中。

因此，不需要向保存液中添加血清或培养基，因而不存在保存期间细胞变性或被未知病毒污染的危险。

因此，本发明能够提供含有确定成分的，具有高稳定品质并表现出极好的细胞保存性能的细胞保存液，以及保存细胞的方法。

01804458.1权利要求书第1/2页 1.用于保存细胞的保存液，所述保存液包含精制白蛋白和二甲基亚砜。

2.如权利要求1所述的用于保存细胞的保存液，其中所述精制白蛋白来自牛。

3.如权利要求1或2所述的用于保存细胞的保存液，除了所述精制白蛋白和二甲基亚砜以外，所述保存液还含有糖。

4.如权利要求1-3之任一项所述的用于保存细胞的保存液，其中所述糖为单糖。

细胞保存液及其利用、以及细胞保存液的制造方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201680011350.5(22)申请日 2016.06.29(30)优先权数据2015-131552 2015.06.30 JP2016-037266 2016.02.29 JP(85)PCT国际申请进入国家阶段日2017.08.22(86)PCT国际申请的申请数据PCT/JP2016/069280 2016.06.29(87)PCT国际申请的公布数据WO2017/002861 JA 2017.01.05(71)申请人希森美康株式会社地址日本兵库县(72)发明人横山光士　冈智子　森田将且　山本由佳　(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 11038代理人郑天松(51)Int.Cl.C12N 1/04(2006.01)C12N 1/00(2006.01)C12N 11/16(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)G01N 33/48(2006.01)G01N 33/50(2006.01)C12N 5/071(2006.01)C12N 5/09(2006.01) (54)发明名称细胞保存液及其利用、以及细胞保存液的制造方法(57)摘要本发明涉及细胞保存液。

另外，本发明涉及使用细胞保存液的，细胞的保存方法、固定细胞的调制方法及细胞的分析方法。

再者，本发明涉及细胞保存液的制造方法。

权利要求书2页说明书23页附图18页CN 107250346 A 2017.10.13C N 107250346A1.细胞保存液，其在水性溶剂中含碳原子数1～6的低级醇和二价的金属离子，上述二价的金属离子的浓度是约6mmol/L以上约82mmol/L以下。

2.权利要求1所述的细胞保存液，其中二价的金属离子是第2族元素的金属离子。

3.权利要求1或2所述的细胞保存液，其中二价的金属离子是选自镁离子及钙离子的至少1种。

病毒保存液出现的红色对检测结果有影响吗

病毒保存液用酚红还是甲基红样本保存液或病毒保存液是病毒采样管里添加的用于采集病毒样本的溶液，有无色的灭活型保存液和有色的非灭活型保存液。

非灭活保存液之所以有颜色是因为其中含有有颜色的成分，那么它用的是用的酚红还是甲基红呢？
非灭活型病毒保存液与灭活型不同，它不需要对样本中的病毒进行灭活，相反它还有尽可能让病毒在采样管的保存液中存活时间增长，这样有利于保证病毒的完整性状，以便提高后续的核酸检测准确率或用于其它研究实验。

非灭活病毒保存液添加酚红
而病毒在采样管中是无法直接存活的，需寄生在细胞内，因此非灭活病毒保存液中含有Hank’s液基础，相当于细胞保存液的成分，可以延长病毒及其宿主细胞的存活时间。

保存液
显红色是因为Hank’s液基础中含有酚红，而并非是甲基红。

酚红在保存液中被作为pH值指示剂，在酸性时显黄色，中性时显红色，碱性时显紫色。

这一类与常见的指示剂类似，如无色酚酞碱性时变红，溴酚蓝（常做电泳指示染料）在pH 3.0~4.6范围颜色由黄变蓝。

酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），为避免固醇类反应，哺乳动物的细胞保存液中不添加酚红。

甲基红也是一种酸碱指示剂，pH变色范围4.4（红）～6.2（黄），但水溶性差，在乙醇中长时间保存灵敏度降低，一般用于原生动物活体染色。

而酚红显红色也可以指示病毒保存液pH接近7（中性）则比较适合。

酚红在非灭活病毒保存液中主要作用还是作为pH指示剂，并不是一个必须添加的成分，因此根据不同厂家需要。

病毒毒价的测定

1.病毒毒价的测定（微量法）(1) 病毒的制备将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPE）达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。

(2) 病毒毒价测定取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1，10-2，10-11……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。

把培养板置5%CO2温箱37℃培养，从48-14h逐日观察细胞病变，记录结果。

按Reed和Muench两氏法计算TCID50。

56%-50%距离比例 = ────────56%-33%本例高于50%病毒稀释度的对数为－6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为－1。

IgTCID50 = －6＋0.26×(－1)= －6.3则TCID50=10-6.3，50即病毒作10-6.3稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞管发生病变。

2.中和试验(1) 血清的处理动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。

为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。

各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。

加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。

(2) 稀释血清取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。