转录调控-研究生教学课件
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(1)生物信息学预测转录因子结合位点 (2)实验证实转录因子结合位点： EMSA/gel-shift, super shift ChIP DNase I footprinting
Mapper Jaspar
http://bio.chip.org/mapper/mapper-top http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl
2、启动子区域的确定
↓ 克隆5 ´-flanking sequence并连接到报告基因载体上 ↓ 缺失突变 ↓ 荧光素酶活性分析 ↓
确定转录调控区域（启动子区域）
生物信息学预测启动子区域
Deletion mutagenesis (缺失诱变)
Reporter vector
3、转录因子结合位点的确定
定点突变
增强子（enhancer）
基因组中能增强邻近基因启动转录的序列。最早 发现于SV40的基因上游，含2个72bp的正向重复 序列。 增强子特性 1.增强效应非常明显 10~200倍 。 2.与其位置、取向无关（上下游、距离） 3.核心序列是重复序列,是增强效应所必须 4.有细胞组织特异性， 需与特异蛋白因子作用 5.无基因特异性 6. 要有启动子才能发挥作用
CTCFBSDB: a CTCF binding site database for
characterization of vertebrate genomic insulators :
http://insulatordb.utmem.edu/
CTCF is the only protein identified so far in vertebrate that binds to insulators and shows enhancer-blocking activity
CTCF vs. BORIS
CTCF
BORIS
11个与DNA结合的锌指结构 域 与绝大多数的ICRs以及CpG 岛结合 结合是甲基化敏感的 具有绝缘子功能 具有边界元素的功能，例如 阻断异染色质的传播 保护相应区域不被甲基化 广泛表达，尤其在精母细胞 中表达量高 过表达抑制细胞的增殖 基因定位于16q22, 在癌症中 常发生突变或缺失
Igf2
H19
Two linked Imprinted Genes: Maternal [H19 (on), Igf2 (off)] Paternal [H19 (off), Igf2 (on)] 3.7
Effects of insulators on enhancer–promoter interactions
预测CpG岛常用软件：CpGPlot
（ http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot ）
/
FirstChoice RLM-RACE Kit (Ambion) GeneRacer RLM-RACE Kit (Invitrogen )
SMART RACE cDNA Amplification (Clontech)
Gel retardation(凝胶阻滞)/electrophoretic mobility shift assay (EMSA, 电泳迁移率变动分析)
ChIP （染色质免疫共沉淀）
4、反式元件与顺式元件的相互作用对转录 的影响
（1）定点突变→荧光素酶活性分析 （2）过表达转录因子→测定目的基因的表达 （3）干扰转录因子的表达→测定目的基因的表达 （4）转基因动物
Models for Enhancer Action
Bulger and Groudine. 2002. Nature Gen. 32:555-557
Characterization of an enhanHale Waihona Puke Baiduer?
– consists of several good binding sites of TFs – the sites are spatially clustered together – the pattern of sites is conserved
概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。 包括核心启动子和上游启动子元件 。
一个基因可同时拥有一个及以上启动子； 一般在转录起始点上游, 位于(+1)及5’端上游 100~200b左右，是决定转录起始点及转录频率的关键 元素。 ； 可与增强子共同控制转录起始和强度； 发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子 与启动子区各种调控元件相互作用。
Primer extension(引物延伸)
S1 nuclease mapping
RNA 5’
DNA 3’ RNA 5’ DNA 3’ 3’
* 5’
Add S1 nuclease
3’ 5’
PAGE Analysis
Primer extension and S1 nuclease digestion
Enhancer Element Locator
http://www.cs.helsinki.fi/u/palin/EEL/
Assays for Enhancers
1. 2. 3. 4. Transient transfection DNAase I hypersensitivity DNAase I footprinting/mutation analysis Transgenic mice
非编码序列
分为：启动子、增强子、沉默子、绝缘 子
反式作用因子trans-acting factor
概念：通过识别和结合顺式作用元件的核心序列, 而调控靶基因的转录效率的一类蛋白因子（转 录因子），对基因表达调控可正(激活)可负(阻 遏) 。
类别：基本转录因子、上游转录因子和可诱导 转录因子
启动子(Promoter)
Transient Transfection:
E
P P P
Luciferase
Luciferase
Luciferase
E
Insulator (绝缘子)
一种负调控元件，参与基因表达的负调控。 干扰增强子与启动子的相互作用，并抑 制启动子的激活活性。
Insulator function in Imprinting
真核生物基因转录调控研究 的进展和方法
周建林
一、真核生物基因表达调控的特点(略) 二、真核生物基因转录调控 三、真核生物基因转录调控的研究方法
转录水平的调控
顺式作用元件(cis-acting element) 反式作用因子(trans-acting factor)
顺式作用元件
是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其 活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上 的基因
推荐使用MatInspector 软件 （ http://www.genomatix.de）
Search for evolutionary conserved transcription factor binding sites.
rVista 2.0 (http://rvista.dcode.org/) ConSite (http://consite.genereg.net )
11个与DNA结合的锌指结构 域 结合位点与CTCF显著重叠 ？ ？ ？ 在癌症中被重新激活 通常仅在睾丸中表达 过表达促进细胞的增殖. 基因定位于20q13, 在癌症中 常发生扩增
Thank you!
1、转录起始位点（TSS）的确定
生物信息学预测TSS
↓
5´-RACE初步确定TSS的大概位置
↓
引物延伸、核酸酶保护或S1作图精确定位TSS
预测转录起始位点和启动子区域的常用软件
推荐使用Gene2Promoter 软件（ http://www.genomatix.de） 和TSSW、TSSG（http://www.softberry.com/berry.phtml）
1.核心启动子：RNA polⅡ转录起始所必须的最少的DNA序 列，作用是确定转录起始点并产生基础水平转录。
2.上游启动子元件 包括-70bp的CAAT盒,GC盒,其他距起始 转录点更远的上游元件。 与TFⅡD结合成复合物后提 高转录频率。
启动子的研究方法
研究内容：
1、 转录起始位点的确定
2、启动子区域（顺式作用元件）的确定 3、转录因子（反式作用元件）结合位点的确定 4、反式作用元件和顺式作用元件相互作用 对基因转录的影响
Mapper Jaspar
http://bio.chip.org/mapper/mapper-top http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl
2、启动子区域的确定
↓ 克隆5 ´-flanking sequence并连接到报告基因载体上 ↓ 缺失突变 ↓ 荧光素酶活性分析 ↓
确定转录调控区域（启动子区域）
生物信息学预测启动子区域
Deletion mutagenesis (缺失诱变)
Reporter vector
3、转录因子结合位点的确定
定点突变
增强子（enhancer）
基因组中能增强邻近基因启动转录的序列。最早 发现于SV40的基因上游，含2个72bp的正向重复 序列。 增强子特性 1.增强效应非常明显 10~200倍 。 2.与其位置、取向无关（上下游、距离） 3.核心序列是重复序列,是增强效应所必须 4.有细胞组织特异性， 需与特异蛋白因子作用 5.无基因特异性 6. 要有启动子才能发挥作用
CTCFBSDB: a CTCF binding site database for
characterization of vertebrate genomic insulators :
http://insulatordb.utmem.edu/
CTCF is the only protein identified so far in vertebrate that binds to insulators and shows enhancer-blocking activity
CTCF vs. BORIS
CTCF
BORIS
11个与DNA结合的锌指结构 域 与绝大多数的ICRs以及CpG 岛结合 结合是甲基化敏感的 具有绝缘子功能 具有边界元素的功能，例如 阻断异染色质的传播 保护相应区域不被甲基化 广泛表达，尤其在精母细胞 中表达量高 过表达抑制细胞的增殖 基因定位于16q22, 在癌症中 常发生突变或缺失
Igf2
H19
Two linked Imprinted Genes: Maternal [H19 (on), Igf2 (off)] Paternal [H19 (off), Igf2 (on)] 3.7
Effects of insulators on enhancer–promoter interactions
预测CpG岛常用软件：CpGPlot
（ http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot ）
/
FirstChoice RLM-RACE Kit (Ambion) GeneRacer RLM-RACE Kit (Invitrogen )
SMART RACE cDNA Amplification (Clontech)
Gel retardation(凝胶阻滞)/electrophoretic mobility shift assay (EMSA, 电泳迁移率变动分析)
ChIP （染色质免疫共沉淀）
4、反式元件与顺式元件的相互作用对转录 的影响
（1）定点突变→荧光素酶活性分析 （2）过表达转录因子→测定目的基因的表达 （3）干扰转录因子的表达→测定目的基因的表达 （4）转基因动物
Models for Enhancer Action
Bulger and Groudine. 2002. Nature Gen. 32:555-557
Characterization of an enhanHale Waihona Puke Baiduer?
– consists of several good binding sites of TFs – the sites are spatially clustered together – the pattern of sites is conserved
概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。 包括核心启动子和上游启动子元件 。
一个基因可同时拥有一个及以上启动子； 一般在转录起始点上游, 位于(+1)及5’端上游 100~200b左右，是决定转录起始点及转录频率的关键 元素。 ； 可与增强子共同控制转录起始和强度； 发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子 与启动子区各种调控元件相互作用。
Primer extension(引物延伸)
S1 nuclease mapping
RNA 5’
DNA 3’ RNA 5’ DNA 3’ 3’
* 5’
Add S1 nuclease
3’ 5’
PAGE Analysis
Primer extension and S1 nuclease digestion
Enhancer Element Locator
http://www.cs.helsinki.fi/u/palin/EEL/
Assays for Enhancers
1. 2. 3. 4. Transient transfection DNAase I hypersensitivity DNAase I footprinting/mutation analysis Transgenic mice
非编码序列
分为：启动子、增强子、沉默子、绝缘 子
反式作用因子trans-acting factor
概念：通过识别和结合顺式作用元件的核心序列, 而调控靶基因的转录效率的一类蛋白因子（转 录因子），对基因表达调控可正(激活)可负(阻 遏) 。
类别：基本转录因子、上游转录因子和可诱导 转录因子
启动子(Promoter)
Transient Transfection:
E
P P P
Luciferase
Luciferase
Luciferase
E
Insulator (绝缘子)
一种负调控元件，参与基因表达的负调控。 干扰增强子与启动子的相互作用，并抑 制启动子的激活活性。
Insulator function in Imprinting
真核生物基因转录调控研究 的进展和方法
周建林
一、真核生物基因表达调控的特点(略) 二、真核生物基因转录调控 三、真核生物基因转录调控的研究方法
转录水平的调控
顺式作用元件(cis-acting element) 反式作用因子(trans-acting factor)
顺式作用元件
是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其 活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上 的基因
推荐使用MatInspector 软件 （ http://www.genomatix.de）
Search for evolutionary conserved transcription factor binding sites.
rVista 2.0 (http://rvista.dcode.org/) ConSite (http://consite.genereg.net )
11个与DNA结合的锌指结构 域 结合位点与CTCF显著重叠 ？ ？ ？ 在癌症中被重新激活 通常仅在睾丸中表达 过表达促进细胞的增殖. 基因定位于20q13, 在癌症中 常发生扩增
Thank you!
1、转录起始位点（TSS）的确定
生物信息学预测TSS
↓
5´-RACE初步确定TSS的大概位置
↓
引物延伸、核酸酶保护或S1作图精确定位TSS
预测转录起始位点和启动子区域的常用软件
推荐使用Gene2Promoter 软件（ http://www.genomatix.de） 和TSSW、TSSG（http://www.softberry.com/berry.phtml）
1.核心启动子：RNA polⅡ转录起始所必须的最少的DNA序 列，作用是确定转录起始点并产生基础水平转录。
2.上游启动子元件 包括-70bp的CAAT盒,GC盒,其他距起始 转录点更远的上游元件。 与TFⅡD结合成复合物后提 高转录频率。
启动子的研究方法
研究内容：
1、 转录起始位点的确定
2、启动子区域（顺式作用元件）的确定 3、转录因子（反式作用元件）结合位点的确定 4、反式作用元件和顺式作用元件相互作用 对基因转录的影响